Verwenden der Funktion zur Elektroretinogramm im Nager Retina und die schützende Wirkung des Fern Limb ischämischen Präkonditionierung bewerten

Zusammenfassung

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

Zusammenfassung

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the ‘flash’ ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

Einleitung

Die ERG ist ein elektrisches Potential von der Netzhaut als Reaktion auf Licht erzeugt und von der Hornhautoberfläche des Auges aufgezeichnet. Wenn die Bedingungen der Aufnahme wird sorgfältig gesteuert, kann die ERG in einer Vielzahl von Möglichkeiten, um die Funktion der Retina zu bewerten verwendet werden. Hier haben wir beschrieben, wie man die "Flash-ERG, die erzeugt werden, wenn die Netzhaut zu einer kurzen, hellen Blitz in einem Ganzfeld Hintergrund präsentiert ausgesetzt Potenzial aufzuzeichnen. Die Ganzfeld streut das Licht homogen und der Lichtblitz erreicht die gesamte Netzhaut etwa gleichmäßig. Wenn die Netzhaut vor der Aufnahme angepasst dunkel, und die dunkel Anpassung beibehalten wird, wie das Tier wird für die Aufnahme bereit, erhalten die ERG wird sowohl von Stäbchen und Zapfen-Photorezeptoren erzeugt.

Die dunkeladaptierten Flash ERG eine charakteristische Wellenform, die in zwei Arten analysiert wurde. Erste, frühe und späte Komponenten des ERG-Wellenform werden unterschieden, und mit der Sequenz des Neurons bezogenenal Aktivierung in der Netzhaut. Die früheste Komponente ein kurzer Latenz negativ werdenden Potentials der a-Welle (1). Dies wird durch einen positiv verlaufenden Potential gefolgt, die so genannte b-Welle. Die steigende Phase der b-Welle zeigt Schwingungen, die als eine separate Komponente (Schwingungspotentiale oder OP) werden. Die a-Welle wird als von Photorezeptoren erzeugt werden, die b-Welle durch Zellen der inneren Körnerschicht und der OP durch Amakrinzellen ^1.

Auf der Grundlage der Reizstärke, Antworten auf sehr dunkel blinkt bezeichnet die skotopischen Schwellenreaktion möglich. Skotopischen Schwellenreaktion versteht man aus den retinalen Ganglienzellen ^2-4 erzeugt werden. Zweitens kann der Flash-ERG durch Lichtanpassung zu trennen, oder durch eine zwei Flash-Protokoll weiter unten beschrieben, in Stab- und kegel angetriebenen Bestandteile. Unter photopischen Bedingungen ist der a-Welle nicht bei der Ratte nachweisbar sind, da der Konus Bevölkerung ist gering, aber OP und eine b-Welle sindklar ^5. In Primaten, deren Netzhaut eine höhere Konus Populationen sowohl Stab- und kegelWege ein nachweisbares eine Wellen ^6.

Zwei nützliche Maßnahmen oft aus dem Flash-ERG extrahiert sind die Amplituden der A- und B-Wellen gemessen, wie in Figur 1, mit typischen Flash-Antworten in 2 gezeigt. Wenn die Fotorezeptorpopulation verringert wird, beispielsweise durch Einwirkung von schädigend hellen Licht, sind alle Komponenten des ERG reduziert. Neuroprotektive Eingriffe, wie Fern ischämischen Präkonditionierung (RIP), kann durch den Erhalt der Amplituden der A- und B-Wellen (3) überprüft werden. Zusammenfassend ist die Analyse der ERG ermöglicht Vergleiche zwischen gesund, leicht beschädigt und neuroprotected Netzhaut.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Tierpflege University of Sydney.

