Registrazione simultanea elettrofisiologici e micro-iniezioni di agenti inibitori nel cervello del roditore

Riepilogo

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

Abstract

Qui si descrive un metodo per la costruzione di un mono-uso "injectrode" utilizzando parti commercialmente accessibili e convenienti. Un sistema di ispezione è stato sviluppato che consente l'iniezione di un farmaco durante la registrazione di segnali elettrofisiologici dalla popolazione neuronale colpita. Questo metodo fornisce una semplice ed economica alternativa alle soluzioni commerciali. Una pipetta di vetro è stato modificato combinandolo con un ago ipodermico e un filamento d'argento. Il injectrode è collegato a pompa Microsiringa commerciale per la somministrazione di farmaci. Ciò si traduce in una tecnica che fornisce feedback farmacodinamica tempo reale attraverso segnali extracellulari più unità provenienti dal sito di somministrazione di farmaci. Come un proof of concept, abbiamo registrato l'attività neuronale del collicolo superiore suscitata da lampi di luce nei ratti, in concomitanza con la consegna di farmaci attraverso il injectrode. La capacità di registrazione injectrode permette la caratterizzazione funzionale del injsito ezione favorendo un controllo preciso sulla localizzazione del drug delivery. L'applicazione di questo metodo si estende anche ben oltre ciò che è dimostrato qui, come la scelta di sostanza chimica caricato nel injectrode è vasta, tra cui tracciare i marcatori per esperimenti anatomici.

Introduzione

L'inattivazione di aree corticali e nuclei sottocorticali è importante nello studio delle relazioni funzionali tra varie strutture cerebrali ^2-4. La letteratura recente ha impiegato tecniche criogeniche chimica perdita-di-funzione o per studiare il ruolo delle strutture cerebrali ^2,5. Per quanto riguarda microiniezioni farmacologiche, piccoli volumi di farmaci possono essere somministrati in una regione del cervello ad una velocità controllata, riducendo al minimo i danni collaterali al ^6,7 tessuto circostante. Questa tecnica può essere usata per fornire agonisti specifici, agonisti inversi o antagonisti per studiare l'effetto di differenti bersagli farmacologici sulla attività neuronale. Tali effetti possono essere studiati da cambiamenti nelle risposte neuronali provenienti da località lontane misura, consentendo ai ricercatori di studiare i rapporti tra diverse strutture corticali e subcorticali.

Qui, dimostriamo l'assemblaggio di un dispositivo, il injectrode, capace di both registrazione di segnali elettrofisiologici e consegna di piccole quantità di droga nel luogo di destinazione. Dimostriamo le capacità di questo sistema iniettando GABA, un inibitore comune di attività neuronale, nel ratto collicolo superiore. Questa regione è sensibile alla stimolazione visiva, che ci ha permesso di utilizzare l'attività multiunit evocata visivamente per confermare la localizzazione injectrode. La reversibilità della inattivazione è stata valutata dalla ripresa della normale attività neuronale dopo la fine dell'iniezione GABA.

La possibilità di monitorare l'attività multi-unit dal sito di iniezione consente la messa a punto dei tassi di iniezione e volumi necessari per ottenere la risposta farmacodinamica desiderato. Pertanto, un vantaggio di questa tecnica è il potenziale limitazione di danni ai tessuti causati da microperfusione, poiché i volumi efficaci piccoli vengono iniettati. Il protocollo proposto fornisce un metodo efficiente di costo per la generazione del necessar hardware monousoy per esperimenti che conducono in cui si desidera la consegna della droga e la registrazione dell'attività neuronale locale.

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Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sono state eseguite in conformità alle direttive del Consiglio canadese per la protezione degli animali e la revisione consiglio Etico della Université de Montréal.

