פריימר לאימונוהיסטוכימיה על רקמות Cryosectioned מוח חולדה: דוגמא להכתמת Microglia ונוירונים

Summary

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Abstract

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה נפוצה לגילוי הנוכחות, המיקום, והשפע היחסי של אנטיגנים באתר. פרוטוקול ברמת מבוא זה מתאר את חומרים כימיים, ציוד, וטכניקות הנדרשות להשלמת מכתים immunohistochemical של רקמת המוח המכרסם, באמצעות סמנים למיקרוגלים ואלמנטים עצביים כדוגמא. באופן ספציפי, מאמר זה הוא פרוטוקול צעד-אחר-צעד להדמיה ניאון של מיקרוגליה ונוירונים באמצעות אימונוהיסטוכימיה לIba1 ופאן-עצבי, בהתאמה. הקרינה כפול תיוג הוא שימושי במיוחד עבור הלוקליזציה של חלבונים רבים בתוך המדגם זהה, מתן ההזדמנות להתבונן בצורה מדויקת יחסי גומלין בין סוגי תאים, הקולטנים, ligands, ו / או מטריקס ביחס ל, כמו גם אחד אחר שיתוף חלבון לוקליזציה בתוך תא בודד. שלא כמו טכניקות הדמיה אחרות, עוצמת מכתימה אימונוהיסטוכימיה הקרינה עלולה לגרום לירידה בהשבועות לחודשים הבאים מכתים, אלא אם אמצעי זהירות מתאימה נלקח. למרות מגבלה זו, ביישומים רבים הקרינה כפול תיוג עדיף על פני חלופות כגון tetrahydrochloride 3,3'-diaminobenzidine (DAB) או phosphatase אלקליין (AP), כקרינה היא יותר זמן יעיל ומאפשרת לבידול מדויק יותר בין שתיים או יותר סמנים. הדיון כולל עצות לפתרון בעיות וייעוץ לקידום הצלחה.

Introduction

אימונוהיסטוכימיה היא תהליך לאיתור אנטיגנים (כלומר חלבונים) בסעיפים רקמות באמצעות נוגדנים עיקריים שלהיקשר באופן ספציפי לאנטיגנים של עניין. אימונוהיסטוכימיה הייתה חלוץ ידי JR Marrack בשנת 1934 כאשר הוא קבע כי נוגדנים יכולים למקם אנטיגנים עם סגוליות גדולות ^1. החל בשנת 1942, חלק בראשון מבחנה באמצעות נוגדני ניאון לדמיין אימונוהיסטוכימיה פורסם ^2,3, לאחר שלראשונה במחקר histochemical vivo פורסם ^4. במהלך 1960, שלושה עשורים לאחר הקמתה של שיטות immunohistochemical, נוגדני אנזים מצומדות- החלו לשמש כחומרים כימיים משניים. שיטות אלה בו-זמנית ובאופן עצמאי פותחו בצרפת ובארה"ב ^5,6. היום, במגוון רחב של נוגדנים מספק אינספור אפשרויות ללימודי אימונוהיסטוכימיה ^7.

