El aislamiento y enriquecimiento de Human adiposo derivado de células estromales de la osteogénesis mejorada

Resumen

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

Resumen

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

Introducción

The heterogeneous nature of stem cell populations is not yet fully understood and remains a major impediment to the development of clinically effective stem cell-based therapeutic applications. One of the most common ways to characterize a heterogeneous population of stem cells is to employ a cell sorting method, such as fluorescence-activated cell sorting (FACS), to separate cells based on their surface marker expression profiles. As sorting methods become more complex, it becomes possible to identify more distinct functional subpopulations of cells. Microfluidic-based technologies are becoming more and more frequently utilized in analysis of gene expression at the single cell level. Multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) within a microfluidic chip allows for effective and reliable high-resolution, single cell transcriptional analysis.^1-5

In a previous study using single cell transcriptional profiling of 48 genes, considerable transcriptional heterogeneity was observed among ASCs.⁶ However, the distribution of genes MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 exhibited a strong association with a cluster of cells possessing highly osteogenic transcriptional profiles. To isolate cells according to this osteogenic gene expression profile, surface antigen expression patterns were correlated with transcription patterns and surface marker expression of endoglin (CD105) was subsequently discovered to closely correlate with enhanced osteogenic differentiation potential of ASCs. Independent of CD105 expression, expression of surface receptor Thy-1 (CD90), a glycosyl-phosphatidylinositol-linked membrane protein previously shown by Chen et al. to be associated with osteoprogenitor cells, was also correlated with osteogenic gene expression.^6,7 These findings provide the opportunity to prospectively isolate subpopulations within the larger heterogeneous pool of ASCs with increased osteogenic capacity for cell-based bone tissue engineering applications.

Protocolo

NOTA: Todas las muestras de los pacientes se obtuvieron con consentimiento informado, y los protocolos experimentales fueron revisados ​​y aprobados por la Universidad de la Junta de Revisión Institucional de Stanford (Protocolo # 2188 y # 9999).

1. Aislamiento de células y Cultura:

1. Obtener tejido adiposo subcutáneo humano a partir de pacientes de sexo femenino sanos sometidos a lipoaspiración electiva del abdomen, flanco, y / o la región del muslo bajo anestesia local / general. Asegúrese de que la Junta de Revisión Institucional (IRB) haya obtenido la aprobación para el protocolo de aislamiento de ASC a partir de tejidos humanos, y siga las precauciones de seguridad institucionales mientras se trabaja con este tipo de materiales.
2. Para obtener el SVF del tejido adiposo lipoaspirated, primero lavar el lipoaspirado tres veces con volúmenes iguales de 1x solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Aspirar con cuidado y desechar la fase acuosa inferior.
3. Preparar el tampón de digestión colagenasa: 0,075% colagenasa tipo I en HankBalanced Salt Solution (HBSS). Preparar tampón FACS: 2% de SFB, el 1% y el 1% P188 Pen-Strep en PBS. Filtra ambas soluciones utilizando un tamaño de poro de flujo rápido del filtro de polietersulfona 0,22 micras disponible en el mercado.
4. Para digerir el tejido adiposo lavado, añadir un volumen igual de tampón de digestión con colagenasa y colocar recipiente de digestión de forma segura en un baño de agua en agitación durante 60 min a 37 ° C (aproximadamente 180 batidos / min).
   NOTA: Lo mejor es usar un recipiente de digestión volumen más grande de lo necesario, ya que esto permite la digestión máxima durante la agitación (es decir, 250 ml de tampón de digestión con colagenasa, 250 ml de tejido adiposo lavado en un matraz estéril 1L).
5. Neutralizar la actividad enzimática mediante la adición de un volumen igual de tampón de FACS y permitir sentarse a TA durante 5 min. A continuación, se centrifuga a 233 xg durante 20 min a 4 ° C.
6. Aspirar con cuidado y desechar el sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar el pellet SVF de alta densidad.
7. Resuspender el precipitado en 5 a 10 ml de RT rojoTampón de Lisis Celular, basado en el tamaño del pellet. Deje la solución para sentarse a TA durante 5 min y se centrifuga a 233 xg durante 5 min a TA.
8. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado mediante la adición de 5-10 ml de medio de crecimiento tradicional, basado en el tamaño de pellet (medio Eagle modificado de Dulbecco [DMEM] / 10% FBS / 1% de penicilina-estreptomicina solución de [pen-strep]).
9. Se filtra la suspensión a través de un filtro de células de 100 micras de nylon para eliminar los desechos celulares.
10. Centrifugar a 233 xg durante 5 min a 4 ° C, y descartar el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
11. Resuspender el precipitado en 5 a 10 ml de medio de cultivo tradicionales, basados ​​en el tamaño de pellets.
12. Coloque 2 x 10 ⁶ células en una placa de cultivo de 15 cm estándar y establecer cultivos primarios O / N a 37 ° C / 21% O _2, 5% de CO _2. Mantener a niveles sub-confluente para prevenir diferenciación espontánea a 37 ° C / 21% O _2, 5% de _CO2 en medio de crecimiento.
    La densidad celular en un totalmente: NOTAconfluente placa de 15 cm es de aproximadamente 6.4 x 10 ⁶ células.

