אלקטרו הקלטה בו זמנית ומייקרו-הזרקות של סוכנים מעכבים במוח מכרסם

Summary

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

Abstract

כאן אנו מתארים שיטה לבניית "injectrode" שימוש יחיד באמצעות חלקים מסחריים נגישים ובמחיר סבירים. מערכת חיטוט פותחה המאפשרת להזרקה של תרופה בעת הקלטת אותות אלקטרו מהאוכלוסייה העצבית הפגועה. שיטה זו מספקת אלטרנטיבה פשוטה וחסכונית לפתרונות מסחריים. פיפטה זכוכית שונה על ידי שילוב שלו עם מזרק ונימת כסף. Injectrode מחובר למשאבת microsyringe מסחרית עבור משלוח סמים. התוצאה היא טכניקה המספקת משוב פרמקודינמיקה בזמן אמת באמצעות אותות תאיים רבת יחידה שמקורם מהאתר של אספקת סמים. כהוכחה של מושג, הקלטנו פעילות עצבית מcolliculus מעולה שהושרו על ידי הבזקי אור בחולדות, במקביל עם משלוח של תרופות דרך injectrode. קיבולת הקלטת injectrode מאפשרת אפיון הפונקציונלי של injאתר שיקוף העדפת שליטה מדויקת הלוקליזציה של אספקת סמים. יישום של שיטה זו גם חורג הרבה מעבר למה שהפגין כאן, כבחירה של חומר כימי נטענה לתוך injectrode היא עצומה, כולל איתור סמנים לניסויים אנטומיים.

Introduction

איון של אזורים בקליפת המוח וגרעינים תת-קליפת המוח הוא חשוב בחקר יחסים פונקציונליים בין מבנים השונים במוח ^2-4. הספרות האחרונה העסיקה כימית או טכניקות קריוגני פסד של פונקציה כדי ללמוד את התפקיד של מבני מוח ^2,5. בהקשר לmicroinjections התרופתי, בנפחים קטנים של תרופות יכולים להינתן לאזור במוח בקצב מבוקר תוך מזעור הנזקים נלווים ^ל6,7 הרקמה הסובבת. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לספק אגוניסטים ספציפיים, אגוניסטים הפוך או יריבים כדי לחקור את ההשפעה של מטרות תרופתיות שונות על פעילות עצבית. יכולים להיות גם למדו אפקטים כגון על ידי מדידת שינויים בתגובות עצביות ממקומות מרוחקים, המאפשרת לחוקרים ללמוד את היחסים בין מבנים בקליפת המוח וקורטיקליים שונים.

הנה, אנחנו מדגימים את ההרכבה של מכשיר, injectrode, מסוגל boה הקלטת אותות אלקטרו ומתן כמויות קטנות של סמים במיקום היעד. אנחנו מדגימים את היכולות של מערכת זו על ידי הזרקת GABA, מעכב משותף של פעילות עצבית, בcolliculus מעולה החולדה. אזור זה הוא רגיש לגירוי חזותי, אשר אפשר לנו להשתמש בפעילות multiunit עוררה חזותי כדי לאשר לוקליזציה injectrode. ההפיכות של איון הוערכו על ידי ההתאוששות של פעילות עצבית נורמלית לאחר תום הזרקת GABA.

היכולת לעקוב אחר פעילות יחידה רבת מאתר ההזרקה מאפשרת כוונון העדין של שיעורי ההזרקה וכרכים דרושים כדי להשיג את התגובה הפרמקודינמית הרצויה. לכן, יתרון של שיטה זו הוא פוטנציאל הגבלה של נזק לרקמות שנגרמו על ידי microperfusion, מאז הכרכים היעילים הקטנים מוזרקים. הפרוטוקול המוצע מספק שיטה יעילה עלות ליצירת necessar החומרה חד פעמיy לניסויי ניהול שבו משלוח סמים והקלטת פעילות עצבית המקומית הוא רצויה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: כל הנהלים בוצעו בהתאם להנחיות של המועצה הקנדית להגנה על בעלי חיים והמועצה לביקורת האתיקה של אוניברסיטת מונטריאול.

