Kemirgen Retina ve Uzaktan Ekstremite İskemik Önkoşullamanın Koruyucu Etkileri Fonksiyonu Değerlendirmek Üzere elektroretinogram kullanma

Özet

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

Özet

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the ‘flash’ ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

Giriş

ERG ışığa karşılık olarak retina tarafından oluşturulur ve gözün korneal yüzeyi kaydedilen bir elektrik potansiyeli. Kayıt koşulları dikkatle idare edildiğinde, ERG retina fonksiyonunu değerlendirmek için çeşitli şekillerde kullanılabilir. İşte biz 'flaş ERG', retina, bir Ganzfeld arka planda sunulan kısa, parlak flaş maruz kaldığında oluşan potansiyeli kaydetmek nasıl tarif. Ganzfeld homojen ışık dağıtır ve ışık flaş yaklaşık eşit bütün retina ulaşır. Retina kaydetmeden önce koyu adapte edilir ve hayvan kayıt için hazırlanmış gibi koyu adaptasyonu devam edilirse, ERG hem çubuk ve koni fotoreseptör tarafından oluşturulan aldı.

koyu adapte flaş ERG iki şekilde analiz edilmiştir karakteristik dalga biçimi vardır. İlk olarak, ERG, dalga biçiminin, erken ve geç bileşenleri ayırt ve nöron sekansına ilişkilendirilmiştirretina al aktivasyonu. erken bileşen kısa gecikme negatif gidiş potansiyel bir dalga (Şekil 1). Bu olumlu bir gidiş potansiyeli takip ediyor, b- dalgası olarak adlandırılan. b- dalga yükselen aşaması ayrı bir bileşen (osilatör potansiyelleri veya OP) olarak kabul edilir salınımları göstermektedir. a-dalgası fotoreseptör tarafından oluşturulan olarak kabul edilir, amacrine hücreleri ¹ ile iç nükleer tabaka hücreleri ve ops b-dalgası.

Uyarıcı gücüne dayalı, çok loş flaşlar tepkiler skotopik eşik tepkisi mümkündür adlandırılan. skotopik sınır tepkisi, retinal bez hücrelerin ^2-4 elde edilmesi anlaşılmalıdır. İkincisi, flaş ERG ışık adaptasyon ile ayrılabilir veya bir iki flaş protokolü tarafından çubuk ve koni odaklı bileşenleri içine, aşağıda anlatılan. Fotopik koşullar altında, koni nüfusu düşük olduğu için dalga, sıçanlarda değil saptanabilir, ancak Operasyonel ve b-dalgası⁵ açık. Kimin retinalar yüksek koni nüfusa sahip primatlar, olarak, çubuk ve koni yollar hem saptanabilir bir dalga ⁶ üretir.

Genellikle flaş ERG çıkarılan iki yararlı önlemler fotoreseptör nüfusu zarar verici parlak maruz bırakılarak, örneğin azalır, Şekil 2'de gösterilen tipik bir flaş yanıtları. Şekil 1 'deki gibi ölçülür A ve B amplitüdü, Hangi Işık, ERG tüm bileşenleri azalır. Gibi uzak iskemik önkoşullama (RIP) olarak nöroprotektif müdahaleler, a- b-dalgaları (Şekil 3) genliklerinin korunması ile doğrulanabilir. Özetle, ERG analizi hasarlı sağlıklı, hafif ve neuroprotected retina arasındaki karşılaştırmalar sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu protokol University of Sydney hayvan bakım kurallarına uyar.

1. Yapımı elektrotlar

1. Pozitif elektrot platin tel çapı 1-2 mm kısa (5 cm) uzunluğu (kornea irtibata geçecektir biri) Construct. Bir döngü içine çapında bir kaç mm o moda. Senin amplifikatör giriş aşamaya ulaşmak için yeterince uzun bir geleneksel kurşun bu döngü bağlayın (Şekil 4).
2. Bir Ag / AgCl de kongre kablosuna bağlı çapı 1-2 mm, pelet kullanılarak (hayvanın ağzına gidecek) negatif elektrot Construct (Şekil 4).
3. (Hayvanın kıç girecek) referans elektrot, aynı zamanda uygun uzunlukta bir kurşun bağlanmış temiz derialtı iğne (23 G) kullanmak gibi (Şekil 4).
4. İdeal olarak, (pozitif U üç elektrotları bağlamak için, cihaz üreticileri tarafından sağlanan üç kurşun kablolar kullanın94; Kornea, negatif → ağız, amplifikatör kıç → referans).

