Primaire pour Immunohistochimie sur tissus Cryosectioned cerveau de rat: Exemple coloration pour microglies et les neurones

Résumé

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Résumé

Immunohistochimie est une technique largement utilisée pour détecter la présence, l'emplacement et l'abondance relative des antigènes in situ. Ce protocole de niveau d'introduction décrit les réactifs, le matériel et les techniques nécessaires pour compléter la coloration immunohistochimique du tissu cérébral des rongeurs, en utilisant des marqueurs pour les microglies et les éléments neuronaux comme un exemple. Plus précisément, ce document est un protocole étape par étape pour la visualisation fluorescente des microglies et les neurones via immunohistochimie pour Iba1 et Pan-neuronale, respectivement. Fluorescence double marquage est particulièrement utile pour la localisation de multiples protéines dans le même échantillon, en fournissant la possibilité d'observer avec précision les interactions entre les types de cellules, des récepteurs, des ligands, et / ou de la matrice extracellulaire par rapport à l'autre ainsi que des protéines co- localisation à l'intérieur d'une seule cellule. Contrairement à d'autres techniques de visualisation, la fluorescence immunohistochimie intensité de la coloration peut diminuer enles semaines ou mois suivants coloration, à moins que des précautions appropriées soient prises. Malgré cette limitation, dans de nombreuses applications fluorescence double marquage est préférée à d'autres solutions telles que la 3,3'-diaminobenzidine (DAB) ou la phosphatase alcaline (AP), en tant que fluorescence est plus efficace du temps et permet la différenciation plus précise entre deux ou plusieurs marqueurs. La discussion inclut des trucs et conseils pour favoriser la réussite de dépannage.

Introduction

L'immunohistochimie est un procédé pour la détection d'antigènes (par exemple des protéines) dans des coupes de tissu en utilisant des anticorps primaires qui se lient spécifiquement à des antigènes d'intérêt. L'immunohistochimie a été lancée par JR Marrack en 1934 quand il a déterminé que les anticorps peuvent localiser des antigènes avec une grande spécificité ^1. A partir de 1942, une partie de la première des études in vitro utilisant des anticorps fluorescents pour visualiser immunohistochimie ont été publiés ^2,3, après quoi la première étude in vivo histochimique a été publié ^4. Au cours des années 1960, trois ans après le début de méthodes immunohistochimiques, des anticorps conjugués enzymatiques ont commencé à être utilisés comme réactifs secondaires. Ces méthodes ont été développées simultanément et indépendamment en France et aux Etats-Unis ^5,6. Aujourd'hui, un large éventail d'anticorps offre des possibilités infinies pour les études d'immunohistochimie ^7.

"> L'objectif global de cette correspondance est de fournir une brève introduction dans la coloration immunohistochimique; il est pas censé être un examen complet et exhaustif de cette technique dans le procédé décrit, des techniques d'immunohistochimie pour deux antigènes sont présentés (marqueurs de la microglie et. neurones) pour la coloration de paraformaldehyde perfusé, le saccharose cryoprotégés, le cerveau de rat cryosectioned. La coloration immunohistochimique commence par bloquer la liaison pour réduire la coloration de fond antigène non spécifique. Ensuite, l'incubation avec l'anticorps primaire permet de se lier à un antigène spécifique dans le tissu. À la suite de l'anticorps primaire, un autre anticorps, appelé anticorps secondaire, est appliquée pour lier l'anticorps primaire à un signal de visualisation conjugué ^8. L'anticorps secondaire cible de l'immunoglobuline G (IgG) domaine spécifique de l'espèce dans laquelle l'anticorps primaire a été soulevée. L'anticorps secondaire amplifie le signal de l'anticorps primaire depuis les régions Fab de til anticorps secondaire se lient à des sites multiples sur le domaine IgG de l'anticorps primaire. Chacune des enzymes ou des molécules fluorescentes conjuguées aux régions F _c de l'anticorps secondaire permettent la visualisation. Par exemple, un anticorps primaire anti-lapin Iba1 est une molécule d'IgG de lapin spécifique pour Iba1. Lorsque âne anti-IgG de lapin est appliqué comme un anticorps secondaire, on reconnaître et se lier à de multiples régions de l'anticorps de lapin anti-IgG Iba1 (voir figure 1). L'anticorps peut être visualisé âne par divers procédés. Cette correspondance met l'accent sur la détection d'un fluorophore conjugué à l'anticorps secondaire qui reconnaît l'anticorps primaire, pour la visualisation par microscopie fluorescente. En immunohistochimie fluorescent, un colorant nucléaire Hoechst ou comme DAPI peut être utilisée pour visualiser tous les noyaux.

