Um modelo de pele Rato Fetal de reparação de feridas Scarless

Resumo

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Resumo

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Introdução

Feridas cutâneas fetais curar rapidamente e scarlessly até o final da gestação ^1. Fetal reparação ferida scarless é caracterizada pela regeneração da arquitetura do tecido normal e função. A transição de uma scarless a cicatrizes fenótipo ocorre no terceiro trimestre da gravidez em seres humanos e por volta do dia embrionário 18 (E18) em ratos ^2,3. Em comparação com a de adultos, a reparação de feridas fetal é caracterizada pela rápida epitelização, a deposição de tecido conjuntivo, e a migração de fibroblasto.

Muitos estudos têm oferecido possíveis explicações para o fenômeno da cicatrização de feridas scarless durante o desenvolvimento fetal precoce. A inflamação é um componente fundamental de reparação de feridas de adultos; No entanto, as feridas do feto são caracterizadas por uma ausência de inflamação aguda ^4. Se isto é uma conseqüência da imaturidade funcional do sistema imunológico durante os estágios fetais permanece obscuro. Um estudo recente sugere que as diferenças na abundância, maturity, e a função de mastócitos em E15 vs pele fetal E18 podem ser responsáveis ​​para a transição de um fenótipo sem cicatrizes, pelo menos no rato ^3. Outros estudos sustentam que as diferenças nas propriedades e abundância de macrófagos feridas fetais e adultos são responsáveis ​​pela reforma da matriz extracelular normal (ECM) durante a reparação de feridas fetal ^5.

Diferenças em fatores ambientais durante o desenvolvimento fetal e adulto também pode afetar a reparação de feridas. Longaker e seus colegas mostraram que o líquido da ferida de o feto possui altos níveis de atividade estimulante ácido hialurônico comparado a nenhum adulto na ferida fluido ^6. Consequentemente, os níveis mais elevados de ácido hialurónico, um glicosaminoglicano que promove um microambiente propício à motilidade e proliferação celular, no ambiente da ferida fetal pode ser responsável pelo fenótipo scarless visto durante o desenvolvimento fetal precoce. Outras linhas de evidência apontam para o fato de que o fetaambiente l ferida é relativamente hipoxêmica e submerso no líquido amniótico estéril rico em fatores de crescimento ^7. No entanto, nenhuma resposta definitiva foi fornecido para um evento crítico ou fator durante a embriogênese que dispara a transição de regeneração scarless para reparação fibrótica.

A compreensão dos mecanismos responsáveis ​​pela cura scarless no feto necessita de um modelo preciso e reprodutível. Aqui nós detalhe um modelo reprodutível de scarless cicatrização de feridas fetal no dorso de E16.5 (scarless) e embriões E18.5 (cicatrização) do mouse. Além disso, pequenas variações deste modelo pode ser utilizado para executar uma série de outros estudos, como a análise de feridas fetais e ^8,9 pele expressão gênica. Dado que as gravidezes precisamente cronometradas são críticos para recapitulação sucesso deste modelo de cicatrização fetal scarless ferida, nós também detalhe nosso protocolo para gestações de superovulação cronometrado.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos descritos neste trabalho são realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Painel Administrativo Stanford em Laboratory Animal Care (APLAC).

1. Temporário Gestações - Técnica superovulação (Figura 1)

NOTA: Precisamente cronometrar a idade gestacional de embriões de camundongos para a cirurgia fetal em E16.5 e E18.5 é de importância crítica. Nesta seção, detalhe nosso protocolo para cronometrar gestações rato usando grávida éguas soro (PMS) e gonadotrofina coriônica humana (HCG) injeções para induzir superovulação.

