Мышь кожу плода Модель шрамов заживления ран

Резюме

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Аннотация

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Введение

Эмбриональные кожные раны быстро и scarlessly не лечить, пока в конце беременности ^1. Плода шрамов заживления раны характеризуется регенерации нормальной структуры и функции ткани. Переход от шрамов на фенотип рубцов происходит в третьем триместре беременности у человека и вокруг эмбриональный день 18 (E18) у мышей ^2,3. По сравнению с взрослым, плода заживления раны характеризуется быстрой эпителизации, осаждения соединительной ткани, и миграции фибробластов.

Многие исследования предложили возможные объяснения феномена шрамов заживления ран во время раннего развития плода. Воспаление является основным компонентом взрослого заживления раны; Однако, фетальные раны характеризуется отсутствием острого воспаления ^4. Является ли это следствием функциональной незрелости иммунной системы в период внутриутробного этапах остается неясным. Недавнее исследование показало, что различия в численности, коврикurity и функции тучных клеток в E15 против E18 кожу плода может быть причиной для перехода от шрамов фенотипа, по крайней мере, у мышей ^3. Другие исследования постулируют, что различия в свойствах и обилие плода и взрослого раны макрофагов несут ответственность за реформирование нормальной внеклеточного матрикса (ЕСМ) в период внутриутробного заживления ран ^5.

Различия в экологических факторов в период внутриутробного и взрослых развития также может влиять на заживление ран. Longaker и его коллеги показали, что жидкость из раны от плода обладает высоким уровнем активности гиалуроновой кислоты, стимулирующие сравнению ни с у взрослых жидкость из раны ^6. Следовательно, более высокие уровни гиалуроновой кислоты, гликозаминогликанов, что способствует микросреду, способствующую подвижности клеток и пролиферации в плода раны окружающей среды, могут быть ответственны за шрамов фенотипа видели во время раннего развития плода. Другие линий доказательств указывают на тот факт, что фетал рана окружающей среды относительно гипоксемической и погружают в стерильном амниотической жидкости, богатой факторами роста ^7. Тем не менее, окончательного ответа не было предоставлено для критического случая или фактора во время эмбриогенеза, что вызывает переход от шрамов регенерацию фиброзной ремонта.

Понимание механизмов, ответственных за шрамов исцеления у плода требует точного и воспроизводимого модель. Здесь мы подробно воспроизводимая модель плода шрамов заживления ран в тыльной E16.5 (шрамов) и эмбрионов E18.5 (рубцов) мыши. Кроме того, незначительные вариации этой модели могут быть использованы для выполнения ряда дополнительных исследований, таких как анализ экспрессии генов плода ран и ^8,9 кожи. Учитывая, что именно своевременная беременность имеют решающее значение для успешного рекапитуляции этого плода шрамов модели заживления раны, мы также подробно наш протокол для суперовуляции приурочен беременности.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, описанные в этой статье, осуществляются в соответствии с руководящими принципами, установленными Административным панели Стэнфорда, на лабораторных животных (APLAC).

1. Временный Беременность - суперовуляции Техника (Рисунок 1)

ПРИМЕЧАНИЕ: Точно рассчитывая гестационный возраст эмбрионов мыши для фетальной хирургии в E16.5 и E18.5 имеет решающее значение. В этом разделе мы подробно наш протокол для синхронизации беременности мыши, используя беременных кобыл сыворотки (ПМС) и человеческий хорионический гонадотропин (ХГЧ) инъекции, чтобы побудить суперовуляции.