"> המטרה הכללית של התכתבות זו היא לספק הקדמה קצרה למכתים immunohistochemical, זה לא אמור להיות סקירה מקיפה וממצה של טכניקה זו בשיטה שתוארה, טכניקות immunohistochemical לשני אנטיגנים מוצגות (סמנים למיקרוגלים ו. הנוירונים) להכתמה של paraformaldehyde perfused, מוח סוכרוז cryoprotected, cryosectioned חולדה. המכתים immunohistochemical מתחיל עם חסימת אנטיגן ספציפי מחייב להפחית מכתים רקע. בשלב הבא, דגירה עם נוגדן ראשוני מאפשרת לכריכה לאנטיגן ספציפי ברקמות. בעקבות הנוגדן הראשוני, נוגדן אחר, המכונה נוגדנים משני, מוחל על קישור הנוגדן הראשוני לאות הדמיה מצומדות ^8. הנוגדנים משני מטרות אימונוגלובולין G תחום (IgG) הספציפי למין שבו הנוגדן הראשוני הועלה. הנוגדנים משני מגבירים את האות של הנוגדן הראשוני מאז אזורי Fab של tהוא לאגד נוגדנים משני לאתרים מרובים בתחום IgG של הנוגדן הראשוני. כך או אנזימים או מולקולות ניאון מצומדת לאזורי _ג 'לנוגדנים משני תאפשר להדמיה. לדוגמא, נוגדן ראשוני אנטי-Iba1 ארנב הוא מולקולת IgG ארנב ספציפית לIba1. כאשר IgG נגד ארנב החמור מיושם כנוגדנים משני, זה יהיה לזהות ולהיקשר לאזורים המרובים של אנטי-Iba1 IgG הארנב (ראה איור 1). הנוגדן החמור ניתן דמיין בשיטות שונות. התכתבות זו מתמקדת בזיהוי של fluorophore מצומדת לנוגדנים משני, שמזהה את הנוגדן הראשוני, להדמיה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. באימונוהיסטוכימיה ניאון, כתם גרעיני כגון Hoechst או DAPI יכול לשמש כדי לחזות את כל הגרעינים.

איור 1: Schייצוג ematic של טכניקות תיוג נוגדן עקיף מול ישיר. נוגדנים נקשרים לאנטיגן של עניין ויכולים להיות מוגבר על ידי נוגדנים משני הועלו נגד המינים של הנוגדנים הראשוניים. טכניקה זו יכולה להתבצע באמצעות מורכבת avidin ביוטין (ABC) להגברה וDAB להדמיה (), או נוגדנים מצומדות ישירות ניאון משניים (B). לחלופין, נוגדנים ראשוניים ניתן מצומדות ישירות עם תגים רבים ושונים, ובכלל זה ביוטין או fluorophore (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שיטה חלופית להדמיה של מכתים immunohistochemical משתמשת 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB; ראה איורים 1 ו -2). זה שונה מקרינה באמצעות biotinylated אוperoxidase סוס-צנון (HRP) נוגדנים משני מצומדות, המספק אנזים להמיר DAB למשקע שנראה תחת מיקרוסקופ שדה הבהיר. במקרים שבם אנטיגן יחיד הוא של ריבית או הכתמה נדרשה להיות ארוך טווח, DAB יכול להיות יותר מתאים מאשר צביעת ניאון. עם זאת, מכתים DAB אינו מתאים היטב לבידול בין סמנים מרובים, במיוחד אם שני אנטיגנים גרעיניים הם עניין. לקבלת מידע על חומרי DAB ושינויי פרוטוקול, להתייעץ טבלת 1. לחלופין, כלוריד tetrazolium הכחול ניטרו / 5-Bromo-4-כלורו-3-indolyl פוספט (NBT / BCIP) יכול לשמש כדי לחזות phosphatase אלקליין (AP) מצומדות המשני נוגדן.

איור 2:. נציג תמונות של חלקים משופרים ניקל DAB שכותרת יחיד חולדה רקמת מוח מוח החולדה sections שכותרתו עם DAB משופר ניקל לIba1 () ופאן-עצבי (ב ') לאפשר לניתוח של מיקרוגליה או נוירונים לבד לטווח ארוך. בר סולם 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

יש לקחת בחשבון את השפע המשוער של אנטיגן של עניין בתוך הרקמה מנותחת. שיטות עקיפות (כמתואר לעיל) הן שימושיות למטרות עם שפע נמוך. כאשר אנטיגן של עניין הוא בשפע גבוה, יכולות להיות מיושמות שיטות ישירות. שיטות ישירים כרוכות נוגדן ראשוני שמצומדות ישירות לאות הדמיה, ובכך אין צורך בנוגדנים משני. שיטה זו מפשטת את תהליך הצביעה, אך מבטלת את ההגברה הושגה על ידי שיטות עקיפות. באמצעות נוגדן ראשוני מצומדות ישירות גם מבטל תגובה צולבת של נוגדנים משניכאשר כפול תיוג.