1. Assemblea della pipetta registrazione iniezione

1. Estrarre un capillare di vetro di circa 7 cm di lunghezza (diametro esterno 1 mm) con un estrattore pipetta.
2. Rompere la punta del capillare e controllare l'apertura al microscopio ottico. Verificare che il diametro interno è compreso tra 30 micron a 40 micron.
3. Inserire un lungo filo Silver 7 cm nel capillare di vetro con circa 1 cm sporgenti dall'estremità non rastremata della pipetta di vetro.
4. Piegare il filamento eccesso ortogonalmente al capillare di vetro.
5. Applicare una goccia di adesivo plastica flessibile sull'albero di un ago ipodermico 30 G.
6. Inserire un ago ipodermico 30 G nella pipetta di vetro secondo gli schemi presentati nella figura 1 .
7. Aggiungere un secondo strato di colla per garantire un'adeguata tenuta dalla giunzione tra la pipetta di vetro e l'ago ipodermico.
8. Lasciare la pipetta asciugare con la punta rivolta verso l'alto per circa 12 ore per garantire il corretto indurimento della colla. Il risultato finale è mostrato in Figura 2.

NOTA: Questa procedura viene eseguita su esperimenti acute e la sterilizzazione del puntale non è necessaria.

2. Preparazione degli animali

1. Posizionare il topo in una scatola di anestesia.
2. Indurre l'anestesia con il 4% isoflurano per 5 a 10 min.
3. Posto l'animale su un tavolo stereotassico con il rilievo di riscaldamento e sonda rettale per mantenere una temperatura corporea di 37 ° C. Utilizzare un cono per mantenere l'anestesia con il 2% isoflurano. Fissare la testa del topo con le orecchie bar e titolare denti.
4. Applicare unguento oftalmico o collirio, che includono 1% Atropina scende a facilitare la dilatazione della pupilla. Per prevenire la secchezza, applicare goccia lubrificantes circa ogni 30 min.
5. Shave testa e pulirlo con 10% iodopovidone.
6. Per anestesia locale, iniettare 0,5 ml di 2% lidocaina sotto il cuoio capelluto in 2-3 posizioni sollevando la pelle ed inserendo la punta dell'ago.
7. Conferma adeguato livello di anestesia eseguendo un pizzico piedi e osservando la mancanza di movimento. Inoltre, monitorare la frequenza cardiaca per garantire che sia entro valori normali (da 300 a 400 battiti / min).
8. Incidere il cuoio capelluto in una linea retta lungo la mediana con una lama di 10 # bisturi per esporre entrambe le suture coronale e sagittale.
9. Rivela i punti di Lambda e Bregma spingendo da parte del tessuto che copre il cranio con una spatola chirurgico.
10. Livellare il cranio in modo che le posizioni bregma e lambda sono sullo stesso piano.
11. Per impostare il punto di riferimento, utilizzare un dispositivo stereotassico con un tubo di vetro montato impostarla proprio sopra Bregma. Questo sarà il "zero" antero-posteriore e medcoordina le misure ial-laterali.
12. Impostare il punto di interesse spostando il stereotassico di montaggio alle coordinate richieste, annotare le coordinate stereotassica e disegnare un quadrato intorno alla zona di destinazione che segna dove verrà eseguita la craniotomia.
13. Utilizzare un trapano chirurgico con un trapano sterilizzato lungo la piazza marcata lentamente senza pressione per rimuovere lentamente il materiale osseo. Fare attenzione a non forare troppo a lungo nella stessa zona, in quanto la produzione di calore e causare lesioni della corteccia.
14. Quando l'osso che delimita la craniotomia è diventata sufficientemente sottile, rimuovere con attenzione la sezione del cranio con le pinzette per esporre la corteccia.
15. Irrigare Spesso la corteccia esposta con liquido cerebro-spinale artificiale per evitare l'essiccamento dei tessuti.
    NOTA: la rimozione mater Dura è inutile per il ratto come la punta di un injectrode è abbastanza robusto da penetrare.