Figure 1: Schreprésentation hématique des vs. directe des techniques de marquage d'anticorps indirecte. anticorps se lient à l'antigène d'intérêt et peut être amplifié par des anticorps secondaires dirigés contre les espèces des anticorps primaires. Cette technique peut être effectuée en utilisant le complexe avidine-biotine (ABC) pour l'amplification et pour la visualisation DAB (A), ou un anticorps secondaire fluorescent directement conjugué (B). Alternativement, des anticorps primaires peuvent être directement conjugués avec de nombreuses balises différentes, y compris la biotine ou un fluorophore (C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Une méthode alternative pour la visualisation de la coloration immunohistochimique utilise le 3,3'-diaminobenzidine (DAB; voir les figures 1 et 2). Cela diffère de la fluorescence en utilisant un ou biotinyléla peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à un anticorps secondaire, qui fournit une enzyme pour convertir DAB à un précipité qui est visible en microscopie à fond clair. Dans les cas où un seul antigène est d'intérêt ou de coloration est appelé à être de longue durée, DAB peut être plus approprié de coloration fluorescente. Cependant, DAB coloration est pas bien adapté pour la différenciation entre des marqueurs multiples, en particulier si deux antigènes nucléaires présentent un intérêt. Pour plus d'informations sur les matériaux de DAB et les modifications de protocole, consulter le tableau 1. En variante, un groupe nitro bleu de chlorure de tétrazolium / 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT / BCIP) peut être utilisée pour visualiser une phosphatase alcaline (AP) conjugué secondaire anticorps.

Figure 2:. Des images représentatives de sections individuelles marqué DAB nickel améliorée rat tissus du cerveau de rat cerveau tilisezctions qui sont étiquetés avec des DAB de nickel-amélioré pour Iba1 (A) et Pan-neuronale (B) permettre une analyse de longue durée de la microglie ou neurones seul. Barre d'échelle 20 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Il faut considérer l'abondance estimée de l'antigène d'intérêt dans le tissu analysé. Les méthodes indirectes (comme décrit ci-dessus) sont utiles pour cibles avec une faible abondance. Lorsque l'antigène d'intérêt est en grande abondance, méthodes directes peuvent être appliquées. Les méthodes directes impliquent un anticorps primaire qui est directement conjugué à un signal de visualisation, et donc pas d'anticorps secondaire est exigée. Cette méthode simplifie le processus de coloration, mais élimine l'amplification réalisée par des méthodes indirectes. Utilisation d'un anticorps primaire conjugué directement élimine également la réactivité croisée des anticorps secondaireslors d'un double étiquetage.

Cette communication détaille le protocole pour double marquage avec Iba1 et Pan-neuronales (détails dans le tableau 1). Iba1 colore la microglie dans de nombreux états d'activation, notamment ramifiée, hyper-ramifié, activé, amoeboid, et la tige. Taches Pan-neuronales neuronale axones, dendrites, et Soma. Depuis Iba1 taches les plus microglie et les objectifs pan-neuronales le neurone, cette combinaison de taches est utile à acquérir une large compréhension des interactions neurone-microglie.

En somme, la coloration immunohistochimique repose sur la sélection rigoureuse des anticorps. Comme la question de la recherche devient plus spécifique, des anticorps dirigés contre les antigènes de rechange peuvent être souhaités. Pour cibler un état d'activation de la microglie spécifique, on peut choisir d'utiliser CD45 ou CD68, plutôt que Iba1. En outre, en travaillant avec des souris, F4 / 80 peut fournir les résultats nécessaires. De même, les éléments neuronaux peuvent être spécifiquement ciblées avec des anticorps raised contre le noyau, synapse (avant ou après), axone, et le cône de croissance. En outre, il ya d'autres marqueurs qui différencient l'âge du neurone (Double-Cortin, NeuN), et la régénération neuronale (GAP-43).

Protocole

NOTE: Toutes les procédures ont été effectuées en conformité avec le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) de l'Université de l'Arizona. Une liste des matériaux et équipements recommandés peut être trouvé dans le tableau 1.

1. Préparation des tissus

1. Perfusion
   1. Euthanasier rongeur avec une overdose de pentobarbital sodique (25 mg / kg, IP), et perfuser transcardiaque avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS) jusqu'à complètement exsangue (3-5 min) à un débit de 8 ml / min. Pour obtenir des instructions de perfusion en profondeur, voir Gage et al 2012 ^9.
   2. Immédiatement après PBS chasse d'eau, réparer les tissus par perfusion avec 4% de paraformaldehyde dans PBS pendant 15-20 min à un débit de 8 ml / min de débit.
   3. Retirer le cerveau et dans 4% de paraformaldehyde pendant 24 heures, suivie de solutions de saccharose graduées (15%, 30%, 30%, en séquence, préparé dans une solution saline tamponnée tris) à 4 ° C. Transférer le cerveau postérieur à la solution de saccharose oeuls après que le cerveau a sombré dans chaque solution. Note: Habituellement, 5 jours dans chaque solution est suffisamment de temps pour les tissus de couler.
2. La congélation de tissus et Cryosectioning
   1. Placez le cerveau en milieu d'inclusion, tel que le composé PTOM et plonger dans l'isopentane à une température de -35 ° C. Laisser le cerveau de geler pendant un minimum de 10 min, puis stocker à -80 ° C. Des problèmes peuvent survenir si la diligence à la température ne sont pas prises; s'il vous plaît voir la discussion des informations de dépannage.
   2. Couper coupes sériées coronales d'une épaisseur de 20 um et une température de -20 ° C. Prélever des tissus sur des lames chargées positivement. coupes de cerveau peuvent être placés dans une boîte de diapositives enveloppé dans une feuille dans un sac zip-top et à long terme conservés à -80 ° C. Cette méthode de stockage crée une double frontière pour prévenir l'exposition à l'air et au gel.

2. Traitement des tissus

NOTE: Exemple équipements et matériaux rbligatoire pour la coloration sont présentés dans la figure 3. Des alternatives sont disponibles, cependant, ces images vont aider les nouveaux à la coloration immunohistochimique de visualiser les éléments appropriés avant d'acheter.

Figure 3: Exemple éléments nécessaires pour la coloration immunohistochimique La boîte noire montré en (A) est une chambre d'humidité idéal pour immunofluorescence, sous forme de diapositives sont protégés de la lumière sans la nécessité d'envelopper la boîte sur une feuille.. Après sectionnement, diapositives peuvent être stockés dans une boîte comme la boîte jaune montré en (B). Envelopper la boîte hermétiquement dans du papier et placer dans un sac zip-top avant la congélation permet de protéger les échantillons de tissus de brûlures de congélation. Un exemple de lames est donnée en (C), avec des plats différents de coloration décrits dans (D) et (E ). Lamelles peuvent varier en taille et en épaisseur (F), cependant 1.2 lamelles épaisses fournissent des résultats d'imagerie de belles sur la plupart des microscopes droits et confocale. Un crayon telle que celle représentée dans (G) peut être utilisé pour marquer les diapositives. Marqueurs permanents doivent être évités car l'encre peut fonctionner, affectant à la fois la coloration et la capacité de déterminer ce que l'échantillon est. Un mini stylo pap tel que représenté dans (H) permet une frontière imperméable à tirer sur des lames.

