שימוש בelectroretinogram כדי להעריך את התפקוד ברשתית מכרסמים וההשפעות המגנות של האיבר המרוחק איסכמי אכשור קד

Summary

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

Abstract

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the ‘flash’ ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

Introduction

ERG הוא פוטנציאל חשמלי שנוצר על ידי הרשתית בתגובה לאור, ונרשם מפני הקרנית של העין. כאשר תנאים של הקלטה מנוהלים בקפידה, ERG ניתן להשתמש במגוון דרכים כדי להעריך את תפקוד רשתית. כאן אנו תיארנו כיצד להקליט את 'הבזק ERG', את הפוטנציאל שנוצר כאשר הרשתית חשופה לבזק קצר, בהיר מוצג ברקע Ganzfeld. Ganzfeld מפזר את אור homogenously והבזק של אור מגיע לכל הרשתית כ אחיד. אם הרשתית כהה מותאמת לפני ההקלטה, וכהה ההסתגלות נשמר כחיה מוכנה להקלטה, ERG הושג מופק על ידי שני קולטני האור המוט וחרוט.

יש פלאש ERG הכהה מותאמת גל אופייני, שכבר נותח בשתי דרכים. ראשון, מוקדם ומאוחרת רכיבים של צורת גל ERG כבר להבחין, וקשורים לרצף של נוירוןהפעלת אל ברשתית. הרכיב הראשון הוא קצר חביון פוטנציאל הולך שלילי, הגל (איור 1). זה ואחריו פוטנציאל הולך חיובי, נקרא ב-הגל. שלב העלייה של ב-גל תערוכות תנודות, שנחשבים רכיב נפרד (פוטנציאלי oscillatory או Ops). הגל נחשב שיופקו על ידי קולטני אור, ב-הגל על ידי תאים של שכבת הגרעין הפנימית, וOps על ידי תאי amacrine ^1.

בהתבסס על כוח הגירוי, תגובות להבזקים מאוד עמומים כינו את תגובת סף scotopic אפשרית. תגובת סף scotopic הוא הבין שיופקו מתאי הגנגליון ברשתית ^2-4. שנית, ניתן להפריד פלאש ERG על ידי הסתגלות אור, או על ידי פרוטוקול שני פלאש מתואר להלן, למרכיבי rod- ומונע קונוס. בתנאי photopic, הגל הוא לא להבחין בחולדות, כי אוכלוסיית קונוס היא נמוכה, אבל Ops וב-גל הואברור ^5. בפרימטים, רשתיות שיש אוכלוסיות חרוט גבוהות, שני rod- ומסלולי cone- ליצור גל לזיהוי ^6.

שני מדדים שימושיים לעתים קרובות מופקים פלאש ERG הם אמפליטודות של a- וB-גלים, נמדדה כמו באיור 1, עם תגובות אופייניות הבזק מוצגות באיור 2. כאשר אוכלוסיית קולטי האור מצטמצמת, לדוגמא על ידי חשיפה למזיקה בהיר אור, כל הרכיבים של ERG מופחתים. התערבויות neuroprotective, כגון מרוחק נפשית מראש איסכמי (RIP), יכולות להיות מאומתות על ידי השמירה על אמפליטודות של a- וB-גלים (איור 3). לסיכום, הניתוח של ERG מאפשר השוואות בין בריא, האור הפגום ורשתית neuroprotected.

Protocol

פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות טיפול בבעלי החיים של אוניברסיטת סידני.

1. אלקטרודות ביצוע

1. לבנות את האלקטרודה החיובית (אחד שייצור קשר עם הקרנית) מאורך קצר (5 סנטימטרים) של חוט פלטינה 1-2 מ"מ קוטר. אופנה אותו ללולאה כמה מ"מ קוטר. חבר לולאה זה ליתרון קונבנציונלי, מספיק זמן כדי להגיע לשלב הקלט של המגבר שלך (ראה איור 4).
2. לבנות את האלקטרודה השלילית (שילך בפיו של בעל החיים) באמצעות Ag / AgCl גלולה 1-2 מ"מ בקוטר, קשור גם ליתרון אמנה (ראה איור 4).
3. כאלקטרודה התייחסות (שתיכנס לעכוזו של בעל החיים), להשתמש במחט מזרק נקייה (23 G), קשורה גם ליתרון של אורך המתאים (ראה איור 4).
4. באופן אידיאלי, להשתמש בכבלים שלוש-עופרת מסופקים על ידי יצרני מכשיר, להתחבר שלוש אלקטרודות (U החיובי94; קרנית, שלילי → פה, התייחסות → עכוז) למגבר.