1. Вводите самок мышей (<5 на клетку) внутрибрюшинно (IP) с 3,0-5,0 международных единиц (МЕ) ПМС в объеме 100 мкл PBS между 1:00 и 3:00 вечера на 1 день.
2. Между 12:00 и 2:00 вечера 3 дня (сорок пять 47 часа после PMS инъекций), вводят самкам мышей IP с 3,0-5,0 МЕ ХГЧ в объеме 100 мкл PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: инъекции HCG индуцирует овуляция примерно 12 ч после инъекции.
3. Сразу же после HCG инъекций, приятель самок с самцами в возрасте 8-16 недель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно помещают две женщины в клетку отдельных мужчин.
4. Отдельные самки от самцов на утро 4 день (6:00 - 10:00 утра) и записи как возраст плода E0.5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вагинальные свечи могут быть проверены в это время; Однако, наблюдение влагалища вилки не гарантирует беременность и женщины могут забеременеть, когда не наблюдается пробка. Учитывая, что беременность является, как правило, наблюдается при визуальном осмотре и / или пальпации в гестационный возраст E16.5 и E18.5, проверяя вагинальных пробок на утро 4 дня не является строго необходимым. По нашему опыту, и в зависимости от штамма, примерно 30-50% супер-овуляция женщин забеременеть с помощью методики, описанной здесь.

PG "/>
Рисунок 1. Схема для суперовуляции техники. Процедура Схематическое изображение для суперовуляции приурочен беременности у мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

2. Мышиный фетальной хирургии (Спинной Ранение) на E16.5 и E18.5 эмбрионов (Рисунок 2)

1. Перед процедурой очистите все поверхности операционной и оборудования с 70% изопропилового спирта. Кроме того, стерилизовать все хирургические материалы и инструменты, которые будут использоваться в порядке, в автоклаве их. Некоторые учреждения могут позволить последующее использование горячей стерилизации шарик. На операцию, используйте стерильные пакеты, которые включают марлю и хирургические инструменты.
2. Анестезии у беременных матерей (возраст плода E16.5 или E18.5) под 2,5% смеси ИФ / кислорода в 2 л в мин, а затем обслуживания анестезии на 1 л в мин.
3. Конфирма надлежащее обезболивание, убедитесь, что глубокие водные рефлексы мыши подавляются и поместите курсор в положении лежа.
4. Применить ветеринар глазной мази, такие как Puralube, чтобы предотвратить раздражение глаз или сухости во время процедуры.
5. Подготовка живота путем введения применения света для удаления волос крем не более чем на 30 сек (рис 2А).
6. Подготовка живота для асептического операции с повидон-йодом и спиртом (рис 2В и 2С).
7. Выполните срединной лапаротомии под микроскопом, используя микрохирургические ножницы (рис 2D и 2E).
8. Аккуратно выставить матки и плода, выбранный для хирургии (рис 2F).
9. Промывать операционное поле с теплой (38 ° С) фосфатно-солевом буфере (PBS) с использованием тупым кончиком иглы
   ПРИМЕЧАНИЕ: Можно быть тщательно изгиба кончик большого диаметра иглы. (Рис 2G и 2H).
10. Расположите плод таким образом, чтобы позволитьполный доступ к тыльной.
11. Пройдите кошелек строку стежок, используя 7-0 нейлона шов через матку, покрывающей сайт, предназначенных спинной ранения (рис 2I). Должность кошелек строка по области спины слева или справа от спинного мозга, а в области стенки матки, лишенного крупных кровеносных сосудов.
12. Сделайте 3 мм разрез через стенку матки и амниотической в центре кошелька строки (рис 2J).
13. Промывать место разреза с теплой (38 ° С) PBS.
14. Использование микрохирургических ножницы, вырезать отдельную всю толщину эксцизионной рану, около 1 мм в длину, в спинке плода.
15. Аккуратно пятном на сайте разрез насухо хлопка наконечником аппликатора.
16. Вводите 3 мкл объема тушью подкожно в месте раны, чтобы отметить расположение раны (рис 2K).
17. Промыть теплой (38 ° С) PBS, чтобы обеспечить чернила были сохранены в месте раны.
18. Есть Операционная медсестра Inject теплой (38 ° C) PBS через тупой наконечник 10 G шприца в амниотической как кошелек строки закрывается (рис 2L). Уберите шприц как закрытие кошелек строка близится к завершению (Рисунок 2 м).
19. Осторожно вернуть матку в брюшную полость (рис 2N).
20. Эверт кожи и брюшины.
21. У орошения хирургического помощник брюшную полость теплой (38 ° С) PBS.
22. Закрыть живот быстро сшивания кожи и брюшины закрыта (рис 2О). Стандартный затвор выполняется в два слоя; брюшины и брюшной мышцы в один слой, подкожную ткань и кожу во втором слое. Для немедленного жертвы и уборки плода, наша демонстрация показывает замыкание в одном слое.
23. Место животное под наблюдением в теплом инкубаторе при 37 ° С в течение 30 мин или пока животное восстанавливает достаточную для поддержания сознания грудины лежачее положение.
24. Не RETурны животное в компании других животных, пока он полностью не оправился от этой процедуры.
25. После пробуждения от наркоза и в течение последующего 48 ч, вводить подкожную инъекцию бупренорфина (0,05 мг / кг) каждые 12 ч в обезболивании при необходимости на основе оценки боли. Администрирование карпрофена (5 мг / кг) с помощью подкожной инъекции для дополнительной послеоперационной боли по мере необходимости.
26. Вернуться животных в клетку и дать им пищу и воду без ограничений.
27. Следить за проявлениями боли.
28. 48 ч после операции, пожертвовать беременная мать с передозировкой изофлуран и сбора урожая раненых плода. Для того чтобы сделать это, отрегулировать изофлуран концентрации до 5% или выше и поддерживать экспозиции в течение 1 мин после остановки дыхания. Подтвердите эвтаназию с цервикальной дислокации. Урожай в единой раны эмбриона для соответствующего возраста контролем. Поздние эмбрионы должны иметь отдельный метод эвтаназии в соответствии с рекомендациями IACUC, таких как деподушной шейки дислокации или нагнетания химических реагентов.