1. Préparation de lames
   1. Retirer les lames du congélateur et décongeler à température ambiante.
      1. Facultatif: Si sections ont déjà flotté à partir de diapositives, placez diapositives décongelés dans un four à 60 ° C pendant plus de 4 heures pour aider à prévenir des coupes de tissus de flotter hors diapositives.
   2. Placer les lames dans un rack de diapositives et plat correspondant.
   3. Laver les lames trois fois dans PBS pendant 5 min de chaque solution entre les lavages changer. De ce pas en avant, éviter d'avoir sections sans liquide pendant de longues périodes de temps. Note: Si les sections se dessèchent, la coloration de fond est augmentée et des données significatives ne peut pas être obtenue de manière fiable.
2. La coloration des tissus
   1. Dans une boîte de coloration étanche à la lumière, de créer une «chambre d'humidité" avec des tissus non pelucheux trempé avec de l'eau déminéralisée.
   2. Sécher les bords de la lame avec un tissu non pelucheux, utiliser un mini stylo pap à faire une bordure de répulsif des liquides à l'orée de la diapositive, loin des coupes de tissus. Cette frontière devrait garantir suffisamment d'espace entre la surface du bain de liquide et le bord du tissu de telle sorte que la tension de surface ne modifie pas la coloration.
      NOTE: Le répulsif frontière stylo pap peut être appliqué avant la 2.1.3 si les anticorps d'intérêt ne nécessitent pas de micro-ondes récupération d'antigène. Si la plume de Pap a été appliquée avant le lavage en PBS, l'intégrité de la frontière imperméable au liquide doit être vérifiée à ce stade. Utilisez un stylo mini-pap pour combler les lacunes dans la frontière.
   3. Avec glissières fixées horizontalement, la liaison bloc antigène non spécifique par incubation à 4% v / v de sérum dans du PBS (solution de blocage). Pipette 300 pi de solution de bloc par diapositive pendant 1 heure à température ambiante. Assurez-vous que la solution de bloc étend à la plume de Pap au bord de la diapositive et recouvre complètement le tissu pour éviter les taches inégale causée par la tension de surface à proximité du tissu.
      1. Utilisation sérum de la même espèce dans laquelle l'anticorps secondaire est effectué. Remarque: Dans cette procédure, les anticorps secondaires sont fabriqués en âne, et donc sérum âne est utilisé. Si des anticorps secondaires à partir de deux ou plusieurs espèces différentes sont utilisées, y compris le sérum de chaque espèce.
   4. Pipette anticorps primaire sur des lames. Remarque: Les concentrations d'anticorps pour cette coloration ont été optimisés au 1: 5000 et 1: 500 pour Iba1 et Pan-neuronale, respectivement. Ces concentrations ont été trouvées pour montrer coloration significative avec une absence de coloration de fond.
      1. Diluer la solution de bloc1% de sérum dans du PBS et ajouter des anticorps primaires. Pipeter 300 ul de solution d'anticorps primaire dans 1% de sérum par lame. Encore une fois, d'assurer le fluide est au bord de la plume de Papanicolaou. Incuber une nuit à 4 ° C.
      2. Inclure trois lames de contrôle: l'une qui contient des anticorps ni Iba1 ni Pan-neuronales, une avec Iba1 sans anticorps pan-neuronal, et l'un avec l'anticorps pan-neuronal sans Iba1. Colorer ces diapositives dans la même série avec les mêmes solutions, cependant omettre les anticorps primaires pour tester la liaison non spécifique des anticorps secondaires.
   5. Le lendemain matin, laver les lames trois fois dans PBS pendant 5 min de chaque solution entre les lavages changer.
   6. Anticorps fluorescents sont sensibles à la lumière, donc, de ce pas en avant, de minimiser l'exposition de lumière en veillant à conteneurs de lavage sont enveloppés dans des feuilles et d'hybridation boîtes sont soit noir ou incubées dans l'obscurité. Introduire à la pipette les anticorps secondaires appropriés sur toutes les diapositives et incuber60 min à température ambiante à une concentration de 1: 250 dans une solution de bloc (voir l'étape 2.2.3) dans une "chambre d'humidité" étanche à la lumière (voir l'étape 2.2.1).
      1. Utilisez Anticorps secondaires de différentes longueurs d'onde. Ici, pour le lapin d'anticorps primaire anti-Iba1, utiliser âne de lapin anti-594 comme anticorps secondaire approprié. Pour la souris de l'anticorps primaire anti-pan-neuronal, utiliser âne anti-souris 488 comme anticorps secondaire approprié. Alternativement, utiliser anti-lapin 488 et 594 anti-souris.
   7. Laver les lames trois fois dans PBS pendant 5 minutes chacun.
   8. Facultatif: effectuer une coloration nucléaire.
      1. Place à Hoechst (ou autre colorant nucléaire) à une concentration de 0,03 pg / ml dans le double H ₂ 0 distillée pendant exactement 60 secondes.
      2. Laver les lames trois fois dans PBS pendant 5 minutes chacun.
   9. Laver à ddH ₂ 0.
3. Lamelles
   1. Lames couvre-objet avec un milieu de montage aqueux, tels que Fluoromount-G ou ProlongGold. Prendre soin d'enlever toutes les bulles à l'aide d'un coton-tige.
      Note: D'autres agents de montage pourraient être utilisés, si haut purge à travers entre les colorants a été noté par certains au sein de jours de lamelles.
   2. Utilisez vernis à ongles transparent pour sceller les bords, ce qui empêche les sections du dessèchement dû à l'évaporation. Laisser sécher le vernis à ongles dans un récipient étanche à la lumière tout en diapositives restent à plat et à la température ambiante, puis stocker dans un récipient étanche à la lumière enveloppé dans une feuille à 4 ° C.