תקשורת זה מפרטת את הפרוטוקול לתיוג כפול עם Iba1 ו( פרטים בטבלה 1) פאן-עצביים. Iba1 כתמי מיקרוגלים במדינות הפעלה רבות, כוללים מסועף, היפר-מסועף, מופעל, אמבואידית, ומוט. כתמים פאן-עצביים האקסונים, דנדריטים, וסומה עצביות. מאז Iba1 מכתים ביותר המיקרוגלים ומטרות פאן-עצביות נוירון, זה שילוב של כתמים הוא שימושי בהשגת הבנה רחבה של אינטראקציות מיקרוגלים-נוירון.

לסיכום, מכתים immunohistochemical מסתמך על הבחירה זהירה של נוגדנים. כמו שאלת המחקר הופכת להיות יותר ספציפית, נוגדנים העלו לאנטיגנים חלופיים עשויים להיות רצויים. כדי למקד את מצב הפעלת microglial ספציפי, אחד יכול לבחור להשתמש נוגדני CD45 או CD68, ולא Iba1. יתר על כן, בעבודה עם עכברים, F4 / 80 עשוי לספק תוצאות הדרושות. כמו כן, גורמים עצביים יכולים להיות ממוקדים במיוחד עם דלקת מפרקים שגרונית נוגדניםised נגד הגרעין, סינפסה (מראש או שלאחר), האקסון, וחרוט צמיחה. בנוסף, יש סמנים אחרים שמבדילים גיל נוירון (פעמיים cortin, NeuN), והתחדשות עצבית (GAP-43).

Protocol

הערה: כל הנהלים בוצעו בעמידה בוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת אריזונה. ניתן למצוא רשימה של חומרים וציוד מומלצים בטבלה 1.

1. רקמות הכנה

1. זלוף
   1. להרדים מכרסם עם מנת יתר של נתרן pentobarbital (25 מ"ג / קילוגרם, IP), ותנקב transcardially עם מי מלח פוספט (PBS) עד exsanguinated לחלוטין (דקות 3-5) בקצב זרימה של 8 מיליליטר / דקה. לקבלת הוראות זלוף המעמיק, לראות גייג 'ואח' 2,012 ^9.
   2. מייד לאחר הדחת PBS, לתקן רקמות על ידי מרוסס עם paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS במשך 15-20 דקות בקצב זרימה של 8 מיליליטר / דקה.
   3. הסר מוח ומקום paraformaldehyde 4% למשך 24 שעות, ואחריו פתרונות סוכרוז מדורגים (15%, 30%, 30%, ברצף; הוכן בטריס שנאגרו מלוח) בשעה 4 מעלות צלזיוס. העבר את המוח לo פתרון סוכרוז הבאהnly אחרי המוח שקוע בכל פתרון. הערה: בדרך כלל, 5 ימים בכל פתרון הוא זמן מספיק לרקמה לשקוע.
2. הקפאת רקמה וCryosectioning
   1. מניחים את המוח בהטבעה בינוני, כגון מתחם OCT ולצלול באיזופנטאן בטמפרטורה של -35 מעלות צלזיוס. לאפשר המוח להקפיא למינימום של 10 דקות, ולאחר מכן לאחסן ב -80 ° C. בעיות עלולים להתעורר אם בדיקה לטמפרטורה לא נלקחה; אנא ראה דיון למידע על פתרון בעיות.
   2. לחתוך קטעי עטרה סידוריים בעובי של 20 מיקרומטר וטמפרטורה של -20 ° C. לאסוף רקמה על גבי שקופיות טעונות חיובי. חלקים במוח עשויים להיות ממוקמים בתיבת שקופיות עטופות בנייר בתוך שקית עם רוכסן וטווח ארוך מאוחסן ב -80 ° C. שיטה זו של אחסון יוצרת גבול כפול כדי למנוע חשיפה לאוויר וכפור.

עיבוד 2. רקמות

הערה: r ציוד דוגמא וחומריםequired מכתים מוצג באיור 3. חלופות זמינות, לעומת זאת, תמונות אלה יסייעו אלה חדשים מכתים immunohistochemical לדמיין פריטים מתאימים לפני הרכישה.