1. Herstellung Elektroden

1. Konstruieren Sie die positive Elektrode (die eine, die die Hornhaut treten wird) von einem kurzen (5 cm) Länge der Platindraht 1-2 mm im Durchmesser. FaShion sie in einer Schleife wenige mm im Durchmesser. Verbinden Sie diese Schleife zu einer herkömmlichen Blei, lange genug, um die Eingangsstufe des Verstärkers zu erreichen (siehe Abbildung 4).
2. Konstruieren Sie die negative Elektrode mit einer Ag / AgCl-Pellet 1-2 mm Durchmesser, auch mit einem Kongress Leitung verbunden (die in das Maul des Tieres gehen wird) (siehe Abbildung 4).
3. Als eine Referenzelektrode (die in das Tier Rumpf gehen), mit einem sauberen Injektionsnadel (23 G), auch mit einer Leitung von geeigneter Länge verbunden (siehe Abbildung 4).
4. Idealerweise verwenden Drei-Blei-Kabel vom Gerätehersteller zur Verfügung gestellt, um die drei Elektroden anschließen (positive U94; Hornhaut, negativ → Mund, Referenz → Hinterteil) an den Verstärker.

2. Anschluss und Kalibrierung der Lichtreiz und ERG Set-up

1. Erstellen (oder suchen) einen kleinen Aufnahme Labor, das dunkel gemacht werden können. Rüsten Sie sich mit einer oder beiden der Over-the-Bank hellrot gemacht oder einem roten Kopf-Lampe.
2. Verwenden Sie ein Luxmeter zu bestätigen, dass rotes Licht Beleuchtungsstärke erreicht Auge der Ratte während der Installation ist 1 Lux nicht übersteigen.
   Hinweis: Ein Neutraldichtefilter verwendet werden, um die Helligkeit der Lampe zu verringern und die Quelle der Lampenlicht müssen ausdrücklich rotes Licht emittieren. Dunkeladaption wird gefährdet, wenn Lichtquellen strahlen unteren (sichtbaren) Wellenlängen.
3. Abdichtung alle Streulicht in das Aufnahmelabor (dies oft erfordert Ausdauer mit Deckband) und erstellt einen Neutraldichtefilter (dies kann in Platten gekauft werden) groß genug, um zu passen, und so dunkel, jeder Computer-Bildschirm finden Sie in der haben Labor.
   Hinweis: Streulicht unddas Licht eines Bildschirms ausreichend sind, um Dunkeladaption des Auges der Ratte zu beeinträchtigen.
4. Schließen Sie den Verstärker an Datenerfassungshardware. Schließen Sie positive, negative und Referenzleitungen an den Verstärker. Sicherstellen, dass der Computer und die LED-Ganzfeld-Netzteil fest mit einer Massequelle verbunden ist.
   Hinweis: Einige Labors haben Erdungspunkten spezialisiert, zu einem Gebäude Masse verbunden ist; eine Wasserleitung ist eine effektive Alternative.
5. Kalibrieren Sie die LED-Lichtquelle mit einer Forschungs hochwertige Radiometer. Fix-Sensor des Messgeräts in der Position, an der das Auge des Tieres wird während eines Experiments befinden.
6. Programmieren Sie die Ganzfeld-LEDs, um eine Vollfeld-ERG-Protokoll mit stufenweisen Anstieg der Blitzenergie, Blitzdauer, Flash-Wiederholung und die Zeit zwischen den Blitzen führen, bezeichnet interstimuls Intervall (ISI), Einstellungen. Ein Beispiel für Vollfeld-Protokoll finden Sie in Tabelle 1.
   Hinweis: Die Vollfeld-ERG blinkt erhöhen aus sich wiederholenden dim Wallungen zu brechts blinkt in einer schrittweisen Art und Weise. Das Doppel Flash-Programm folgt auf die Vollfeld-Protokoll und ermöglicht Isolierung von Stäbchen und Zapfen Antworten.

3. Tag vor der ERG Experimentation

1. Dunkle Sprague-Dawley Ratten anpassen 12 Stunden vor der Aufnahme. Es ist zweckmäßig, diese in der Aufzeichnung Labor tun, einmal Streulicht eliminiert wurde.