1. Injectar camundongos fêmeas (<5 por gaiola) por via intraperitoneal (IP) com 3,0-5,0 unidades internacionais (UI) de PMS em um volume de 100 l PBS 01:00 - 15:00 para o dia 1.
2. Entre as 12:00 e as 14:00 do dia 3 (quarenta e cinco a 47 horas após a injecção de PMS), injectar ratinhos fêmea IP com 3,0-5,0 UI de HCG em um volume de 100 ul de PBS.
   NOTA: Os induz injeção de HCG ovulação, aproximadamente, 12 h pós-injecção.
3. Imediatamente após injeções de HCG, companheiro fêmeas com machos com idade entre 8-16 semanas.
   ATENÇÃO: Nós normalmente colocar duas fêmeas em uma gaiola de machos individuais.
4. Fêmeas separados de homens na manhã do dia 4 (06:00 - 10:00) e registro como E0.5 idade fetal.
   NOTA: plugs vaginais pode ser verificado neste momento; No entanto, a observação de um plug vaginal não garante a gravidez e as fêmeas podem engravidar quando nenhum plug é observado. Tendo em conta que a gravidez é normalmente observada por inspeção e / ou palpação visual em idades gestacionais E16.5 e E18.5, verificação de fichas vaginais na manhã do dia 4 não é estritamente necessário. Na nossa experiência, e, dependendo da estirpe, aproximadamente 30-50% das mulheres super-ovulado engravidar utilizando a técnica aqui descrita.

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Figura 1. Esquema de Técnica superovulação. Procedimento exibição Esquema de superovulação cronometrado gestações em camundongos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Cirurgia Fetal Murino (Dorsal o ferimento) em E16.5 e E18.5 embriões (Figura 2)

1. Antes do procedimento, limpe todas as superfícies da sala de cirurgia e equipamentos com 70% de álcool isopropílico. Além disso, todos os fornecimentos esterilizar instrumentos cirúrgicos e que serão utilizados no processo de autoclavagem por eles. Algumas instituições podem permitir o uso posterior de esterilização quente talão. Por operação, use embalagens esterilizadas que incluem gaze e instrumentos cirúrgicos.
2. Induzir a anestesia em mães grávidas (E16.5 idade fetal ou E18.5) sob 2,5% de mistura de isoflurano / oxigênio a 2 L por min seguido de manutenção da anestesia em 1 L por min.
3. Para conempresa anesthetization adequado, garantir os reflexos profundos pedal do mouse são suprimidas e coloque o mouse na posição prona.
4. Aplique uma pomada oftálmica vet como Puralube para evitar irritação nos olhos ou secura durante o procedimento.
5. Prepare abdômen pela administração de uma leve aplicação de creme depilatório para não mais do que 30 segundos (Figura 2A).
6. Prepare abdômen para a cirurgia asséptica com iodopovidona e álcool (Figura 2B e 2C).
7. Execute linha média laparotomia sob o microscópio com tesoura microcirúrgica (Figura 2D e 2E).
8. Gentilmente expor útero e feto selecionados para a cirurgia (Figura 2F).
9. Lavar campo cirúrgico com água morna (38 ° C) solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizando uma agulha de ponta romba
   NOTA: Pode ser feita dobrando cuidadosamente a ponta de uma agulha de grande calibre. (Figura 2G e 2H).
10. Posicionar o feto de uma maneira que permitas acesso total ao dorso.
11. Passe um ponto cordão da bolsa utilizando sutura 7-0 nylon através do útero que cobre o local do ferimento dorsal pretendido (Figura 2I). Posição de fio de bolsa ao longo de uma região dorso para a esquerda ou direita da espinal medula, e em uma região da parede uterina desprovida de vasos sanguíneos grandes.
12. Faça uma incisão três milímetros através da parede uterina e saco amniótico, no centro do cordão da bolsa (Figura 2J).
13. Irrigar local da incisão com água morna (38 ° C) PBS.
14. Com uma tesoura de microcirurgia, cortar uma única ferida excisional de espessura total, aproximadamente 1 mm de comprimento, no dorso do feto.
15. Delicadamente, local da incisão secar com algodão-ponta do aplicador.
16. Injectar 3 ul volume de nanquim subcutaneamente no local da ferida para marcar o local da ferida (Figura 2K).
17. Lavar com água morna (38 ° C) para assegurar PBS tinta foi retido no interior do sítio da ferida.
18. Já cirúrgico assistente inject quente (38 ° C) PBS através de ponta romba 10 G seringa no saco amniótico como o cordão da bolsa é fechada (Figura 2L). Retrair seringa como cadeia de fecho da bolsa se ​​aproxima da conclusão (Figura 2 M).
19. Suavemente útero voltar para dentro da cavidade abdominal (Figura 2N).
20. Evert pele e peritônio.
21. Já assistente cirúrgico irrigar cavidade abdominal com água morna (38 ° C) PBS.
22. Fechar abdômen rapidamente por grampeamento pele e peritônio fechado (Figura 2O). O fecho de padrão é executada em duas camadas; peritoneu e da musculatura abdominal numa camada, tecido subcutâneo e pele na segunda camada. Para sacrifício imediato e colheita do feto, a nossa demonstração mostra o encerramento, em uma camada.
23. Colocar o animal sob observação numa incubadora quente regulado a 37 ° C durante 30 minutos ou até que o animal recupera a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
24. Não return o animal para a companhia de outros animais até que ele está totalmente recuperado do procedimento.
25. Quando acordarmos da anestesia e durante a subsequente 48 horas, administrar a injecção subcutânea de buprenorfina (0,05 mg / kg) a cada 12 horas, para a analgesia conforme necessário, com base na avaliação da dor. Administrar carprofeno (5 mg / kg) via injecção subcutânea para o alívio da dor adicional de pós-operatório, conforme necessário.
26. Retorno animais na gaiola e dar-lhes comida e água ad libitum.
27. Acompanhar de perto para manifestações de dor.
28. 48 horas após a cirurgia, sacrificar mãe grávida com uma overdose de isoflurano e colheita feridos feto. A fim de fazer isso, ajustar a concentração de isoflurano a 5% ou superior e manter a exposição durante 1 min após a cessação da respiração. Confirme a eutanásia com luxação cervical. Colher um embrião sem ferimentos para o controle pareados por idade. Embriões tardias devem ter um método separado da eutanásia consistente com as recomendações IACUC, como decapitação, luxação cervical, ou injeção de produtos químicos.