איור 3: פריטים לדוגמא נדרשים למכתים immunohistochemical הקופסה השחורה שמוצגת ב() היא תא לחות אידיאלי לimmunofluorescence, כשקופיות מוגנות מפני אור ללא הצורך לעטוף את התיבה על נייר.. בעקבות חתך, ניתן לאחסן שקופיות בתיבה כגון התיבה הצהובה שמוצג (B). עטיפת הקופסה בחוזקה בנייר כסף ומניח בשקית עם רוכסן לפני המקפיא מסייעת להגן על דגימות רקמה מכוויות במקפיא. דוגמא של שקופיות ניתן ב( C), עם מנות שונות מכתימה מתוארות ב( ד) ו- (E ). Coverslips יכול להשתנות בגודל ובעובי (F), לעומת זאת 1.2 coverslips העבה לספק תוצאות הדמיה נחמדה ברוב המיקרוסקופים זקופים וconfocal. עיפרון כגון שמוצג ב( G) ניתן להשתמש בתווית שקופיות. יש להימנע סמנים קבע כדיו יכול לרוץ, המשפיעים על שני כתמים והיכולת לקבוע מה הוא המדגם. עט פאפ מיני כגון שמוצגים ב( H) מאפשר גבול דוחה להיגרר בשקופיות.