2. La tinción

1. ASC Cultura en medio de cultivo tradicional a 37 ° C / 21% de O _2, 5% de _CO2, durante 36 horas antes de la tinción / clasificación.
2. ASC Ascensor de placas de cultivo utilizando Accutase (según el protocolo del fabricante).
3. Lave las células una vez con tampón FACS (PBS con FBS al 2% y 1% pen-strep).
4. Centrifugar a 233 xg durante 5 min a 4 ° C.
5. Descartar el sobrenadante sin perturbar el sedimento. Resuspender las células en 0,5-1 ml de tampón FACS (dependiendo del número de células y la cantidad de anticuerpo deseado).
   NOTA: El volumen de la suspensión de células, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante anticuerpo FACS, determina la concentración de anticuerpo. Sin embargo, la valoración de la concentración de anticuerpo, utilizando una concentración de partida de 1: 100, se aconseja por lo general si es la primera vez que utiliza un anticuerpo.
6. Cuente el número total decélulas utilizando un hemocitómetro.
7. Reserva alícuotas de 100 ul de 1,5 ml tubos de centrifugación que se utilizarán para una muestra sin mancha y los controles de un solo color (según el número de anticuerpos fluorescentes usados).
8. Añadir los anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia-apropiados (en concentraciones predeterminadas, según las instrucciones del fabricante) y se incuba durante 20 a 30 minutos en hielo, protegida de la luz.
   1. Para etiquetar subpoblación osteogénico: Diluir anti-CD90 (APC CD90 anti-humano (Thy1)) o anti-CD105 (FITC anti-humana CD105 (endoglina)) en tampón FACS a una concentración de 1:50.
   2. Para etiquetar otras poblaciones de células (por ejemplo, hematopoyéticas y células endoteliales): Diluir anti-CD45 (Anti-CD45 humano Pacific Blue), anti-CD34 (Anti-CD34 humano APC), y / o anti-CD31 (Anti-Human CD31 PE ) en tampón FACS a una concentración de 1:50.
   3. Si no está usando anticuerpos conjugados directamente, utilizar un anticuerpo primario biotinilado con un segundo conjugada con estreptavidina apropiadoary anticuerpo, tal como estreptavidina PE-Cy7, a una dilución de 1: 100.
9. Después de la incubación, se lavan las células dos veces: llenar tubos con tampón FACS y se centrifuga a 233 xg durante 5 min a 4 ° C, aspirar el sobrenadante.
10. Resuspender las células en 400 a 500 muestras l FACS de amortiguación y filtrar a través de un 70 micras filtro de células de nylon para eliminar grupos de células.
11. Transferencia de células marcadas en tubos FACS con la parte superior del filtro y mantener las muestras en hielo durante la duración de análisis.