Işık Stimulus ve ERG Set-up 2. Bağlantı ve Kalibrasyon

1. Karanlık yapılabilir küçük bir kayıt laboratuvarı, oluşturun (veya bulmak). Kırmızı yapılan over-the-tezgah ışık veya kırmızı kafa lambasının ya da her ikisi ile donatın.
2. 1 lux geçmemesi kurulum sırasında sıçan göz ulaşan kırmızı ışık aydınlık onaylamak için bir lüks metre kullanın.
   Not: Bir nötral yoğunluk filtresi lamba parlaklığını azaltmak için kullanılabilir ve lamba ışık kaynağı, özellikle kırmızı ışık yayarlar gerekir. Işık kaynakları düşük (görünür) dalga boylarını yayan eğer karanlık adaptasyonu tehlikeye olacak.
3. (Bu genellikle şeffaf bant ile sebat gerektirir) kayıt laboratuvarı giren tüm sokak ışık kapatmak ve üzerinde sığacak kadar büyük ve o kadar loş bir nötral yoğunluk filtresi (bu yaprak satın alınabilir) hazırlamak, herhangi bir bilgisayar ekranı içinde olacak laboratuvar.
   Not: Kaçak ışık veBir ekranın ışık sıçan gözün karanlık adaptasyonu halel için yeterlidir.
4. Veri toplama donanımına amplifikatörü bağlayın. Amplifikatöre pozitif, negatif ve referans uçlarını bağlayın. Bilgisayar ve LED Ganzfeld güç kaynağı ünitesi güvenli bir zemin kaynağına bağlı olduğundan emin olun.
   Not: Bazı laboratuvarlar bina toprağa bağlı, topraklama noktaları uzman var; Bir su borusu etkili bir alternatiftir.
5. Bir araştırma kalitesinde Radyometresiz LED ışık kaynağı ayarlayın. Hayvanın gözü bir deney sırasında yer alacak hangi pozisyonda metrenin sensörünü sabitleyin.
6. Ganzfeld LED'ler yanıp söner arasındaki flaş enerji, flaş süresi, flaş tekrarı ve zaman içinde adım adım artışlar tam saha ERG protokolünü çalıştırmak Program, interstimuls aralığı (ISI), ayarlar olarak adlandırılan. Bir örnek tam saha protokolü için bakınız Tablo 1.
   Not: ERG yanıp söner tekrarlayan loş yanıp söner yükselecek tam saha bBir adım akıllıca bir şekilde doğru yanıp söner. ikiz Flash program tam saha protokolü üzerinde izler ve çubuk ve koni yanıtları izolasyonunu sağlar.

ERG Deney 3. Gün önce

1. Karanlık kaydetmeden önce 12 saat Sprague-Dawley sıçanları adapte. Bu kaçak ışık ortadan edildikten sonra, kayıt laboratuvarda bunu yapmak uygundur.