1. הכנת שקופיות
   1. הסר שקופיות מהמקפיא ולהפשיר בטמפרטורת חדר.
      1. אופציונאלי: אם חלקים שרחפו בעבר משקופיות, שקופיות למקם מופשרים בתנור על 60 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 4 שעות כדי למנוע קטעי רקמה מצף את שקופיות.
   2. שקופיות מקום במעמד שקופית ומנה מקבילה.
   3. לשטוף שקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות כל אחד, שינוי פתרון בין שוטף. מהצעד הזה קדימה, להימנע מצורך sectiתוספות ללא נוזל לפרקי זמן ארוכים. הערה: אם חלקים להתייבש, מכתים רקע הוא גדל ולא יכול להיות מושגת באופן מהימן נתונים משמעותיים.
2. מכתים רקמות
   1. בתיבה מכתימה אור חזק, ליצור "תא לחות" עם רקמות ונטולי מוך טבול במים ללא יונים.
   2. ייבש את הקצוות של השקופית עם רקמה ונטולת מוך, להשתמש בעט פאפ מיני להפוך גבול דוחה נוזלים בקצה מאוד של השקופית, מסעיפי רקמות. גבול זה צריך להבטיח שטח נרחב בין המניסקוס של הנוזל והקצה של רקמה, כך שמתח פנים אינו משפיעים על צביעה.
      הערה: גבול דוחה עט פאפ יכול להיות מיושם לפני 2.1.3 אם הנוגדנים של עניין אינו דורשים אחזור אנטיגן מיקרוגל. אם עט פאפ כבר יושם עד לכביסה בPBS, השלמות של גבול נוזל דוחה חייבת להיבדק בשלב זה. השתמש בעט המיני-פאפ כדי למלא פערים בכל הגבול.
   3. עם שקופיות הניחו אופקית, אנטיגן ספציפי בלוק הכריכה בדוגרי 4% בסרום V / V בPBS (פתרון בלוק). פיפטה 300 μl של פתרון לחסום לכל שקופית עבור 1 שעות בטמפרטורת חדר. ודא הפתרון לחסום משתרע על עט פאפ בקצה של השקופית ומכסה לחלוטין את הרקמה כדי למנוע הכתמה אחידה שנגרמה על ידי מתח ליד רקמת פני השטח.
      1. השתמש בסרום מאותו המין שבי נוגדנים משני נעשה. הערה: בהליך זה, נוגדנים משני נעשים בחמור, ובכך חמור בדם משמש. אם נוגדנים משני משניים או יותר מינים שונים משמשים, כולל סרום מכל מין.
   4. נוגדן ראשוני פיפטה על גבי שקופיות. הערה: ריכוזי נוגדן מכתים זה כבר מותאם ליום 1 ב: 5,000 ו 1: 500 לIba1 ופאן-עצבי, בהתאמה. ריכוזים אלה נמצאו להראות מכתים משמעותיים עם היעדר מכתים רקע.
      1. לדלל פתרון לחסום לסרום 1% ב- PBS ולהוסיף נוגדנים עיקריים. פיפטה 300 μl של פתרון נוגדן ראשוני בסרום 1% לכל שקופית. שוב, להבטיח את הנוזל הוא לקצה של עט פאפ. דגירה הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
      2. כולל שלוש שקופיות שליטה: אחד שמכיל נוגדנים לא Iba1 ולא פאן-עצביים, אחד עם Iba1 ללא נוגדנים פאן-עצביים, ואחד עם נוגדן פאן-עצבי ללא Iba1. כתם שקופיות אלה באותו הטווח עם אותו הפתרונות, אך להשמיט את הנוגדנים הראשוניים כדי לבדוק את הלא ספציפי מחייב של הנוגדנים משני.
   5. למחרת בבוקר, לשטוף שקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות כל אחד, שינוי פתרון בין שוטף.
   6. נוגדני ניאון הם רגיש לאור, ולכן, מהצעד הזה קדימה, לצמצם את החשיפה לאור על ידי הבטחת מכולות לשטוף הם עטופים בנייר כסף ותיבות הכלאה הם או שחורים או מודגרות בחושך. פיפטה נוגדנים משני המתאימים בכל השקופיות ודגירה60 דקות בטמפרטורת חדר בריכוז של 1: 250 בפתרון בלוק (ראו שלב 2.2.3) ב" תא לחות "אור חזק (ראה שלב 2.2.1).
      1. השתמש נוגדנים משני של אורכי גל שונים. כאן, לארנב נוגדן הראשוני אנטי-Iba1, להשתמש ארנב אנטי חמור 594 כנוגדנים משני המתאימים. לעכבר נוגדן הראשוני אנטי-פאן-עצבי, להשתמש חמור אנטי עכבר 488 כשני הנוגדנים המתאימים. לחלופין, להשתמש נגד ארנב 488 ואנטי עכבר 594.
   7. לשטוף שקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות כל אחד.
   8. אופציונאלי: לבצע מכתים גרעיני.
      1. מקום בHoechst (או כתם גרעיני אחר) בריכוז של 0.03 מיקרוגרם / מיליליטר בH מזוקק פעמיים ₂ 0 בדיוק 60 שניות.
      2. לשטוף שקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות כל אחד.
   9. לשטוף בDDH ₂ 0.
3. Coverslipping
   1. שקופיות coverslip עם הרכבה בינונית מימית, כגון פלואורידomount-G או ProlongGold. דואג להסיר את כל הבועות באמצעות מוליך כותנה שקצה.
      הערה: ניתן להשתמש בסוכני הרכבה אחרים, גבוה עם זאת לדמם דרך בין הצבעים שצוין על ידי כמה בימים של coverslipping.
   2. השתמש ברור לק כדי לאטום את הקצוות, מניעת החלקים מהתייבשות בשל התאדות. לאפשר לק להתייבש במכל אור חזק בעוד שקופיות להישאר שטוחות ובטמפרטורת חדר, ולאחר מכן לאחסן במכל אור חזק העטוף בנייר כסף על 4 מעלות צלזיוס.

3. הדמיה הרקמה הצבעונית

1. מיקרוסקופית
   1. לאפשר לק להתייבש במשך שעה אחת לפחות לפני תחילת מיקרוסקופיה, שאמור להתקיים בחדר חשוך.
   2. לרכוש photomicrographs באמצעות confocal או מיקרוסקופ מחקר עם מקור אור ניאון וקובץ מצורף מצלמה דיגיטלית. שימוש בתוכנה הנלווית, להגדיר את החשיפה לכל אורך גל - 405, 488, ו -594 - בנפרד. הערה: במעמיק הוראות הדמיה צריכה להיות זמין באינטרנט מיצרן מיקרוסקופ.
   3. לרכוש photomicrographs בכל ערוץ מבלי להזיז את החלקים או התאמת המוקד. קח תמונות בצבע, או לחלופין בגוונים אפורים ולהמיר לצבע אחר.
      הערה: צבע או תמונות בגווני אפור מכל ערוץ יכול להיות אסוף שבלאחר עיבוד.
   4. ודא סעיפי רקמות שאינם חשופים לאור הסביבה או אור מיקרוסקופי לפרקי זמן ארוכים, כמו צילום הלבנת של החלקים תתרחש. כדי להימנע מכך, להגדיל את זמן חשיפה ולא עוצמת אור / לייזר הגדלת.
   5. אל תכבו את מקור אור הניאון בתוך 30 דקות של להיות מופעל.
      הערה: החלפת המקור לסירוגין ברצף מהיר עלולה להפחית את תוחלת החיים של הנורה הניאון.