4. Tag der ERG Experimentation

1. Vereinbaren Sie für das Tier sanft während der Aufnahme erwärmt werden. Wir verwenden eine Leichtmetall-Plattform gebaut, damit Kopf des Tieres kann an der richtigen Stelle an der Einreise in das Ganzfeld ruhen. Die Plattform verfügt über eingebaute Schläuche, durch die wir die Pumpe Wasser auf 40 ° C vorgewärmt in einem Wasserbad.
   Anmerkung: Die Erfahrung zeigt, dass dies hält die Kerntemperatur des Tieres auf 37 ° C.
2. Wiegen Sie die Ratte bei schlechten Lichtverhältnissen. Nehmen Sie Gewicht und machen richtig Ketamin (60 mg / kg) und Xylazin (5 mg / kg) Dosis. Restrain die Ratte gently und injizieren Narkose intraperitoneal.
3. Hinweis Zeitpunkt der Injektion. Sobald das Tier bewusstlos ist (in der Regel innerhalb von 5 min) zu überprüfen Narkosetiefe durch leichtes Kneifen einem Fuß-Pad, um zu sehen, wenn ein Reflexantwort vorhanden ist. Es ist am besten zu warten, bis dieser Reflex nicht vorhanden oder schwach ist, bevor Sie fortfahren.
4. Tragen Sie einen Tropfen Atropin und andere der proxmethacaine zu Hornhaut.
5. Schneiden Sie ein 10 cm Länge der schwarzen Faden. Machen Sie eine Schleife mit einem einfachen Knoten und schieben Sie die Schleife über dem Äquator des Auges. Leicht anziehen; Der Effekt wird auf den Augapfel leicht nach vorne zu ziehen, mit minimalem Druck. Dies hält die Hornhaut von den Augenlidern klar.
6. Bewerben Carbomer Augentropfen auf die Hornhautoberfläche. Stellen Sie sicher, Carbomer bleibt auf Hornhautoberfläche und nicht auf den Augenlidern oder das Gesicht zu verschütten.
7. Zeigen saugfähigen Einstreu auf der Oberseite des beheizten Plattform.
8. Position Ratte auf dem Bettzeug, mit dem Kopf in der empfohlene Ort in der Öffnung des Ganzfeld.
9. Int Inserternal Temperatursonde in das Rektum. Sichere Temperaturfühler in Position durch Abkleben Sondenkabel mit dem Schwanz.
10. Legen Sie die Referenzelektrode (die 23 G-Nadel) subkutan in die hintere Bein, und eine Verbindung zum Verstärker.
11. Zeigen die negative Elektrode (die Ag / AgCl-Pellet) sicher in den Mund. Um dies zu verhindern ein Herausrutschen des Mundes, befestigen Sie die Anschlussleitung auf eine stabile Oberfläche.
12. Positionieren Sie die positive Elektrode über der Mitte der Hornhaut. Mit einem Mikromanipulator, sicherzustellen, dass die Elektrode die Hornhaut sanft berührt.
13. Überprüfen Sie die Körpertemperatur bei 37,0 bis 37,5 ° C.
14. Sobald das Tier richtig positioniert ist und Elektroden in aufgeführt sind, drapieren den gesamten Setup (Ganzfeld und Tier) mit einem undurchsichtigen Material (zur Dunkeladaptation zu erhalten). Wir verwenden Sie ein weiches schwarzes Tuch.
15. In der Erfassungssoftware bei einer 2 kHz Abtastrate mit einer Erfassungszeit von 100-1000 ms mit 5 msec der Pre-Kollektion Probenahme eingestellt. Stellen Sie die Bandpassfilter, um 1-1000Hz und sicher, dass Probenahme ausgelöst wird, um den Zeitraum von ~ 250 ms nach einer Flash-kosten.
16. Überprüfen Sie die Aufnahme Grundlinie. Es sollte frei von Fremdgeräusche, aber zeigen einige Verstärkerrauschen und eine Atmungsschwingung.
17. Wenn die Grundlinie zeigt Nebengeräusche, beginnen die Fehlersuche. Die meisten Probleme sind ähnlich wie in Elektrodenposition oder Erdungs ​​Schlupf. Verwenden Sie einen Faraday-Käfig, um sicherzustellen, Aufnahmen sind frei von Nebengeräuschen.
18. Führen Sie einen Testblitz, 0,4 log scot cd.sm ^-2. Eine ERG Wellenform ähnlich zu 2A erscheinen soll. In unserem Labor typische Antworten für eine 0,4 log scot cd.sm ^-2 Blitz sind (a-Welle: -474 ± 39 & mgr; V und b-Welle: 1512 ± 160 & mgr; V, n = 11).
19. Erlauben Tier zu dunkel wieder Anpassung für 10 min. Es ist zweckmäßig, diese 10 Minuten zu verwenden, um die Basislinie erneut prüfen.
20. Nach der Bestätigung der stabilen Signal Aufzeichnung starten.
21. Am Ende der Aufnahme-Session, überprüfen Sie, dass Körper temperature wurde beibehalten. Elektroden entfernen. Wenden Carbomer Polymers an Hornhäuten. Lassen Sie das Tier auf einem Heizkissen erholen, bis er vollständig mobil und aktiv, vor der Rückkehr in Stallungen.