1. אסיפה של פיפטה הקלטת ההזרקה

1. משוך נימים כ 7 סנטימטר ארוכות זכוכית (קוטר חיצוני 1 מ"מ) באמצעות חולץ פיפטה.
2. לשבור את הקצה של הנימים ולבדוק את הצמצם תחת מיקרוסקופ אור. ודא שהקוטר הפנימי הוא בין 30 מיקרומטר עד 40 מיקרומטר.
3. הכנס חוט כסף ארוך 7 סנטימטרים לתוך נימי זכוכית עם כ 1 סנטימטר הבולט מהקצה הלא המחודד של פיפטה הזכוכית.
4. לכופף את החוט העודף orthogonally לנימי הזכוכית.
5. החל טיפה של דבק פלסטי גמיש בפיר של מחט מזרק 30 G.
6. הכנס מזרק 30 G בפיפטה הזכוכית לפי השרטוטים מוצגים באיור 1 .
7. הוסף ציפוי שני של דבק על מנת להבטיח חותם ראוי מהצומת בין פיפטה הזכוכית והמזרק.
8. השאר את פיפטה לייבוש עם הקצה פונה כלפי מעלה לכ -12 שעות על מנת להבטיח ריפוי תקין של הדבק. התוצאה המוגמרת מוצגת באיור 2.

הערה: הליך זה נעשה על ניסויים ועיקור של קצה פיפטה חריפים לא נדרשה.

2. הכנת בעלי החיים

1. מניחים את החולדה בתיבת הרדמה.
2. לגרום להרדמה באמצעות isoflurane 4% במשך 5 עד 10 דקות.
3. מניחים את החיה על שולחן stereotaxic עם כרית חימום ובדיקה רקטלית כדי לשמור על טמפרטורת גוף של 37 מעלות צלזיוס. השתמש חרטום כדי לשמור על הרדמה עם isoflurane 2%. Secure ראשו של העכברוש באמצעות מוטות אוזן ובעל שיניים.
4. החל טיפות משחה או עין עיניים, הכוללות% 1 אטרופין טיפות כדי לסייע בהרחבת אישון. כדי למנוע יובש, תחול ירידת הסיכהזה בערך כל 30 דקות.
5. לגלח את הראש ולנקות אותו עם 10% povidone- יוד.
6. להרדמה מקומית, להזריק 0.5 מיליליטר של לידוקאין 2% מתחת לקרקפת במקומות 2-3 על ידי הרמת העור והחדרת קצה המחט.
7. אשר רמה נאותה של הרדמה על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן והתבוננות חוסר התנועה. בנוסף, לפקח על קצב הלב כדי לוודא שהוא נמצא בערכים נורמלים (300 עד 400 פעימות / דקה).
8. לחתוך את הקרקפת בקו ישר לאורך החציון עם להב 10 אזמל # לחשוף שני תפרי עטרה ועל sagittal.
9. לחשוף את הנקודות למבדה וגבחת על ידי לחיצה בצד את הרקמה שמכסה את הגולגולת עם מרית כירורגית.
10. רמת הגולגולת כך שעמדות גבחת וLambda נמצאות על אותו המישור.
11. כדי להגדיר את נקודת ההתייחסות, להשתמש בהתקן stereotaxic עם שפופרת זכוכית רכובה להגדיר אותו ממש מעל גבחת. זה יהיה "אפס" ולAntero-אחורי medמדידות ial-רוחב קואורדינטות.
12. הגדר את נקודת העניין על ידי הזזת stereotaxic הר לקואורדינטות הנדרשות, לציין את קואורדינטות stereotaxic ולצייר ריבוע מסביב לאזור היעד שמסמן בי craniotomy יבוצע.
13. השתמש תרגיל כירורגית עם תרגיל מעוקר לאורך הכיכר המסומנת לאט בלי לחץ כדי להסיר את חומר העצם לאט. היזהר שלא לקדוח יותר מדי זמן באותו האזור, כפי שהוא יפיק חום ולגרום לנגעים בקליפת המוח.
14. כאשר עצם תיחום craniotomy הפך דק מספיק, להסיר בזהירות את סעיף הגולגולת עם פינצטה כדי לחשוף את הקליפה.
15. לעתים קרובות להשקות את הקליפה החשופה עם נוזל השדרה מוחין מלאכותי כדי למנוע התייבשות רקמה.
    הערה: הסרת מאטר דורה היא מיותרת על העכברוש כמו הקצה של injectrode הוא יציב מספיק כדי לחדור.

3. מילוי והרכבה של מערכת ההזרקה

1. מלא5-10 microsyringe μl על ידי שאיפה עם שמן מינרלים.
2. מלא את המזרק עם פיפטה הזכוכית קבועה עם תמיסה של 0.5% שמיים כחולים שיקגו (CSB) וחומצת 300 מיקרומטר γ-aminobutyric (GABA) או פתרון של לידוקאין 2% עם 0.5% ⁹ CSB. לדלל את כל הפתרונות עם מי מלח.
   1. במקרה של חומר בשפע, למלא באמצעות מזרק רגיל ולהשתמש בטכניקות הזהירות הרגילות, כדי למנוע ההיווצרות של בועות אוויר.
   2. במקרה של חומרים יקרים יותר, להשתמש בשמן מינרלים כדי למלא את injectrode והסוכן הכימי אז יכול להיות שהוצג על ידי שאיפה. כהפרש בין צפיפות נפט ומים מינרליים הוא יחסית גבוה, חומר זה הוא מועמד טוב להזרקה של תמיסות מימיות.
      הערה: צבע ניתן להוסיף כדי לאשר את ההפרדה בין שני הנוזלים.
3. כדי למלא את פיפטה ההזרקה, למלא מזרק 1 מיליליטר עם הפתרון על ידי שאיפה ולאחר מכן להזריק את הפתרון לאטלפיפטה ההזרקה.
4. שים לב זהיר להדלפות באזורים שצוינו באיור 1 על ידי שטיפת אזורים אלה נקיים והתבוננות דליפות על ידי הזרקת הפתרון לאט עם המזרק נוסף.
5. הסר את מזרק 1 מיליליטר. כאשר עושים זאת, כדי להיות בטוח לשמור על לחץ קל על הבוכנה כך שהוואקום אינו מסיר את הפתרון מפיפטה ההזרקה.
6. מלא את microsyringe עם שמן מינרלים על ידי שאיפה ולצרף אותו בחוזקה לפיפטה ההזרקה המלא, ולאחר מכן לנגב בזהירות כל פתרון עודף מinjectrode התאסף עם גזה.
7. ודא שהקצה אינו חסום על ידי הזרקת נפח קטן מאוד, מספיק לראות טיפה קטנה ויוצרת בקצה של פיפטה הזכוכית.
8. הר injectrode על מערכת micropump ולוודא שהוא קבוע גם.
9. מקם בזהירות את קצה injectrode בקואורדינטות היעד ולהוריד את הקצה אל פני השטח של קליפת המוח.
10. לאט לאט להוריד את injectrשיר הלל באמצעות המנגנון stereotaxic למבנה היעד (colliculus מעולה במקרה זה) באמצעות קואורדינטות אנטומי המתאימות.
11. מכסה את הקליפה החשופה עם אגר חם כדי למנוע התייבשות רקמה.

4. הזרקה ואיון הפיך

1. הגדר את משאבת microinjection להזריק 400 עד 800 NL ב 40 / הפעלת דקות ועיתונות NL להתחיל ההזרקה. שים לב ששיעור ספייק יציג ירידה בהזרקה.
   הערה: בהגדרת הניסוי, פעילות עצבית התאוששה תוך שעה לאחר תום מסירת GABA. כל מכשיר מכאני מכויל ניתן להשתמש כדי להפעיל לחץ על מזרק microinjection כדי לנהל את הזריקה.
2. לאחר רכישת נתונים אלקטרו, להרדים בשיטה אושרה על ידי בעלי החיים האתיקה הקהילה המקומית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הבנייה של injectrode מתוארת באיור 1. חוט כסף (C) מוזנת לתוך פיפטה זכוכית (ד ') עם חלק מהכפוף התיל ובולט החוצה מהפתיחה. מחט 30 G (B) מצורף ואטום לפתיחת פיפטה הזכוכית עם דבק. לאחר פיפטה כבר מלאה בחומר ההזרקה, מזרק מיקרו זכוכית () מחובר למחט. חשוב שיש חותם טוב בי מזרק מיקרו מ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול המוצע נועד לפתור את האתגרים הנובעים משיטות איון הפיכים הנוכחיות. באופן ספציפי, הפרויקט הזה במטרה לשכלל את השיטות המשמשות לmicroinjections הכימי של חומרי ויסות פעילות עצבית, במיוחד במבני מוח עמוקים. אתגר טכני המתעוררים מסוג זה של התקנה הוא את הצורך בשני הבדיקות שcol...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Injection pump (UltraMicroPump III)	WPI	#UMP3
Injection console (Micro4 Controller)	WPI	#SYS-MICRO4
Hamilton syringe	Hamliton	(80301) 701LT 10 µL SYR	Syringes between 5 and 10 μl used
Flexible plastic adhesive	Lepage	393915	The gel form is easier to apply to the shaft of the 30 G hypodermic needle forming a waterproof seal when dry.
Glass pipettes	WPI	#TW100F-4	Thin wall, 1 mm OD, 0.75 mm ID with filament pipettes used
720 Needle Pipette Puller	Kopf	720
Silver wire	A-M Systems, Inc.	782500	Bare 0.010”