תוצאות

תוצאות זה פרוטוקול מכתים בסעיפים רקמות מוח חולדה שכותרתו fluorescently מיקרוגלים בערוץ 594 (אדום) ותאי עצב שהכותרת בערוץ 488 (הירוק; ראו איור 4). אם כתם גרעיני נעשה, זה ייראה בערוץ 405 (הכחול). ניתן לצלם תמונות בערוצים שונים ומעולף להשוואה ישירה של שלושה ערוצים, או בין כל ש...

Discussion

המטרה הכללית של תקשורת זו הייתה להציג נהלי אימונוהיסטוכימיה לקורא. לשם כך, את הדוגמא של דו-תיוג עם Iba1 ואנטיגנים פאן-עצביים להתבונן מיקרוגלים ונוירונים בparaformaldehyde perfused, שימש מוח החולדה cryoprotected, cryosectioned סוכרוז.

טכניקה זו יכולה להיות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides	Fisher Scientific	22-034-979	Used for tissue mounting (1.2.2)
Oven	Thermo Scientific	51028112	Used for tissue drying (2.1.1)
Mini Pap pen	Life Technologies	00-8877	Used in step 2.2.2
Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish	Fisher Scientific	22-149-429	Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8)
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666-A	Used for drying slides (2.2)
Black Staining Box	Ted Pella	21050	Used for blocking and staining steps (2.2)
Normal Donkey Serum	Fisher Scientific	50-413-253	Used for block and antibody incubation (2.2)
Mouse α-Pan-neuronal	Millipore	MAB2300	Used for primary antibody (2.2.4)
Rabbit α-Iba1	Wako Chemical	019-19741	Used for primary antibody (2.2.4)
Donkey α-rabbit 594	Jackson ImmunoResearch	711-585-152	Used for secondary antibody (2.2.6)
Donkey α-mouse 488	Jackson ImmunoResearch	715-545-150	Used for secondary antibody (2.2.6)
Caterer's foil	Any	N/A	Used in steps 1.2.2 and 2.3.2
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	Used for coverslipping (2.2.8)
Coverslips	Fisher Scientific	12544E	Used for coverslipping (2.2.8)
Clear Nail Polish	Any	N/A	Used for coverslipping (2.2.8)
Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal)	Carl Zeiss	N/A	Used for imaging (3)
Axioskop A2	Carl Zeiss	N/A	Used for imaging (3)
CitriSolv	FisherScientific		For DAB protocol
ABC	Vector Laboratories	PK-6100	For DAB protocol
DAB Peroxidase kit	Vector Laboratories	SK-4100	For DAB protocol
Biotinylated horse α-rabbit IgG	Vector Laboratories	BA-1100	For DAB protocol
Biotinylated horse α-mouse IgG	Vector Laboratories	BA-2001	For DAB protocol
30% Hydrogen Peroxide	FisherScientific	H325-500	For DAB protocol
Wheaton slide racks and staining dishes	TedPella	21043	For DAB protocol
Masterflex perfusion pump and tubing	Cole-Parmer		Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2)
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65	Used for tissue freezing (1.2.1)
Thermometer (-50 to 50 C)	Fisher Scientific	15-059-228	Used for tissue freezing (1.2.1)
Cryostat	Leica	CM3500S	Used for tissue sectioning (1.2.2)
Staining Dish, Plastic with 2 Lids	Grale Scientific	353	For antigen retrival
20 Place Staining Rack, Slides Horizontal	Grale Scientific	354	For antigen retrival
Microwave	Any	N/A	For antigen retrival