5. Fern Ischämie

1. Führen Sie Fern Ischämie entweder wach oder anästhesiert Nagetiere.
2. Wird das Tier narkotisiert, legen Sie es auf eine beheizte Plattform (oben) und schieben Sie die Blutdruckmanschette über den oberen Teil der Hintergliedmaße, klare des Knies.
3. Wenn die Tiere auf der Handhabung verwendet wird, ist es möglich, dieses Verfahren ohne Betäubung durchzuführen; dies sind zwei Personen erforderlich. Eine Person hält den Tier sanft und die zweite gilt die Blutdruckmanschette und betreibt das Blutdruckmessgerät.
4. Für wach Tiere, verwenden Sie ein Stück Tuch ~ 15 cm x 30-50 cm vorsichtig wickeln Sie das Tier, mit einem Hinterlauf frei. Legen Sie das Tier auf den Rücken (sagen wir) den linken Unterarm, mit seinem Kopf zwischen dem Halter Arm und Oberkörper, und Ort verstecktdie Manschette wie gerade beschrieben.
5. Lassen Sie die Luft der Manschette und sicherzustellen, dass die Luftdruckventil geschlossen ist. Pumpen Sie die Manschette auf 160 mmHg in anästhesierten Tieren und bis 180 mmHg in wach Tiere. Dies übersteigt systolische Druck (in der Regel 140 mmHg und 160 mmHg beziehungsweise).
6. Pflegen Sie diesen Druck nach Bedarf, mit der Handpumpe.
7. Nach der geplanten Zeit für Ischämie (wir verwenden 2 Perioden von 5 Minuten mit dem 5 min Reperfusion getrennt), die Luft aus dem Manschettendruck durch Lösen der Druckluftventil.
8. Bestätigen Sie die Wirkung des Fern Ischämie mit einer Hauttemperatursonde in die Pfotenballen befestigt. Hauttemperatur fällt in der Regel 32 bis 30 ° C, während 5 min und stellt auf der Reperfusion.

6. Lichtschaden

1. Stellen Sie sicher, dass Ratten in einem dunkeladaptierten über Nacht, bevor die Lichtschäden Verfahren.
2. Zum geeigneten Zeitpunkt folgenden Extremitäten-Ischämie (in unseren Versuchen ohne Verzögerung), wird jedes Tier einzeln in eine Plexiglas-Boxen, wi platziertth Wasser und Nahrung in Boden-basierten Container.
   Hinweis: Lichtschäden können nur in Albino-Tieren durchgeführt werden.
3. Anschalten einer vorkalibrierten 1.000 Lux weißes Licht bei einer Standardzeit (in der Regel 9.00), und dieser Zustand für 24 h aufrechtzuerhalten.

