強化された骨形成のためのヒト脂肪由来間質細胞の単離および濃縮

要約

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

要約

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

概要

The heterogeneous nature of stem cell populations is not yet fully understood and remains a major impediment to the development of clinically effective stem cell-based therapeutic applications. One of the most common ways to characterize a heterogeneous population of stem cells is to employ a cell sorting method, such as fluorescence-activated cell sorting (FACS), to separate cells based on their surface marker expression profiles. As sorting methods become more complex, it becomes possible to identify more distinct functional subpopulations of cells. Microfluidic-based technologies are becoming more and more frequently utilized in analysis of gene expression at the single cell level. Multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) within a microfluidic chip allows for effective and reliable high-resolution, single cell transcriptional analysis.^1-5

In a previous study using single cell transcriptional profiling of 48 genes, considerable transcriptional heterogeneity was observed among ASCs.⁶ However, the distribution of genes MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 exhibited a strong association with a cluster of cells possessing highly osteogenic transcriptional profiles. To isolate cells according to this osteogenic gene expression profile, surface antigen expression patterns were correlated with transcription patterns and surface marker expression of endoglin (CD105) was subsequently discovered to closely correlate with enhanced osteogenic differentiation potential of ASCs. Independent of CD105 expression, expression of surface receptor Thy-1 (CD90), a glycosyl-phosphatidylinositol-linked membrane protein previously shown by Chen et al. to be associated with osteoprogenitor cells, was also correlated with osteogenic gene expression.^6,7 These findings provide the opportunity to prospectively isolate subpopulations within the larger heterogeneous pool of ASCs with increased osteogenic capacity for cell-based bone tissue engineering applications.

プロトコル

注：すべての患者の試料はインフォームドコンセントを得て、実験的なプロトコルは、スタンフォード大学の治験審査委員会（プロトコル＃2188と＃9999）によって審査され、承認された。

1.細胞の単離および培養：

1. 一般/局所麻酔下で腹部、脇腹、および/または大腿部領域の選択科目lipoaspirationを受けた健康女性患者からのヒト皮下脂肪組織を入手します。治験審査委員会（IRB）の承認は、人間の組織からのASCを単離するプロトコルのために得られていることを確認し、そのような材料での作業中に制度的安全上の注意に従ってください。
2. lipoaspirated脂肪組織からSVFを得るために、最初の1倍の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）等容量の脂肪吸引物を3回洗浄する。慎重に吸引し、底の水層を捨てる。
3. 私はハンクのコラゲナーゼ0.075％の種類：コラゲナーゼ消化緩衝液を準備平衡塩類溶液（HBSS）。 FACS緩衝液を準備します。PBS中の2％FBS、1％のP188と1％のペニシリン - ストレプトマイシンを。市販の0.22μmの細孔サイズ速い流れのポリエーテルスルホンフィルターを使用して両方のソリューションをフィルタリングします。
4. 洗浄した脂肪組織を消化するために、37°C​​（約180シェイク/分）で60分間、振盪水浴中でしっかりと消化槽をコラゲナーゼ消化緩衝液の等量を追加して配置する。
   注：これは、必要とされるよりも、これは（ すなわち 、コラゲナーゼ消化緩衝液の250ミリリットル、1リットルの滅菌フラスコ内の洗浄した脂肪組織の250ミリリットル）しながら中に最大の消化を可能にするので、より大きな容積消化容器を使用するのが最適です。
5. FACS緩衝液の等量を添加し、室温で5分間静置させることによって酵素活性を中和する。次に、4℃で20分間233×gで遠心。
6. 慎重に吸引し、高密度SVFペレットを乱さないように注意しながら、上清を捨てる。
7. RT赤5〜10mlの中でペレットを再懸濁ペレットサイズに基づいて、細胞溶解緩衝液。 RTで5分間233×gで5分間遠心分離を室温で座って解決のままにしておきます。
8. 上清を吸引し、ペレットの大きさに基づいて、伝統的な増殖培地5〜10mlの添加することによりペレットを再懸濁（ダルベッコ改変イーグル培地[DMEM] / 10％FBS / 1％ペニシリン - ストレプトマイシン溶液[ペンストレプトマイシン]）。
9. 細胞破片を除去するためには100μmナイロン細胞ストレーナーを通してサスペンションをフィルタリングします。
10. 4℃で5分間233×gで遠心分離し、ペレットを中断することなく、上清を捨てる。
11. ペレットサイズに基づいて、伝統的な増殖培地5-10中にペレットを再懸濁。
12. 15センチメートル標準培養皿に2×10 ^6個の細胞を配置し、O / N 37°C / 21％O _{2、5％CO 2}で初代培養を確立する。増殖培地中で37℃/ 21％O _{2、5％CO 2}での自発的な分化を防止するために、サブコンフルエントなレベルに維持する。
    注：完全に中の細胞密度コンフルエント15cmのプレートは、約4-6×10 ⁶細胞である。