3. Clasificación células activadas por fluorescencia

NOTA: Los siguientes pasos exigen conocimientos previos en células activadas por fluorescencia (FACS) o la ayuda de un técnico especializado.

1. Utilizando el software FACS apropiadas, las parcelas de análisis de diseño para examinar dispersión frontal (FSC), la dispersión lateral (SSC), ficoeritrina (PE) -Texas Rojo, Azul Pacífico, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Allophycocyanin (APC) y cualquier otro uso fluoróforod para etiquetar células.
2. Antes de cargar en el clasificador de células, vórtice brevemente cada muestra para resuspender las células.
3. Comenzar con el análisis de la muestra sin teñir para fijar puertas para la población total de células, para excluir los desechos celulares, y para determinar la autofluorescencia de línea de base.
4. Añadir yoduro de propidio (PI) a la muestra sin teñir y analizar con el fin de visualizar la población de células vivas dentro de la población total de células. Construir una puerta alrededor de esta población.
5. Analizar una muestra de control de un solo color para cada fluorocromo con el fin de ajustar la compensación de fluorescencia.
6. Analizar la muestra teñida para establecer la posición de las puertas para la clasificación.
7. Añadir PI a la muestra teñida con el fin de teñir las células muertas.
8. Ordena las poblaciones de células marcadas. Ordenar en cualquiera de 1,5 ml tubos de centrífuga o tubos cónicos (15 ml) que contenía medio de cultivo.
9. Cesar manualmente la clasificación una vez se ha obtenido la cantidad necesaria de células.
10. Nosotrosing FACS, realizar una comprobación de la pureza mediante el análisis de una pequeña fracción (por ejemplo., 500 células) de la población de células adquirida.
    NOTA: Este paso confirma la pureza de las poblaciones de células ordenados. Idealmente, la pureza debe ser mayor que el 90-95%.
11. Centrifugar las células a 233 xg durante 5 min a 4 ° C inmediatamente después de la finalización de la clasificación y resuspender en 1 ml de medio fresco que contiene 10% de SFB.
    NOTA: La cantidad de los medios utilizados se puede aumentar en función del tamaño de la sedimento celular.
12. Placa en placas recubiertas con gelatina para mejorar la viabilidad celular. Dependiendo del rendimiento celular final, placa 300000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos, 100.000 células por pocillo en una placa de 12 pocillos.

Resultados

El uso de CD90 como un marcador para las células con una mejora de los resultados de la osteogénesis en el aislamiento de una población altamente enriquecido de ASC humanos (Figura 1A, 1B). ASC se tiñeron con Pacific Blue-CD45 conjugado anti-humano, conjugado con FITC anti-CD105 humano, y CD90 anti-humano conjugado con APC. Después de la clasificación, el nivel de pureza era mayor que 98%, cuantificada por análisis post-especie.

Definición de grupos de células en ba...

Discusión

Actualmente, el aislamiento de las subpoblaciones homogéneos de ASC de la SVF de tejido adiposo humano sigue siendo un reto aunque objetivo deseable. El aislamiento de subpoblaciones ASC pro-osteogénicas es particularmente deseable, ya que tales células se pueden utilizar para estudiar la formación y la homeostasis de los tejidos esqueléticos. Sin embargo, el SVF del tejido adiposo alberga heterogeneidad significativa con respecto al vástago capacidad de la célula y el potencial de diferenciación. ¹¹ ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposable 250 ml Conical Tubes	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement	Gibco	10566-016
PBS, pH 7.4	Gibco	10010-023
Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution	Purdue	PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X	Cellgro	21-023-CV
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin	Gibco	16000-044
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE Cell Detachment Solution	Stem Cell Technologies	7920
APC Mouse Anti-Human CD90	BD Pharmingen	559869
FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)	BD Pharmingen	561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)	eBioscience	48-9459-41
Anti-Human CD34 APC	eBioscience	17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE	eBioscience	12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II instrument	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences