דגם עור עכבר עוברי של תיקון פצע צלקות

Summary

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Abstract

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Introduction

פצעים בעור עוברי לרפא במהירות וscarlessly עד מאוחר בהריון ^1. תיקון פצע צלקות עוברי מתאפיין בהתחדשות של מבנה רקמה תקין ותפקוד. המעבר מצלקות לפנוטיפ הצטלקות מתרחש בשליש השלישי של הריון בבני אדם וסביב יום עוברי 18 (E18) בעכברים ^2,3. בהשוואה למבוגרים, תיקון פצע עוברי מתאפיין בepithelialization המהיר, בתצהיר רקמות חיבור, ונדידת פיברובלסטים.

מחקרים רבים הציעו הסברים אפשריים לתופעה של ריפוי פצע צלקות במהלך התפתחות עוברית מוקדמת. דלקת היא מרכיב בסיסי של תיקון פצע מבוגר; עם זאת, פצעים עובריים מתאפיינים בחוסר דלקת חריפה ^4. בין אם זה היא תוצאה של חוסר בגרות הפעילות של המערכת החיסונית בשלבים עובריים עדיין לא ברורה. מחקר שנערך לאחרונה הציע כי הבדלים בשפע, המחצלתurity, ותפקוד של תאי פיטום בE15 לעומת עור עוברי E18 עשוי להיות אחראים למעבר מפנוטיפ צלקות, לפחות בעכבר ^3. מחקרים אחרים מניחים כי הבדלים בתכונות והשפע של מקרופאגים פצע העובריים והבוגרים אחראים ליצירה מחדש של מטריצה ​​הנורמלית תאית (ECM) במהלך תיקון פצע עוברי ^5.

הבדלים בגורמים סביבתיים במהלך התפתחות עוברית ובוגרת עשויים להשפיע גם על תיקון פצע. Longaker ועמיתיו הראו כי נוזל פצע מהעובר הוא בעל רמות גבוהות של פעילות גירוי-חומצה היאלורונית בהשוואה לאף אחד במבוגרי פצע נוזל ^6. כתוצאה מכך, רמות גבוהות יותר של חומצה היאלורונית, glycosaminoglycan שמקדם מייקרו-סביבה תורם לתנועתיות של תאים והתרבות, בסביבת הפצע העוברית יכולות להיות אחראית לפנוטיפ הצלקות ראה במהלך התפתחות עוברית מוקדמת. קווים אחרים של נקודת ראיות לכך שפטהסביבת פצע l היא יחסית hypoxemic ושקוע בנוזל מי שפיר סטרילי עשיר בגורמי גדילה ^7. עם זאת, אין תשובה סופית כבר סיפקה לאירוע קריטי או גורם בעובר שמפעיל את המעבר מהתחדשות צלקות לתיקון fibrotic.

הבנת המנגנונים אחראים לריפוי צלקות בעובר מחייבת מודל מדויק ושחזור. כאן אנו פירוט מודל לשחזור של ריפוי צלקות עוברי פצע בdorsum של E16.5 (צלקות) ועוברי E18.5 עכבר (הצטלקות). בנוסף, שינויים קלים של מודל זה יכול להיות מנוצל כדי לבצע מספר מחקרים נוספים, כגון ניתוח ביטוי גנים מפצעים עובריים ^ו8,9 עור. בהתחשב בכך שהריונות בעיתוי המדויק הם קריטיים לסיכום מוצלח של מודל ריפוי זו עוברי צלקות פצעים, אנחנו גם פירוט הפרוטוקול שלנו להריונות superovulation מתוזמן.

Protocol

הערה: כל ההליכים המתוארים במאמר זה מבוצעים על פי הנחיות שנקבעו על ידי סטנפורד המנהלי הלוח במעבדת טיפול בבעלי חיים (APLAC).

1. מתוזמן הריונות - טכניקת Superovulation (איור 1)

הערה: תזמון מדויק גיל ההריון של עוברי עכבר לניתוח עוברי בE16.5 וE18.5 היא בעל חשיבות קריטית. בפירוט שסעיף זה הפרוטוקול שלנו לתזמון הריונות עכבר תוך שימוש בסרום בהריון סוסות (PMS) וזריקות גונדוטרופין כוריוני האנושי (HCG) כדי לגרום לsuperovulation.

1. להזריק נקבות עכברים (<5 לכלוב) intraperitoneally (IP) עם 3.0-5.0 יחידות בינלאומיות (IU) של PMS בהיקף של 100 μl PBS 1:00-15:00 ליום 1.
2. בין שעתי 12:00 ו14:00 יום 3 (ארבעים וחמישה עד 47 שעות לאחר הזרקת PMS), להזריק נקבות עכברי IP עם 3.0-5.0 IU של HCG בהיקף של 100 μl PBS.
   הערה: גורמת הזרקת HCG ביוץ לאחר הזרקה כ 12 שעות.
3. מייד לאחר זריקות HCG, להזדווג עם נקבות גברים בגילים 8-16 שבועות.
   הערה: אנחנו בדרך כלל למקם את שתי נקבות לכלוב של זכרים בודדים.
4. נקבות נפרדות מזכרים בבוקרו של יום 4 (6:00-10:00) ושיא כE0.5 גיל העובר.
   הערה: ניתן לבדוק תקעי הנרתיק בזמן הזה; עם זאת, ההתבוננות בתוסף נרתיק אינה מבטיחה הריון ונקבות יכולות להיכנס להריון כאשר אין תקע הוא ציין. בהתחשב בכך שההריון הוא בדרך כלל נצפים על ידי בדיקה ו / או מישוש חזותי בE16.5 וE18.5 גילאי הריון, בדיקה לתקעי נרתיק בבוקרו של יום 4 הוא לא הכרחי. מניסיוננו, ובהתאם לזן, כ 30-50% מהנשים-בייץ סופר להריון תוך שימוש בטכניקה שתוארה כאן.

pg "/>
איור 1. סכמטי לטכניקת Superovulation. הליך מראה סכמטי להריונות superovulation מתוזמן בעכברים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. ניתוח Murine העוברי (הגבי פציעה) על E16.5 וE18.5 עוברים (איור 2)

1. לפני ההליך, לנקות את כל המשטחים של חדר הניתוח וציוד עם 70% אלכוהול איזופרופיל. בנוסף, לעקר את כל הציוד כירורגי ומכשירים שישמש בהליך על ידי המעוקר. מוסדות מסוימים עשויים לאפשר השימוש הבא של עיקור חרוז חם. לפעולה, להשתמש בחבילות סטרילי הכוללות גזה ומכשירי ניתוח.
2. לגרום הרדמה באמהות בהריון (E16.5 גיל העובר או E18.5) תחת 2.5% תערובת isoflurane / חמצן ב2 ליטר לדקה ואחריו הרדמה תחזוקה בL 1 לדקה.
3. להונותהרדמה ראויה משרד, להבטיח את הרפלקסים של הדוושה העמוקה של העכבר מדוכאים ומניח את העכבר בעמדה נוטה.
4. החל משחת עיני וטרינר כגון Puralube כדי למנוע גירוי בעיניים או יובש במהלך ההליך.
5. הכן בטן על ידי מתן יישום אור של קרם מקריח לא יותר מ -30 שניות (איור 2 א).
6. הכן בטן לניתוח ספטית עם povidone- יוד ואלכוהול (איור 2 ו2C).
7. בצע laparotomy קו האמצע מתחת למיקרוסקופ באמצעות מספריים מייקרו (איור 2 ד ו 2E).
8. בעדינות לחשוף רחם והעובר שנבחר לניתוח (איור 2F).
9. להשקות שדה ניתוח עם חם (38 מעלות צלזיוס) פוספט שנאגרו מלוח (PBS) באמצעות מחט בוטה, קצה
   הערה: אחת יכול להתבצע על ידי כיפוף קצה מחט גדול נשא בזהירות. (איור 2G ו2H).
10. מקם את העובר באופן שיאפשרזה גישה מלאה לdorsum.
11. לעבור תפר מחרוזת ארנק באמצעות תפר 7-0 ניילון דרך הרחם מעל האתר של פציעת גב המיועד (איור ט 2). מחרוזת עמדת ארנק מעל אזור של dorsum לשמאל או לימין של עמוד השדרה, ובאזור של קיר הרחם נטול כלי דם גדולים.
12. לעשות חתך 3 מ"מ דרך דופן רחם וצק מי שפיר במרכז מחרוזת הארנק (איור י 2).
13. להשקות אתר חתך עם חם (38 מעלות צלזיוס) PBS.
14. בעזרת מספריים מייקרו, חתך פצע בודד בעובי מלא excisional, 1 מ"מ בערך באורך, בdorsum של העובר.
15. בעדינות אתר חתך כתם יבש עם המוליך כותנה-טיפ.
16. להזריק תת עורי דיו 3 μl נפח הודו לאתר הפצע כדי לסמן את המיקום של פצע (איור 2K).
17. להשקות עם חם (38 מעלות צלזיוס) PBS כדי להבטיח דיו נשמר בתוך אתר פצע.
18. יש לי עוזר כירורגיתnject החם (38 מעלות צלזיוס) PBS באמצעות בוטה, קצה 10 מזרק G לצק מי השפיר כמחרוזת הארנק סגור (איור 2L). לחזור בו מזרק כמו סגירת מחרוזת ארנק מתקרבת להשלמה (איור 2M).
19. בעדינות לחזור רחם לתוך חלל הבטן (איור 2N).
20. עור אוורט והצפק.
21. האם עוזר כירורגית להשקות חלל בטן עם חם (38 מעלות צלזיוס) PBS.
22. בטן לסגור במהירות על ידי הידוק עור הצפק סגורה (איור 2 טו). הסגירה סטנדרטית מתבצעת בשתי שכבות; הצפק ושרירי בטן בשכבה אחת, רקמה התת עורית ועור בשכבה השנייה. להקרבה וקציר של העובר מיידיים, ההפגנה שלנו מראה סגירה בשכבה אחת.
23. מניחים את החיה תחת השגחה בחממה חמה נקבעה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או עד שהחיה להכרתו מספיק כדי לשמור על כיבה sternal.
24. אל מילכד בעלי החיים לחברה של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש לחלוטין מההליך.
25. על התעוררות מהרדמה ובמהלך שעות 48 לאחר מכן, לנהל הזרקה תת עורית של עצירות (0.05 מ"ג / קילוגרם) כל 12 שעות לשיכוך כאבים לפי צורך בהתבסס על הערכת כאב. לנהל carprofen (5 מ"ג / קילוגרם) באמצעות הזרקה תת עורית להקלה על כאב לאחר ניתוח נוסף לפי צורך.
26. חזור בעלי חיים לכלוב ולספק להם כרצונך מזון ומים.
27. לפקח על גילויי כאב מקרוב.
28. לאחר ניתוח 48 שעות, להקריב את אמא בהריון עם מנת יתר של isoflurane והעובר קציר נפצע. כדי לעשות זאת, להתאים ריכוז isoflurane עד 5% ומעלה, ולשמור על חשיפת דקות 1 לאחר הפסקת הנשימה. לאשר המתת חסד עם נקע בצוואר הרחם. קציר עובר unwounded לביקורת שווה גיל. עוברים המאוחר צריכים שיטה נפרדת של המתת חסד בקנה אחד עם המלצות IACUC, כגון deהקפיטציה, נקע בצוואר הרחם, או הזרקה כימית.