7. ERG Datenextraktion und -analyse

1. Erwerben gemittelten Wellenformen der ERG. Falls erforderlich, für ein Nicht-Null-Grundlinie korrekt ist, durch Subtraktion.
2. Messen der Amplitude der A-Welle (in mittleren bis hohen Reizstärken dargestellt), da die Spannungsdifferenz zwischen der Basislinie und der ersten (<30 ms Latenz) Wanne (Abbildung 1).
3. Messung der b-Wellenamplitude als die Spannungsdifferenz zwischen der Spitze des a-Welle und der positiven der folgenden Welle, typischerweise bei einer Latenzzeit von 80-100 ms (Figur 1) auftritt.
4. Isolieren oszillierenden Potentiale unter Verwendung einer Fourier-Transformation, um Daten von 60 bis 235 Hz zu filtern, mit einer 90 Hz Gangsband ^{7. Bei Bedarf kann der isolierte Schwingungspotentialsignal kann dann von der ungefilterten Wellenform subtrahiert werden, um die Identität des a-Wellental zu bestätigen.}
5. Die implizite Zeit (Latenz) der a- und b-Wellenberge können auch eine sinnvolle Maßnahme (Abbildung 1) ist. Verwenden Sie die Zwillings blinkt, um den Stab Reaktion zu isolieren. Subtrahieren Sie die Konus-Antwort (Flash-2) aus dem Mischantwort (Flash-1), um den Stab Reaktion zu isolieren (Abbildung 2).
6. Normalisieren einzelnen Lichtintensität einen Wellen und b-Wellenamplituden (Nachbehandlung / Nachbehandlung-Basislinie) oder gemittelt für den Behandlungsgruppen. Intensity-Wirkungs-Kurven zeichnen die Gruppe Amplituden und Fehler gegen Blitzenergie.

Ergebnisse

Das Protokoll kann verwendet werden, um die Sehfunktion von Nagetier Retina in vivo zu messen. Die a-Welle, ein Maß für Photorezeptor-Funktion und die b-Welle, ein Maß für innere Retina-Funktion werden in 1 gekennzeichnet.

Die stab dominiert ERG-Signal mit zunehmendem Lichtreiz, wie in 2A gezeigt. Die a-Welle wird bei ~ 0,4 log Scot cd.sm ^-2 und die Amplitude der A-Welle zu, bis Sättigung bei 2,5 log Scot cd.sm ^-2 (nicht d...

Diskussion

Die oben beschriebene dunkeladaptierten Flash ERG Verfahren ist eine zuverlässige Methode zur Beurteilung Retinafunktion bei Ratten. Sowohl die A-Welle und b-Welle wurden durch Lichtschäden reduziert. Remote ischämischen Präkonditionierung gemildert Lichtschäden induzierte Reduktionen in der a-Welle und b-Welle. Diese Erhaltung der Netzhautfunktion legt nahe, dass Remote-ischämischen Präkonditionierung induziert hat Neuroprotektion, ähnlich andere Formen der Schutz Präkonditionierung wie Hypoxie, Ischämie und ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware	AD Instruments	PL 35044	Acquistion of ERG
Animal Bio Amp	AD Instruments	FE 136	Amplifier for ERG
Lab chart	AD Instruments		Signal collection software
Ganzfield	Photometric solutions	FS-250A	Light stimulus
Ganzfield operating system	Photometric solutions
Research Radiometer	International light technologies	ILT-1700	calibrate light series
Lux meter		LX-1010B	check red light illumanation
Excel	Microsoft
Lead wires	AD Instruments		Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires - alligator	AD Instruments		ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95%	A&E metals		postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet	SDR	E205	negative electode
26 G needle	BD		ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe	Harvard Appartus	507222F
Atropine 1% w/v	Bausch & Lomb		topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v	Bausch & Lomb		topical anaesthetic
Visco tears eye drops	Novartis		carbomer polymer
Thread			retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive	Blu tac		Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		dissociative
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		muscle relaxant
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