ERG Deney 4. Gün

1. Hayvan kayıt sırasında hafifçe ısıtılır olabilmesi için düzenleyin. Biz hayvanın kafası Ganzfeld girişinde doğru noktada dinlenme böylece inşa hafif metal platformu kullanmak. platform, bir su banyosu içinde 40 ° C'ye ısıtılmış su pompası içinden dahili boru vardır.
   Not: Deneyim bu 37 ° C'de hayvanın çekirdek sıcaklığını korur olduğunu göstermektedir.
2. Karanlık koşullarda sıçan tartılır. Telaffuz ağırlığı ve doğru ketamin (60 mg / kg) ve ksilazin oluşturan (5 mg / kg) dozda. Sıçan gen dizginlemektly ve intraperitoneal anestezik enjekte.
3. Enjeksiyon zamanı not edin. Hayvan bilinçsiz sonra (genellikle 5 dakika içinde) hafifçe bir refleks yanıtı mevcut olup olmadığını görmek için, tek ayak pedi kısma anestezi derinliğini kontrol edin. Bu refleks geçmeden önce, yok ya da zayıf olana kadar beklemek en iyisidir.
4. Korneaya proxmethacaine tek atropin damla ve başka uygulayın.
5. Siyah iplik 10 cm uzunluğunda kesin. Basit bir düğüm ile bir döngü yapın ve göz ekvator üzerinde döngü kayma. Hafifçe sıkın; etkisi minimum basınç, hafif öne göz küresinin çekmektir. Bu göz kapaklarında net kornea tutar.
6. Uygula karbomer göz kornea yüzeyine düşer. Emin Karbomer kornea yüzeyinde kalır ve göz kapakları veya yüz dökülmemesine değildir.
7. Isıtmalı platformun üstüne emici yatak yerleştirin.
8. Ganzfeld açılışında önerilen yerde baş yatak üzerinde Pozisyonu sıçan.
9. Ekle intrektum içine ernal ısı probu. Kuyruk prob kablosunu bantlama pozisyon Güvenli ısı probu.
10. Subkutan arka bacak içine referans elektrodu (23 G iğne) yerleştirin ve amplifikatör bağlanın.
11. Güvenli ağızda negatif elektrot (Ag / AgCl pelet) yerleştirin. Bu ağız kaymasını önlemek için, sabit bir yüzeye bağlanarak kurşun yapıştırın.
12. Korneanın merkezi üzerinde pozitif elektrot yerleştirin. Bir mikromanipülatör kullanarak, elektrot hafifçe kornea dokunur emin olun.
13. 37.5 ° C - Kontrol vücut ısısı 37.0 yer almaktadır.
14. Hayvan düzgün yerleştirilmiş ve elektrotlar yerdesiniz sonra, opak malzeme ile tüm kurulum (Ganzfeld ve hayvan) asmak (karanlık adaptasyonu korumak için). Biz yumuşak siyah bir bez kullanın.
15. Ön toplama örnekleme 5 milisaniye ile 100-1000 msn koleksiyonu zaman 2 KHz örnekleme hızında ayarlanmış edinme yazılımında. 1-1,000 bant geçiren filtreler ayarlayınHz ve bu örnekleme sağlamak bir flaş aşağıdaki ~ 250 msn dönemini örnek tetiklenir.
16. Kayıt taban çizgisini kontrol edin. Bu gereksiz gürültü özgür olmak, ancak bazı amplifikatör gürültü ve solunum salınım göstermesi gerekir.
17. Bazal gereksiz gürültüyü gösteriyorsa, sorun giderme başlar. Çoğu problem elektrot pozisyonu veya topraklama kaymaya ilişkilidir. Kayıtlar gereksiz gürültü serbest olmasını sağlamak için bir Faraday kafesi kullanın.
18. Bir test flaş, 0.4 günlük scot cd.sm ^-2 çalıştırın. Benzer bir ERG dalga 2A görünmelidir Şekil. 0.4 günlük scot cd.sm ^-2 flaş laboratuvar tipik tepkiler (: -474 ± 39 mV ve b-dalgası: a-dalgası 1,512 ± 160 mV, n = 11) 'dir.
19. Karanlık hayvan 10 dakika süreyle yeniden adapte izin verin. Bu taban çizgisini yeniden kontrol etmek, bu 10 dakika kullanmak daha uygun olur.
20. Istikrarlı sinyal aşağıdaki onay kaydı başlar.
21. Kayıt oturumun sonunda, vücut temperat kontrolURE muhafaza edilmiştir. Elektrotları çıkarın. Kornealara karbomer polimer yeniden uygulayın. Hayvan konut dönmeden önce, tamamen mobil ve aktif olana kadar hayvan bir ısı pad üzerinde kurtarmak için izin verin.

5. Uzaktan İskemi

1. Uyanık veya anesteziye kemirgenlerde ya uzaktan iskemi gerçekleştirin.
2. Hayvan anestezi ise, (yukarıda) ısıtılmış bir platform üzerine yattı ve diz net arka ekstremite, üst kısmı üzerinde tansiyon aleti Kolluğu kayma.
3. Hayvanlar işlenen için kullanılırsa, anestezi olmadan bu yordamı gerçekleştirmek mümkündür; Bu iki kişi gerekir. Bir kişi hafifçe hayvan kısıtlayan ve ikinci tansiyon aleti manşeti uygular ve sfingomanometre çalışır.
4. Uyanık hayvanlar için, yavaşça tek hindlimb ücretsiz, hayvan sarmak için havlu bir parça ~ 15 cm x 30-50 cm kullanın. Merkez sahibinin kol ve gövde, ve yeri arasında sıkışmış olan, sol önkol (diyelim ki) onun sırtında hayvan LayManşet tıpkı nitelendirdi.
5. Manşeti Deflate ve hava basınç valfi kapalı olduğundan emin olun. Narkoz hayvanlarda 160 mmHg manşeti Pompa ve uyanık hayvanlarda 180 mmHg. Bu sistolik basıncı (genellikle 140 mmHg ve 160 mmHg sırasıyla) aşıyor.
6. El pompası kullanılarak, gerektiğinde bu baskıları koruyun.
7. Iskemi için planlanan bir süre sonra (biz 5 dk reperfüzyon ile ayrılmış, 5 dakika 2 dönemleri kullanın), hava basınç valfi gevşeterek manşet basıncını Söndür.
8. Footpad bağlı bir cilt sıcaklık probu ile uzaktan iskemi etkisini onaylayın. Cilt sıcaklığı tipik olarak 5 dakika boyunca, 32-30 ° C'ye düşer ve reperfüzyon kurtarır.