איור 2. סכמטי לכירורגיה Murine עוברי. צעדים כלליים לגב פצעו בE16.5 ועוברי עכברי E18.5. () אפילציה של בטן עכבר. (B ו- C) הכנה של בטן עכבר. (ד) מיקרוסקופ ניתוחי המשמשת ל חתך יצירת הליך. (E) קו האמצע laparotomy. (F) חשיפה של רחם. בריאה (G) של מחט קהה קצה. (H) השקיה של רחם עם מי מלח חמים. (I) של תפר מחרוזת ארנק. (J) דרך רחם מ"מ קיר ודור 1 פצע מלא עובי excisional. (K) הזרקה תת עורית של דיו הודו. (L ו- M) סגירת תפר מחרוזת ארנק. (N ו- O)סגירת הבטן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תוצאות

לניתוח היסטולוגית, פצעי cutaneous בעור הגב של עוברי עכברי E16.5 וE18.5 צריכים להיות שנקטפו לאחר פציעה-48 שעות, קבוע PFA 4%, ו- מוטבע פרפין. במודלים מהונדסים ניאון, הקפאה עם אוקטובר עשויה להיות מתאימה. יש כמה כתמים שעשויים לשמש כדי לחזות מבנה רקמת חיבור סלולארי ו. Hematoxylin ו eosin הוא כתם ?...

Discussion

הפרוטוקול כירורגית המוצג כאן מתאר מודל excisional של ריפוי צלקות עכבריות העוברי שפורסם לראשונה בשנת 2006 על ידי המעבדה שלנו ^10. בנוסף למודלים מבוססים אחרים של פציעת excisional ^11, מודלים incisional של ריפוי צלקות עכברי עוברי קיימים גם ^12,13. חקירות של ריפוי פצע צלקות עוב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-O MONOSOF Suture	eSuture	SN-1647G
Surgical Forceps	Kent Scientific	INS650916
Micro-scissors	Kent Scientific	INS600127
Autoclip 9 mm	Texas Scientific Instruments	205060
Insulin Syringe	Thermo Fisher Scientific	22-272-382
Black Pigment	AIMS	242
BD Safety-Lok 3 ml Syringe	BD Biosciences	309596
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-049
OPMI-MD Surgical Microscope	Carl Zeiss Surgical Inc
Pregnant Mares Serum (PMS)	Millipore	367222
Human Chorionic Gonadotropin (HCG)	Sigma-Aldrich	CG10
Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415
Nair (depilatory cream)	Church and Dwight Co.	22600267058