Figura 2. Esquema de Cirurgia Murino Fetal. Etapas gerais para dorsal ferindo em E16.5 e E18.5 embriões de rato. (A) Depilação de rato abdômen. (B e C) Preparação de rato abdômen. (D) Microscópio usado para cirúrgico procedimento. (E) Midline laparotomia. (F) A exposição de útero. (G) Criação de agulha de ponta romba. (H) Irrigação do útero com soro fisiológico morno. (I) Criação de cordão da bolsa de sutura. (J) incisão através uterino de parede e 1 mm de geração ferida excisional espessura total. (K) A injecção subcutânea de nanquim. (L e M) Encerramento do cordão da bolsa de sutura. (N e O)Encerramento do abdômen. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Para a análise histológica, feridas cutâneas na pele dorsal de embriões de camundongos E16.5 e E18.5 devem ser colhidas 48 horas após o ferimento, fixadas em 4% PFA, e embebidos em parafina. Em modelos transgênicos fluorescentes, a criopreservação com outubro pode ser apropriado. Existem várias manchas que podem ser utilizados para visualizar arquitectura do tecido conjuntivo e celular. HE é uma mancha de duas cores que mancha núcleos azuis e estruturas eosinofílica (ie., Citoplasma e colágeno extr...

Discussão

O protocolo cirúrgico aqui apresentado descreve um modelo excisional de fetal cura scarless murino publicado pela primeira vez em 2006 por nosso laboratório ^10. Em adição a outros modelos estabelecidos da ferida excisional ^11, modelos incisionais de cicatrização sem cicatrizes murino fetal existir como bem ^12,13. As investigações sobre a cicatrização de feridas scarless fetal no macaco, cordeiro, coelho, gambá, e rato têm sido relatados ^14-17. No entanto, os ratos ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-O MONOSOF Suture	eSuture	SN-1647G
Surgical Forceps	Kent Scientific	INS650916
Micro-scissors	Kent Scientific	INS600127
Autoclip 9 mm	Texas Scientific Instruments	205060
Insulin Syringe	Thermo Fisher Scientific	22-272-382
Black Pigment	AIMS	242
BD Safety-Lok 3 ml Syringe	BD Biosciences	309596
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-049
OPMI-MD Surgical Microscope	Carl Zeiss Surgical Inc
Pregnant Mares Serum (PMS)	Millipore	367222
Human Chorionic Gonadotropin (HCG)	Sigma-Aldrich	CG10
Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415
Nair (depilatory cream)	Church and Dwight Co.	22600267058