6. Işık Hasar

1. Sıçanlar koyu adapte gecede, önce hafif hasar prosedüründe olduğundan emin olun.
2. (Gecikmeden bizim deneylerde) ekstremite iskemi aşağıdaki uygun zamanda, her bir hayvan, bir pleksiglas kutular, wi içine tek başına yerleştirilirzemin tabanlı kaplarda inci su ve gıda.
   Not: Işık kaynaklı hasar sadece albino hayvanlarda yapılabilir.
3. Standart bir süre (genellikle 09:00) bir önceden kalibre 1,000 lux beyaz ışık açın ve 24 saat süreyle bu durumu korumak.

7. ERG Veri çıkarımı ve Analizi

1. ERG ortalama dalga formları edinin. Çıkarma ile sıfır olmayan bir taban için, gerekirse ayarlanır.
2. Başlangıç ​​ve birinci arasındaki gerilim farkı olarak, (yüksek uyaran yoğunluklarına orta ve sunulan) a dalgasının genlik ölçün (<30 msn gecikme) oluk (Şekil 1).
3. Tipik 80-100 msn (Şekil 1) bir gecikme meydana gelen bir dalgasının tepe ve şu dalganın pozitif arasındaki gerilim farkı olarak b-dalgası genliği ölçün.
4. 90 Hz geçiş bandı ile, 60-235 Hz verileri süzmek için bir dönüşüm Fourier kullanarak osilatör potansiyelleri izole edin ^{7. Gerekli izole salınımlı bir potansiyel sinyal daha sonra filtresiz dalga çıkarılır olabilir Bir dalga çukur kimliğini doğrulamak için.}
5. a- ve b-dalgası zirveleri örtülü süresi (gecikme) da yararlı bir tedbir (Şekil 1) olabilir. Çubuk yanıtı izole etmek için ikiz yanıp kullanın. Karışık tepki (flaş 1) çubuk tepkisini izole etmek (Şekil 2) koni yanıt (flaş 2) çıkarın.
6. Bireysel ışık yoğunluğu bir dalga ve b-dalgası genlikleri (tedavi sonrası / post-tedavi-bazal) Normale veya tedavi grupları için ortalama. Yoğunluk-yanıt eğrileri flaş enerjiye karşı grup genlikleri ve hatayı arsa.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

protokolü, in vivo olarak, kemirgen retina görme fonksiyonu ölçmek için kullanılabilir. a-dalgası, fotoreseptör fonksiyonunun bir ölçüsü, ve b-dalgası, iç retina fonksiyonun bir ölçümü olan, Şekil 1 'de açıklanmış bulunmaktadır.

Şekil 2A gösterildiği gibi artan ışık uyaran ile çubuk hakim ERG sinyal artar. a-dalgası 0.4 günlük scot cd.sm ^-2 ve 2.5 log Scot cd.sm de doyuma kadar a-dalgası artar genlik...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Yukarıda tarif edilen koyu adapte flaş ERG yöntemi sıçanlarda retina fonksiyonlarını değerlendirmek için güvenilir bir yöntemdir. A-dalgası ve b-dalgası Hem hafif hasar azaltılmıştır. Uzaktan iskemik önkoşullama a-dalgası ve b dalga ışık hasar kaynaklı azalmalar hafifletilmiş. Retina fonksiyonunun Bu muhafaza uzak iskemik önkoşullama gibi hipoksi, iskemi ve egzersiz ^8-10 gibi koruyucu önkoşullama diğer formları andıran, nöro kaynaklı olduğunu göstermektedir. Kayıt kurulumu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware	AD Instruments	PL 35044	Acquistion of ERG
Animal Bio Amp	AD Instruments	FE 136	Amplifier for ERG
Lab chart	AD Instruments		Signal collection software
Ganzfield	Photometric solutions	FS-250A	Light stimulus
Ganzfield operating system	Photometric solutions
Research Radiometer	International light technologies	ILT-1700	calibrate light series
Lux meter		LX-1010B	check red light illumanation
Excel	Microsoft
Lead wires	AD Instruments		Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires - alligator	AD Instruments		ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95%	A&E metals		postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet	SDR	E205	negative electode
26 G needle	BD		ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe	Harvard Appartus	507222F
Atropine 1% w/v	Bausch & Lomb		topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v	Bausch & Lomb		topical anaesthetic
Visco tears eye drops	Novartis		carbomer polymer
Thread			retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive	Blu tac		Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		dissociative
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		muscle relaxant
Scale