2. חיבור וכיול של גירוי האור וERG סט-אפ

1. צור (או אתר) מעבדה הקלטה קטנה, אשר יכול להתבצע כהה. לצייד עם שניהם אור מעל לספסל עשה אדום או ראש-מנורה אדומה או או.
2. השתמש מטר סוויטה דה לוקס כדי לאשר שהארת האור האדומה מגיעה עין של החולדה במהלך ההתקנה אינו עולה על לוקס 1.
   הערה: מסנן צפיפות ניטראלי יכול לשמש כדי להפחית מנורת בהירות והמקור של אור המנורה חייב במיוחד פולט אור אדום. adaption הכהה תהיה בסכנה אם מקורות אור פולטי אורכי גל נמוכים (גלוי).
3. לאטום את כל האור התועה שנכנס למעבדה ההקלטה (זה לעתים קרובות דורש התמדה עם קלטת אטומה) ולהכין מסנן צפיפות ניטראלי (זה ניתן לרכוש בגיליונות) גדול מספיק כדי להתאים מעל, וכך עמום, כל מסך מחשב יהיה לך ב מעבדה.
   הערה: אור תועה והאור של מסך יש בם כדי לפגוע בהסתגלות כהה של העין החולדה.
4. חבר את המגבר לחומרת רכישת נתונים. חבר מוביל חיובי, שלילי והתייחסות למגבר. ודא שהמחשב ויחידת אספקת חשמל Ganzfeld LED מחובר היטב למקור קרקע.
   הערה: מעבדות חלקם מתמחים נקודות הארקה, מחוברים לקרקע בניין; צינור מים הוא אלטרנטיבה יעילה.
5. לכייל את מקור אור LED עם מד קרינת מחקר באיכות. תקן החיישן של המטר במצב שבו העין של החיה תהיה ממוקמת בניסוי.
6. תכנית נוריות Ganzfeld להפעיל פרוטוקול ERG שדה מלא עם עליות צעד חכם באנרגיית הבזק, הבזק משך, הבזק חזרה וזמן בין הבזקים, מכונה מרווח interstimuls (ISI), הגדרות. לדוגמא פרוטוקול מלא שדה ראה טבלה 1.
   הערה: השדה מלא הבזקי ERG להגדיל מהבזקים עמומים חוזר על עצמו לbהבזקים תקין באופן חכם צעד. תכנית הבזק התאום הבאה על מפרוטוקול השדה המלא ומאפשרת בידוד של תגובות מוט וחרוט.

3. יום לפני הניסויים ERG

1. Dark להסתגל Sprague-Dawley חולדות לשעה 12 לפני ההקלטה. זה נוח לעשות את זה במעבדה ההקלטה, פעם אור תועה כבר בוטל.

4. יום של ניסויים ERG

1. לארגן את החיה להיות בעדינות מחוממת בעת ההקלטה. אנו משתמשים בפלטפורמת מתכת אור הבנויה כך שהראש של החיה יכול לנוח בנקודה הנכונה בכניסה לGanzfeld. יש פלטפורמת צינורות מובנים שבאמצעותו אנו לשאוב מים שחומם מראש ל 40 מעלות צלזיוס באמבט מים.
   הערה: הניסיון מראה שזה שומר על טמפרטורת הליבה של החיה על 37 מעלות צלזיוס.
2. לשקול את העכברוש בתנאים חשוכים. שיא במשקל ולהפוך את קטמין הנכון (60 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (5 מ"ג / קילוגרם) במינון. לרסן את העכברוש gently ולהזריק חומר ההרדמה intraperitoneally.
3. הערה זמן הזרקה. ברגע שבעלי החיים הוא לא מודע (בדרך כלל תוך 5 דקות) לבדוק לעומק של הרדמה על ידי צביטה קלה כרית רגל אחת, כדי לראות אם תגובת רפלקס היא הווה. עדיף לחכות עד שרפלקס זה הוא נעדר או חלש, לפני שתמשיך.
4. החל טיפה אחת של אטרופין ועוד proxmethacaine לקרנית.
5. לחתוך באורך 10 סנטימטר של חוט שחור. לעשות לולאה עם קשר פשוט ולהחליק את הלולאה מעל קו המשווה של העין. הדק אותו מעט; ההשפעה היא למשוך את גלגל העין מעט קדימה, עם לחץ מינימאלי. הדבר זה שומר את הקרנית ברורה מהעפעפיים.
6. טיפות עיני קרבומר יחולו על פני השטח של הקרנית. ודא קרבומר נשאר על פני השטח של קרנית ולא לשפוך על העפעפיים או הפנים.
7. הנח מצעים סופגים על גבי פלטפורמה מחוממת.
8. עכברוש עמדה על המצעים, עם הראש במקום המומלץ בפתיחת Ganzfeld.
9. int הכנסבדיקה טמפרטורת ernal לתוך פי הטבעת. בדיקה מאובטחת טמפרטורה בעמדה ידי מקליטה כבל בדיקה לזנב.
10. הכנס את האלקטרודה ההתייחסות (מחט 23 G) תת עורי לרגל האחורית, ולהתחבר למגבר.
11. מניחים את האלקטרודה השלילית (גלולה Ag / AgCl) מאובטח בפה. כדי למנוע זאת מחליקה את הפה, להדביק את ההובלה בחיבור למשטח יציב.
12. מקם את האלקטרודה החיובית על המרכז של הקרנית. באמצעות micromanipulator, להבטיח כי האלקטרודה נוגעת הקרנית בעדינות.
13. טמפרטורת גוף בדוק היא ב37.0-37.5 מעלות צלזיוס.
14. ברגע שבעלי החיים ממוקם כראוי ואלקטרודות נמצאות במקום, לעטוף את ההתקנה כולה (Ganzfeld ובעלי חיים) עם חומר אטום (לשמר הסתגלות כהה). אנו משתמשים בבד שחור רך.
15. ברכישת התוכנה להגדיר בקצב דגימה 2 קילוהרץ עם זמן אוסף של 100-1,000 msec עם 5 אלפיות השניים של דגימה מראש אוסף. הגדר את המסננים לעבור להקה ל1-1,000הרץ ולהבטיח דגימה שמופעל כדי לטעום את התקופה ~ 250 אלפיות השנייה הבא פלאש.
16. בדוק את בסיס ההקלטה. זה צריך להיות חופשי של רעש מיותר, אבל להראות קצת רעש מגבר ותנודה בדרכי הנשימה.
17. אם בסיס תערוכות רעש מיותר, להתחיל פתרון בעיות. רוב הבעיות הקשורות לזליגה בעמדת אלקטרודה, או הארקה. השתמש כלוב פאראדיי כדי להבטיח הקלטות הן ללא רעש מיותר.
18. הפעל הבזק בדיקה, 0.4 יומן סקוטי cd.sm ^-2. גל ERG דומה לאיור 2A אמור להופיע. בתגובות האופייניות המעבדה שלנו לcd.sm ^-2 הבזק סקוטי 0.4 יומן הם (גל: -474 ± 39 μV וב-גל: 1,512 ± 160 μV, n = 11).
19. לאפשר לבעלי חיים לכהים מחדש להסתגל במשך 10 דקות. זה נוח לשימוש 10 דקות אלה לבדוק שוב את נקודת ההתחלה.
20. האישור הבא של אות יציבה להתחיל בהקלטה.
21. בסוף פגישת ההקלטה, לבדוק שטמפרטורות הגוףיור נשמר. הסר אלקטרודות. מרח את קרם פולימר קרבומר לקרניות. לאפשר לבעלי החיים להתאושש על כרית חום עד שהוא נייד ופעיל באופן מלא, לפני שתחזור לדיור בעלי חיים.

5. איסכמיה מרחוק

1. בצע איסכמיה המרוחקת בשני מכרסמים ער או anesthetised.
2. אם בעל החיים מורדמים, להניח אותה על פלטפורמה מחוממת (לעיל) ולהחליק את שרוול מד לחץ דם על החלק העליון של האיבר האחורי-, ברור של הברך.
3. אם בעלי החיים המשמשים לטיפולו, ניתן לבצע הליך זה ללא הרדמה; זה דורש שני אנשים. אדם אחד מרסן את החיה בעדינות והשנייה חל שרוול מד לחץ דם ומפעיל את מד לחץ דם.
4. לבעלי חיים ער, להשתמש פיסת המגבת ~ 15 סנטימטרים x 30-50 סנטימטר לעטוף בעדינות את החיה, עם hindlimb אחד חינם. הנח את החיה על גבה על (נניח) זרוע השמאל, עם הראש שלו תחוב בין זרועו של בעל ופלג הגוף עליון, ומקוםהשרוול שכתואר.
5. להוציא את האוויר השרוול ולהבטיח את שסתום לחץ האוויר סגור. לשאוב את השרוול עד 160 מ"מ כספית בבעלי החיים anesthetised, ועד 180 מ"מ כספית בבעלי חיים ער. זה עולה לחץ הסיסטולי (בדרך כלל 140 מ"מ כספית ו -160 מ"מ כספית בהתאמה).
6. לשמור על לחצים אלה כנדרש, תוך שימוש במשאבת כף היד.
7. לאחר הזמן המתוכנן לאיסכמיה (אנו משתמשים 2 תקופות של 5 דקות מופרדות על ידי 5 reperfusion דקות), להוציא את האוויר בלחץ השרוול על ידי שחרור שסתום לחץ האוויר.
8. אשר את ההשפעה של איסכמיה מרחוק עם בדיקה טמפרטורת עור מחוברת לשודד. טמפרטורת עור בדרך כלל נופלת 32-30 מעלות צלזיוס, במשך 5 דקות ומתאוששת בreperfusion.