2.染色

1. ソート/染色前36時間、37℃/ 21％O _{2、5％CO 2、}伝統的な増殖培地中での培養のASC。
2. （製造業者のプロトコルに従って）のAccutaseを用いて培養プレートからリフトのASC。
3. 一度（2％FBSおよび1％のペン - ストレプトマイシンを含むPBS）をFACS緩衝液で細胞を洗浄する。
4. 4℃で5分間233×gで遠心し。
5. ペレットを中断することなく、上清を捨てる。 FACS緩衝液0.5〜1 mlの細胞を再懸濁し（細胞数および所望の抗体の量に依存する）。
   注：細胞懸濁液の体積は、FACS抗体製造業者の推奨に従って、抗体濃度を決定する。しかし、1の開始濃度を用いて抗体濃度の滴定、：それは抗体を使用する最初の時間であれば100は、通常は推奨されている。
6. の合計数血球計数器を用いて細胞。
7. 未染色試料および単色のコントロールのために使用されて1.5 ml遠心管中で予備100μlのアリコート（使用する蛍光抗体の数に応じて）。
8. （製造者の指示に従って、所定の濃度で）適切な蛍光標識されたモノクローナル抗体を追加し、遮光し氷上で20〜30分、インキュベートする。
   1. 骨形成亜集団にラベルを付けるには：1：50の濃度になるようにFACS緩衝液中の抗CD90（APC抗ヒトCD90（はThy1））または抗CD105（FITC抗ヒトCD105（エンドグリン））を希釈します。
   2. 他の細胞集団（ 例えば 、造血および内皮細胞）を標識する：希釈した抗CD45（抗ヒトCD45パシフィックブルー）、抗CD34（抗ヒトCD34 APC）、および/ ​​または抗CD31（抗ヒトCD31 PE ）FACSで1時50分の濃度にバッファー。
   3. 直接結合した抗体を使用していない場合は、適切なストレプトアビジン結合第二に、ビオチン化一次抗体を使用する100：そのような1の希釈でストレプトアビジンPE-Cy7は、などの進の抗体。
9. インキュベーション後、細胞を2回洗浄する。上清を吸引し、4℃で5分間、233×gでFACS緩衝液および遠心機でチューブを埋める。
10. 細胞塊を除去するために70μmのナイロン細胞ストレーナーを通して400〜500μlのFACSバッファおよびフィルタサンプル中の細胞を再懸濁。
11. フィルタートップでFACSチューブに標識細胞を移し、分析の間、サンプルを氷上で維持する。

3.蛍光活性化細胞ソーティング

注：以下の手順では、蛍光活性化細胞選別（FACS）または熟練した技術者の支援に予備知識を義務付ける。

1. 前方散乱（FSC）、側方散乱（SSC）を調べるために、設計解析プロットを適切なFACSソフトウェアを使用して、フィコエリトリン（PE）-Texasレッド、パシフィックブルー、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、アロフィコシアニン（APC）および任意の他のフルオロフォアの使用dは細胞を標識する。
2. セルソーター、簡単に渦に細胞を再懸濁するために、各サンプルをロードする前に。
3. 細胞破片を排除するために、ベースライン自己蛍光を決定するために、全細胞集団のためにゲートを設定するために、未染色試料の分析を開始する。
4. 未染色試料にヨウ化プロピジウム（PI）を追加し、全細胞集団内の生細胞の集団を可視化するためにそれを分析する。この集団の周りにゲートを構築します。
5. 蛍光補正を行うために、各蛍光色素のための単色対照試料を分析する。
6. ソートにゲートの位置を設定するための染色サンプルを分析します。
7. 死細胞を染色するために、染色されたサンプルにPIを追加します。
8. 標識された細胞集団をソートします。ソート培地を含む1.5 mlの遠心チューブまたは円錐管（15ml）中のどちらかに変換する。
9. 手動での細胞の必要量が得られた後に選別止める。
10. 私達取得された細胞集団のFACS、ごく一部分析することによって、高純度チェックを行う（ 例えば 、500細胞）る。
    注：この手順はソートされた細胞集団の純度を確認した。理想的には、純度が90〜95％より大きくなければならない。
11. 10％FBSを含む新鮮な培地1mlにソートし、再懸濁の4°Cの直後の終了で5分間233×gで遠心分離細胞。
    注：使用される媒体の量は、細胞ペレットのサイズに基づいて増加させることができる。
12. ゼラチン被覆プレート上のプレートは、細胞生存率を改善する。最終的な細胞収量に応じて、6ウェルプレート中の12ウェルプレートでウェル当たり100,000細胞を、ウェル当たり300,000細胞をプレーティング。

結果

ヒトASC（ 図1A、1B）の高濃縮集団の単離に強化された骨形成の結果と細胞のマーカーとしてCD90を使用した。 ASCははパシフィックブルー結合抗ヒトCD45、FITC結合抗ヒトCD105、およびAPC結合抗ヒトCD90で染色した。ポストソート分析によって定量しソートした後、純度のレベルは、98％以上であった。

2つの新規な亜集団の将来の単離のために許可された転写プロ?...

ディスカッション

現在、ヒト脂肪組織のSVFからASCの均質な亜集団の単離は、望ましい目標ものの依然として厳しい。このような細胞は、骨格組織の形成および恒常性を研究するために使用することができるようにプロ骨形成ASC亜集団の単離は、特に望ましい。しかし、脂肪組織のSVFは、セル容量と分化能を食い止めるに関して有意な異質性を保有する^。11この異質性の分子基盤は、細胞のプールされた...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposable 250 ml Conical Tubes	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement	Gibco	10566-016
PBS, pH 7.4	Gibco	10010-023
Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution	Purdue	PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X	Cellgro	21-023-CV
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin	Gibco	16000-044
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE Cell Detachment Solution	Stem Cell Technologies	7920
APC Mouse Anti-Human CD90	BD Pharmingen	559869
FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)	BD Pharmingen	561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)	eBioscience	48-9459-41
Anti-Human CD34 APC	eBioscience	17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE	eBioscience	12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II instrument	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences