Gleichzeitige Elektrophysiologische Aufzeichnung und Micro-Injektionen von Hemmstoffe im Gehirn von Nagetieren

Zusammenfassung

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Verfahren für die Konstruktion unter Verwendung kommerziell zugängliche und preiswerte Teile einer Einweg- "Elektrodenpillen". Ein Prüfsystem entwickelt, das für die Injektion eines Arzneimittels ermöglicht, während der Aufzeichnung von elektrophysiologischen Signalen aus dem betroffenen Neuronenpopulation. Dieses Verfahren stellt eine einfache und kostengünstige Alternative zu kommerziellen Lösungen. Eine Glaspipette wurde durch die Kombination mit einer Injektionsnadel und einem Silberdraht modifiziert. Die Elektrodenpillen auf Handels Mikrodosierspritzenpumpe zur Arzneimittelabgabe beigefügt. Dies führt zu einem Verfahren, das Echtzeit-Rückkopplung liefert Pharmakodynamik durch Multi-unit extrazelluläre Signale von der Stelle der Arzneimittelzuführung Ursprung. Als proof of concept verzeichneten wir neuronale Aktivität aus dem Colliculus superior durch Lichtblitze bei Ratten hervorgerufen, die gleichzeitig mit der Lieferung von Arzneimitteln durch die Elektrodenpillen. Die Elektrodenpillen Aufzeichnungskapazität ermöglicht die funktionelle Charakterisierung des injection Seite begünstigt eine genaue Kontrolle über die Lokalisation der Arzneimittelabgabe. Die Anwendung dieses Verfahrens erstreckt sich auch weit über das, was hier gezeigt, wie die Wahl der chemischen Substanz in die Elektrodenpillen geladen ist riesig, darunter Verfolgung Marker für anatomischen Experimenten.

Einleitung

Die Inaktivierung des kortikalen Bereichen subkortikalen Kerne in der Studie von funktionalen Beziehungen zwischen verschiedenen Gehirnstrukturen ^2-4 wichtig. Jüngsten Literatur loss-of-function chemische oder Kryo-Techniken eingesetzt, um die Rolle von Hirnstrukturen ^2,5 studieren. Hinsichtlich pharmakologischer Mikroinjektionen, kleine Volumina von Medikamenten können in einer Gehirnregion mit einer kontrollierten Geschwindigkeit unter Minimierung der Kollateralschäden an das umgebende Gewebe ^6,7, verabreicht werden. Diese Technik kann verwendet werden, um spezifische Agonisten, inverse Agonisten oder Antagonisten zu liefern, um die Wirkung verschiedener pharmakologischer Ziele auf neuronale Aktivität zu untersuchen. Solche Effekte können auch durch Messen von Veränderungen in der neuronalen Antworten von fernen Standorten ermöglicht es Forschern, die Beziehungen zwischen verschiedenen kortikalen und subkortikalen Strukturen untersuchen sucht werden.

Hierbei ist die Anordnung einer Vorrichtung, die Elektrodenpillen, fähig bo zeigen wir,th Aufzeichnen elektrophysiologischer Signale und Verteilen kleiner Mengen von Arzneimitteln an der Zielposition. Wir zeigen die Fähigkeiten dieses Systems durch Einspritzen von GABA, einen gemeinsamen Inhibitor der neuronalen Aktivität im Ratten Colliculus superior. Diese Region ist empfindlich auf visuelle Stimulation, die uns visuell evozierten Aktivität verwenden, um Mehrfach-Elektrodenpillen Lokalisierung zu bestätigen erlaubt. Die Reversibilität der Inaktivierung wurde durch die Wiederherstellung der normalen neuronalen Aktivität nach dem Ende des GABA Injektion beurteilt.

Die Fähigkeit, von der Injektionsstelle zu überwachen Multi-Unit-Aktivität ermöglicht die Feinabstimmung der Injektionsraten und Volumina, um die gewünschte pharmakodynamische Reaktion zu erzielen. Daher ist es ein Vorteil dieser Technik das Potential Begrenzung der Gewebeschädigung durch Mikroperfusionskammer verursacht, da die kleinste wirksame Mengen injiziert werden. Das vorgeschlagene Protokoll bietet eine kosteneffiziente Methode zur Erzeugung des Einweg Hardware notweny für die Durchführung von Experimenten, in denen Arzneimittelabgabe und lokale neuronale Aktivität Aufzeichnung erwünscht ist.

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Protokoll

HINWEIS: Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council zum Schutz der Tiere und der Ethik-Review Board der Université de Montréal durchgeführt.

1. Montage der Recording-Injektionspipette

1. Ziehen Sie einen ca. 7 cm lange Glaskapillare (1 mm Außendurchmesser) mit einer Pipette Abzieher.
2. Brechen Sie die Spitze der Kapillare und überprüfen Sie die Öffnung unter einem Lichtmikroskop. Zu bestätigen, dass der Innendurchmesser zwischen 30 um bis 40 um.
3. Legen Sie eine 7 cm lange Silberdraht in das Glaskapillare mit ca. 1 cm aus dem nicht-verjüngte Ende des Glaspipette herausragen.
4. Biegen Sie die überschüssige Faden orthogonal zur Glaskapillare.
5. Anwenden eines Tröpfchens aus flexiblem Kunststoffkleber auf der Welle einer 30 G Injektionsnadel.
6. Legen Sie eine 30 G Injektionsnadel in der Glaspipette nach den Schaltplänen in Abbildung 1 dargestellt .
7. Fügen Sie eine zweite Beschichtung aus Klebstoff, um eine ordnungsgemäße Abdichtung der Verbindungsstelle zwischen der Glaspipette und der Injektionsnadel zu gewährleisten.
8. Lassen Sie die Pipette mit der Spitze nach oben für etwa 12 Stunden, um eine ordnungsgemäße Aushärtung des Klebers sicherzustellen trocknen. Das fertige Ergebnis ist in Abbildung 2 dargestellt.

Hinweis: Dieses Verfahren ist auf akuten Experimenten und Sterilisation der Pipettierspitze durchgeführt wird, nicht erforderlich.

2. Vorbereitung der Tiere

1. Legen Sie die Ratte in einer Anästhesie-Box.
2. Induzieren Anästhesie unter Verwendung von 4% Isofluran für 5 bis 10 min.
3. Legen Sie das Tier auf einem stereotaktischen Tisch mit Heizkissen und rektale Sonde, um eine Körpertemperatur von 37 ° C zu halten. Verwenden Sie einen Nasenkegel auf die Anästhesie mit 2% Isofluran erhalten. Sichere Kopf der Ratte mit Ohr Bars und Zahnhalter.
4. Bewerben Augensalbe oder Augentropfen, die 1% Atropin fällt auf in Pupillenerweiterung zu unterstützen sind. Bis zur Trockenheit zu verhindern, gelten Schmier Tropfens etwa alle 30 Minuten.
5. Rasur den Kopf und reinigen Sie es mit 10% Povidon-Iod.
6. Zur Lokalanästhesie, injizieren 0,5 ml 2% Lidocain unter der Kopfhaut in 2-3 Standorten durch Anheben der Haut und dem Einlegen der Spitze der Nadel.
7. Bestätigen angemessene Gabe von Betäubungsmitteln durch Ausführen einer Zehe Prise und Beobachten der Mangel an Bewegung. Darüber hinaus ist die Herzrate, um sicherzustellen, daß sie innerhalb normaler Werte (300 bis 400 Schläge / min) ist.
8. Einzuschneiden die Kopfhaut in einer geraden Linie entlang der Mittel mit einem # 10 Skalpell, um sowohl die koronalen und sagittalen Nähten aussetzen.
9. Decke die Lambda und Bregma Punkte, indem beiseite das Gewebe, das Abdecken wird den Schädel mit einem chirurgischen Spachtel.
10. Pegel den Schädel, so daß Bregma und Lambda-Positionen sind auf der gleichen Ebene.
11. Um den Referenzpunkt gesetzt, verwenden Sie einen stereotaktischen Gerät mit einem Glasrohr montiert, um es direkt über Bregma gesetzt. Dies wird die "Null" für die von vorne nach hinten und medial-lateral Messungen koordiniert.
12. Stellen Sie den Punkt von Interesse, indem Sie den stereotaktischen Halterung auf die erforderlichen Koordinaten, beachten Sie die stereotaktischen Koordinaten und zeichnen Sie ein Quadrat um den Zielbereich, der markiert, wo die Kraniotomie durchgeführt.
13. Verwenden Sie einen chirurgischen Bohrer mit einem sterilisierten Bohrer entlang der markierten Quadrat langsam ohne Druck langsam entfernen Sie das Knochenmaterial. Seien Sie vorsichtig, zu lange in der gleichen Gegend nicht zu bohren, da es die Wärme erzeugen und verursachen Läsionen auf der Rinde.
14. Wenn die Knochen des Schädel Abgrenzung ausreichend dünn werden, entfernen Sie vorsichtig den Hirnschnitt mit einer Pinzette, um die Rinde aus.
15. Häufig bewässern den freiliegenden Kortex mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit zu Gewebeaustrocknung zu verhindern.
    HINWEIS: Dura mater Entfernung unnötig ist an der Ratte als die Spitze des Elektrodenpillen ist robust genug, um zu durchdringen.