6. נזק קל

1. ודא שחולדות נמצאות בלפני הלילה כהה מותאם, הליך נזק קל.
2. בזמן המתאים הבא איסכמיה איבר (בניסויים שלנו ללא דיחוי), כל חיה ממוקמת ביחידות לתיבות פרספקס, wiמים ה ומזון במכלים מבוסס רצפה.
   הערה: נזק הנגרם אור יכול להתבצע רק בבעלי החיים לבקן.
3. לעבור על אור לבן 1,000 לוקס-מכויל מראש בזמן סטנדרטי (בדרך כלל 09:00) ולשמור על מצב זה למשך 24 שעות.

7. ERG הפקת נתונים וניתוח

1. לרכוש צורות גל בממוצע של ERG. במידת צורך, נכון לתחילת מחקר אינו אפס, על ידי חיסור.
2. מדוד את משרעת של הגל (שהוצג באמצע לעוצמות גירוי גבוהות), כהפרש בין המתח הבסיסי והראשון (<30 אלפיות השני חביון) שוקת (איור 1).
3. מדוד את משרעת ב-גל כהפרש בין המתח לשיא של הגל והחיובי של הגל הבא, בדרך כלל המתרחש בהשהיה של 80-100 אלפיות שני (איור 1).
4. לבודד פוטנציאלי oscillatory באמצעות התמרת פורייה לסנן נתונים 60-235 הרץ, עם להקת מעבר 90 הרץ ^{7. אם נדרשה אות פוטנציאל oscillatory המבודדת אז יכולה להיות מופחתים צורת הגל מסונן כדי לאשר את זהותו של השוקת-הגל.}
5. הזמן הסמוי (חביון) של פסגות a- וב-גל יכול להיות גם אמצעי שימושי (איור 1). השתמש בהבזקי התאום לבודד את תגובת המוט. הפחת את תגובת קונוס (פלאש 2) מהתגובה המעורבת (פלאש 1) כדי לבודד את תגובת המוט (איור 2).
6. לנרמל עוצמת אור בודדת-גל ואמפליטודות ב-גל (לאחר טיפול / פוסט-טיפול-בסיס) או בממוצע לקבוצות טיפול. עקומות עוצמת תגובת העלילה אמפליטודות הקבוצה וטעייה נגד הבזק אנרגיה.

תוצאות

הפרוטוקול יכול לשמש למדידת תפקוד ראייה של רשתית המכרסמים in vivo. הגל, מדד לתפקוד קולטי האור, וב-הגל, מדד לתפקוד רשתית פנימי, הם מבואר באיור 1.

עליות-נשלט מוט ERG האות עם גירוי האור הגובר, כפי שמוצג באיור 2 א. הגל מת?...

Discussion

שיטת ERG הכהה מותאמת הבזק שתוארה לעיל היא שיטה אמינה להערכת תפקוד רשתית בחולדות. שני-הגל ו- B-הגל הופחתו נזק קל. מרחוק נפשית מראש איסכמי מיתנו ירידות מושרה נזק קלים ב- הגל ו- B-גל. שימור זה של תפקוד רשתית עולה כי נפשית מראש איסכמי מרחוק מושרה neuroprotection, מזכיר צורות אחרות של מ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware	AD Instruments	PL 35044	Acquistion of ERG
Animal Bio Amp	AD Instruments	FE 136	Amplifier for ERG
Lab chart	AD Instruments		Signal collection software
Ganzfield	Photometric solutions	FS-250A	Light stimulus
Ganzfield operating system	Photometric solutions
Research Radiometer	International light technologies	ILT-1700	calibrate light series
Lux meter		LX-1010B	check red light illumanation
Excel	Microsoft
Lead wires	AD Instruments		Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires - alligator	AD Instruments		ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95%	A&E metals		postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet	SDR	E205	negative electode
26 G needle	BD		ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe	Harvard Appartus	507222F
Atropine 1% w/v	Bausch & Lomb		topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v	Bausch & Lomb		topical anaesthetic
Visco tears eye drops	Novartis		carbomer polymer
Thread			retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive	Blu tac		Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		dissociative
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		muscle relaxant
Scale