3. Imagerie Tissue Stained

1. Microscopie
   1. Laisser le vernis à ongles à sécher pendant au moins une heure avant le début de la microscopie, qui devrait avoir lieu dans une pièce sombre.
   2. Acquérir photomicrographies utilisant un microscope confocal ou d'un microscope de recherche avec une source de lumière fluorescente et un module appareil photo numérique. Utilisation du logiciel d'accompagnement, régler l'exposition pour chaque longueur d'onde - 405, 488, et 594 - séparément. Remarque: en profondeur des instructions d'imagerie devraient être disponibles en ligne à partir du fabricant de microscope.
   3. Acquérir photomicrographies dans chaque canal sans déplacer les sections ou d'ajuster la mise au point. Prendre des images en couleur, en niveaux de gris ou en alternance et de les convertir à la couleur par la suite.
      Remarque: couleur ou en niveaux de gris de chaque canal peuvent être rassemblés dans le post-traitement.
   4. Veiller à ce que les coupes de tissus ne sont pas exposés à la lumière ambiante ou la lumière microscopique pendant de longues périodes de temps, comme photo-blanchiment des sections aura lieu. Pour éviter cela, augmenter le temps d'exposition plutôt que d'augmenter l'intensité lumineuse / laser.
   5. Ne coupez pas la source de lumière fluorescente dans les 30 minutes d'être allumé.
      Note: Changement de la source sur et en dehors en succession rapide peut diminuer la durée de vie de l'ampoule fluorescente.

Résultats

Ce protocole de coloration résultats dans des coupes de tissus de cerveau de rat qui ont microglie marquées par fluorescence dans le canal 594 (rouge) et neurones marqués dans le canal 488 (vert; voir la figure 4). Si un colorant nucléaire a été fait, il apparaîtra dans le canal 405 (bleu). Les images peuvent être prises dans les différents canaux et superposées pour une comparaison directe des trois canaux, ou entre deux chaînes. De nombreuses suites logicielles d'acquisition numériques...

Discussion

L'objectif global de cette communication était d'introduire des procédures d'immunohistochimie pour le lecteur. Pour cela, l'exemple de double marquage avec Iba1 et antigènes Pan-neuronales pour observer les microglies et les neurones dans paraformaldéhyde perfusé, le saccharose cerveau cryoprotégés, rat cryosectioned a été utilisé.

Cette technique peut être adaptée pour servir des fins interminables. Un tableau d'antigènes différents dans une variété de t...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides	Fisher Scientific	22-034-979	Used for tissue mounting (1.2.2)
Oven	Thermo Scientific	51028112	Used for tissue drying (2.1.1)
Mini Pap pen	Life Technologies	00-8877	Used in step 2.2.2
Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish	Fisher Scientific	22-149-429	Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8)
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666-A	Used for drying slides (2.2)
Black Staining Box	Ted Pella	21050	Used for blocking and staining steps (2.2)
Normal Donkey Serum	Fisher Scientific	50-413-253	Used for block and antibody incubation (2.2)
Mouse α-Pan-neuronal	Millipore	MAB2300	Used for primary antibody (2.2.4)
Rabbit α-Iba1	Wako Chemical	019-19741	Used for primary antibody (2.2.4)
Donkey α-rabbit 594	Jackson ImmunoResearch	711-585-152	Used for secondary antibody (2.2.6)
Donkey α-mouse 488	Jackson ImmunoResearch	715-545-150	Used for secondary antibody (2.2.6)
Caterer's foil	Any	N/A	Used in steps 1.2.2 and 2.3.2
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	Used for coverslipping (2.2.8)
Coverslips	Fisher Scientific	12544E	Used for coverslipping (2.2.8)
Clear Nail Polish	Any	N/A	Used for coverslipping (2.2.8)
Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal)	Carl Zeiss	N/A	Used for imaging (3)
Axioskop A2	Carl Zeiss	N/A	Used for imaging (3)
CitriSolv	FisherScientific		For DAB protocol
ABC	Vector Laboratories	PK-6100	For DAB protocol
DAB Peroxidase kit	Vector Laboratories	SK-4100	For DAB protocol
Biotinylated horse α-rabbit IgG	Vector Laboratories	BA-1100	For DAB protocol
Biotinylated horse α-mouse IgG	Vector Laboratories	BA-2001	For DAB protocol
30% Hydrogen Peroxide	FisherScientific	H325-500	For DAB protocol
Wheaton slide racks and staining dishes	TedPella	21043	For DAB protocol
Masterflex perfusion pump and tubing	Cole-Parmer		Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2)
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65	Used for tissue freezing (1.2.1)
Thermometer (-50 to 50 C)	Fisher Scientific	15-059-228	Used for tissue freezing (1.2.1)
Cryostat	Leica	CM3500S	Used for tissue sectioning (1.2.2)
Staining Dish, Plastic with 2 Lids	Grale Scientific	353	For antigen retrival
20 Place Staining Rack, Slides Horizontal	Grale Scientific	354	For antigen retrival
Microwave	Any	N/A	For antigen retrival