3. Füllen und Montage des Einspritzsystems

1. Füllen Sie das5-10 & mgr; l-Mikrospritze durch Aspiration mit Mineralöl.
2. Füllen Sie die Injektionsnadel mit der festen Glaspipette mit einer Lösung von 0,5% Chicago Sky Blue (CSB) und 300 & mgr; M γ-Aminobuttersäure (GABA) oder einer Lösung von 2% Lidocain mit 0,5% CSB ^9. Verdünnen Sie alle Lösungen mit Kochsalzlösung.
   1. Im Fall von einer reichlichen Stoff, füllen Sie mit einem normalen Spritze und verwenden Sie die üblichen Vorsichtsmaßnahmen Techniken, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
   2. Im Fall teurer Substanzen zu verwenden, Mineralöl, um die Elektrodenpillen zu füllen und das chemische Mittel können dann durch Absaugen eingeführt werden. Da der Dichteunterschied zwischen Erdöl und Wasser ist relativ hoch, diese Substanz ist ein guter Kandidat für die Injektion von wässrigen Lösungen.
      HINWEIS: Ein Farbstoff zugegeben werden, um die Trennung zwischen den beiden Flüssigkeiten zu bestätigen.
3. Um die Injektionspipette füllen, füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit der Lösung durch Absaugen und dann langsam zu injizieren die Lösungin die Injektionspipette.
4. Achten Sie sorgfältig auf Lecks in Regionen in 1 durch Abtupfen diese Bereiche sauber und Beobachten Leckagen durch weiteres Einspritzen der Lösung langsam mit der Spritze angezeigt.
5. Entfernen Sie die 1-ml-Spritze. Dabei ist, lesen Sie leichten Druck auf den Kolben zu halten, so dass das Vakuum nicht die Lösung aus der Injektionspipette entfernen.
6. Füllen Sie den Mikrospritze mit Mineralöl durch Aspiration und befestigen Sie sie fest auf die gefüllte Injektionspipette, dann vorsichtig Wischen Sie überschüssige Lösung aus der montierten Elektrodenpillen mit Gaze.
7. Sicherzustellen, dass die Spitze nicht durch die Injektion ein sehr kleines Volumen, genug, um einen kleinen Tropfen bilden sich an der Spitze der Glaspipette siehe blockiert.
8. Montieren Sie den Elektrodenpillen auf dem Mikrosystem und sicherzustellen, dass sie gut befestigt.
9. Vorsichtig Position der Elektrodenpillen Spitze an den Zielkoordinaten und senken Sie die Spitze an die Oberfläche der Hirnrinde.
10. Langsam senken die injectrode mit dem Zielgerät an die Zielstruktur (superior colliculus in diesem Fall) mit den entsprechenden anatomischen Koordinaten.
11. Decken Sie die freiliegenden Kortex mit warmen Agar zu Gewebeaustrocknung zu verhindern.

4. Injection und reversible Inaktivierung

1. Stellen Sie die Mikroinjektionspumpe bei 40 nl / min, und drücken Sie Run injizieren 400 bis 800 nl, um die Injektion zu starten. Beachten Sie, dass Spike-Rate wird Reduktion während der Injektion zu zeigen.
   HINWEIS: In der Versuchsanordnung, die neuronale Aktivität innerhalb einer Stunde gewonnen nach dem Ende des GABA Lieferung. Jede kalibrierte mechanische Vorrichtung verwendet werden, um Druck auf die Mikroinjektionsspritze, um das Einspritzen durchzuführen anzuwenden.
2. Nach dem Erwerb der elektrophysiologischen Daten, einschläfern mit einem von der örtlichen Tierethik Gemeinschaft zugelassenen Methode.

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Ergebnisse

Der Aufbau des Elektrodenpillen ist in Abbildung 1 Ein Silberdraht (C) dargestellt ist, in einer Glaspipette (D) mit einem Teil der gebogenen Draht zugeführt und aus der Öffnung herausragt. A 30 G-Nadel (B) befestigt ist und an der Öffnung der Glaspipette mit Klebstoff abgedichtet. Nachdem die Pipette mit der Injektionssubstanz gefüllt worden ist, wird ein Glasmikrospritze (A) an der Nadel befestigt ist. Es ist wichtig, dass es eine gute Abdichtung, wenn die Mikrospritze verbunden mit der Nadel (E),...

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Diskussion

Das vorgeschlagene Protokoll wurde entwickelt, um die Herausforderungen, die sich aus aktuellen reversible Inaktivierung Methoden zu lösen. Genauer gesagt, dieses Projekt auf die Verfeinerung der für chemische Mikroinjektionen von Stoffen Modulation neuronaler Aktivität, vor allem in tiefen Hirnstrukturen verwendeten Verfahren ab. Eine technische Herausforderung, die aus dieser Art von Setup ist die Notwendigkeit für beide Sonden in der gleichen begrenzten Raum in vivo, um eine präzise Aufnahmen an der Inj...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Injection pump (UltraMicroPump III)	WPI	#UMP3
Injection console (Micro4 Controller)	WPI	#SYS-MICRO4
Hamilton syringe	Hamliton	(80301) 701LT 10 µL SYR	Syringes between 5 and 10 μl used
Flexible plastic adhesive	Lepage	393915	The gel form is easier to apply to the shaft of the 30 G hypodermic needle forming a waterproof seal when dry.
Glass pipettes	WPI	#TW100F-4	Thin wall, 1 mm OD, 0.75 mm ID with filament pipettes used
720 Needle Pipette Puller	Kopf	720
Silver wire	A-M Systems, Inc.	782500	Bare 0.010”