Рисунок 2. Схема мышиный фетальной хирургии. Общие шаги для спинного ранены в E16.5 и эмбрионов E18.5 мыши. () Депиляция мыши живота. (B и C) Получение мыши живота. (D) Микроскоп используется для хирургической Процедура. (E) срединной лапаротомии. (F) выходят из матки. (G) Создание тупым кончиком иглы. (H) Орошение матки с теплой физиологического раствора. (I) Создание кошелька струн шва. (J) разрез через маточное стеновые и 1 мм по всей толщине поколения эксцизионная рану. (K) Подкожное введение тушью. (L и M) Закрытие кошелек строки шва. (N и O)Закрытие живота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Результаты

Для гистологического анализа, кожные раны в спинной кожи E16.5 и E18.5 эмбрионов мыши следует собирают 48 ч после ранения, фиксировали в 4% PFA, и в парафин. В люминесцентных трансгенных моделей, криоконсервация с октября может быть целесообразно. Есть несколько пятен, которые могут быть исполь?...

Обсуждение

Хирургическое протокол, представленные здесь описывается эксцизионная модель плода мышиный шрамов исцеления впервые опубликованной в 2006 году нашей лаборатории ^10. В дополнение к другим установленным моделей эксцизионная ранения ^11, Инцизионная модели плода мыши исцеления...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-O MONOSOF Suture	eSuture	SN-1647G
Surgical Forceps	Kent Scientific	INS650916
Micro-scissors	Kent Scientific	INS600127
Autoclip 9 mm	Texas Scientific Instruments	205060
Insulin Syringe	Thermo Fisher Scientific	22-272-382
Black Pigment	AIMS	242
BD Safety-Lok 3 ml Syringe	BD Biosciences	309596
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-049
OPMI-MD Surgical Microscope	Carl Zeiss Surgical Inc
Pregnant Mares Serum (PMS)	Millipore	367222
Human Chorionic Gonadotropin (HCG)	Sigma-Aldrich	CG10
Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415
Nair (depilatory cream)	Church and Dwight Co.	22600267058