3. Riempimento e montaggio del sistema di iniezione

1. Riempire il5-10 microlitri microsiringa da aspirazione con olio minerale.
2. Riempire il ago ipodermico con la pipetta di vetro fissa con una soluzione di 0,5% Chicago Sky Blu (CSB) e acido 300 pM γ-amminobutirrico (GABA), o una soluzione di 2% lidocaina con 0,5% CSB ^9. Diluire tutte le soluzioni con soluzione salina.
   1. Nel caso di una sostanza abbondante, riempire con una siringa regolare e utilizzare le usuali tecniche precauzionali per evitare la formazione di bolle d'aria.
   2. Nel caso di sostanze più costose, utilizzare olio minerale per riempire il injectrode e l'agente chimico può quindi essere introdotto tramite aspirazione. Poiché la differenza di densità tra l'olio minerale e l'acqua è relativamente elevata, questa sostanza è un buon candidato per l'iniezione di soluzioni acquose.
      NOTA: Un colorante può essere aggiunto per confermare la separazione tra i due liquidi.
3. Per riempire la pipetta di iniezione, riempire una siringa da 1 ml con la soluzione per aspirazione e poi iniettare lentamente la soluzionenella pipetta di iniezione.
4. Prestare attenzione per perdite in regioni indicate in figura 1 con tampone queste aree pulite e osservando perdite iniettando ulteriormente la soluzione lentamente con la siringa.
5. Rimuovere la siringa da 1 ml. Nel fare così, essere sicuri di mantenere una leggera pressione sullo stantuffo in modo che il vuoto non rimuove la soluzione dalla pipetta iniezione.
6. Riempire la microsiringa con olio minerale tramite aspirazione e fissarlo saldamente alla pipetta di iniezione riempita, poi pulire attentamente tutta la soluzione in eccesso dalla injectrode assemblato con una garza.
7. Verificare che la punta non è bloccato iniettando un volume molto piccolo, abbastanza per vedere una piccola goccia formando sulla punta della pipetta di vetro.
8. Montare il injectrode sul sistema micropompa e assicurarsi che sia ben fissata.
9. Posizionare accuratamente la punta injectrode alle coordinate di destinazione e abbassare la punta alla superficie della corteccia.
10. Abbassare lentamente il injectrODE usando l'apparato stereotassico alla struttura di destinazione (collicolo superiore in questo caso) utilizzando gli appositi coordinate anatomiche.
11. Coprire la corteccia esposta con agar calda per prevenire l'essiccamento dei tessuti.

4. Iniezione e inattivazione reversibile

1. Impostare la pompa microiniezione di iniettare 400-800 nl a 40 nl / min e premere Esegui per avviare l'iniezione. Si noti che il tasso di picco mostrerà riduzione durante l'iniezione.
   NOTA: Nel setup sperimentale, l'attività neurale recuperato nel giro di un'ora dopo la fine della consegna GABA. Qualsiasi dispositivo meccanico tarato può essere usato per applicare pressione sulla siringa microiniezione per condurre l'iniezione.
2. Dopo l'acquisizione dei dati elettrofisiologici, eutanasia con un metodo approvato dalla locale Comunità etico degli animali.

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Risultati

La costruzione del injectrode è illustrato in Figura 1. Un filo d'argento (C) viene alimentato in una pipetta di vetro (D) con la porzione di filo e piegata sporge fuori dall'apertura. Un ago 30 G (B) viene fissato e sigillato all'apertura della pipetta di vetro con colla. Dopo la pipetta è stata riempita con la sostanza di iniezione, una siringa di vetro micro (A) è collegata all'ago. È importante che vi sia una buona tenuta in cui il micro siringa collega con l'ago (E) e dove i...

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Discussione

Il protocollo proposto è stato progettato per risolvere le sfide poste dagli attuali metodi di inattivazione reversibile. In particolare, questo progetto mira a perfezionare i metodi utilizzati per microiniezioni chimiche delle sostanze che modulano l'attività neurale, in particolare nelle strutture cerebrali profonde. Una sfida tecnica emergente da questo tipo di configurazione è la necessità per entrambe le sonde da colocalized nello stesso spazio ristretto in vivo al fine di derivare registrazioni pr...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Injection pump (UltraMicroPump III)	WPI	#UMP3
Injection console (Micro4 Controller)	WPI	#SYS-MICRO4
Hamilton syringe	Hamliton	(80301) 701LT 10 µL SYR	Syringes between 5 and 10 μl used
Flexible plastic adhesive	Lepage	393915	The gel form is easier to apply to the shaft of the 30 G hypodermic needle forming a waterproof seal when dry.
Glass pipettes	WPI	#TW100F-4	Thin wall, 1 mm OD, 0.75 mm ID with filament pipettes used
720 Needle Pipette Puller	Kopf	720
Silver wire	A-M Systems, Inc.	782500	Bare 0.010”