Utilizzando il Elettroretinogramma per valutare la funzione in roditori Retina e gli effetti protettivi del Remote Limb ischemico precondizionamento

Riepilogo

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

Abstract

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the ‘flash’ ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

Introduzione

L'ERG è un potenziale elettrico generato dalla retina in risposta alla luce, e registrato dalla superficie corneale dell'occhio. Quando le condizioni di registrazione vengono gestite accuratamente, l'ERG può essere utilizzato in una varietà di modi per valutare la funzione retinica. Qui abbiamo descritto come registrare il 'Flash ERG', il potenziale generato quando la retina è esposto a un breve lampo, luminoso presentato in uno sfondo Ganzfeld. Il Ganzfeld disperde la luce in modo omogeneo e il lampo di luce raggiunge tutta la retina di circa uniforme. Se la retina è scuro adattato prima della registrazione, e il buio-adattamento è mantenuto come l'animale è preparato per la registrazione, l'ERG ha ottenuto è generato da due bastoncelli e coni.

Il-scuro adattato Flash ERG ha una forma d'onda caratteristica, che è stato analizzato in due modi. Innanzitutto, precoci e tardive componenti della forma d'onda ERG sono stati distinti, e relativi alla sequenza di neuroneal attivazione nella retina. Il primo componente è una breve latenza andamento negativo potenziale, l'a-onda (Figura 1). Questo è seguito da un potenziale positivo continuo, chiamato b-wave. La fase di salita del b-wave mostra oscillazioni, che sono considerate un componente separato (potenziali oscillatori o PO). L'a-onda è considerato essere generato da fotorecettori, il b-wave dalle cellule dello strato nucleare interno e dei PO dalle cellule amacrine ^1.

Sulla base della forza dello stimolo, risposte a molto fioche lampeggia definito la risposta di soglia scotopica sono possibili. La risposta di soglia scotopica è inteso essere generato dalle cellule gangliari retiniche ^2-4. In secondo luogo, il flash ERG può essere separata da adattamento alla luce, o da un protocollo due Flash descritto di seguito, in componenti di noccioli e cono guidato. In condizioni fotopiche, l'a-onda non è rilevabile nei ratti, perché la popolazione cono è basso, ma PO e un b-wave sonochiaro ^5. Nei primati, le cui retine avere popolazioni cono più elevati, sia Rod- e percorsi di cono generano un rilevabile un onda ^6.

Due misure utili spesso estratte dal flash ERG sono le ampiezze dei a- e b-onde, misurate come nella figura 1, con risposte in flash tipici mostrati in Figura 2. Quando la popolazione fotorecettore è ridotto, per esempio mediante esposizione a pericolosamente luminoso luce, tutti i componenti del ERG sono ridotti. Interventi neuroprotettivi, come ad esempio a distanza precondizionamento ischemico (RIP), possono essere convalidati dalla conservazione delle ampiezze delle a- e b-onde (Figura 3). In sintesi, l'analisi della ERG consente confronti tra sano, leggero e della retina danneggiate neuroprotected.

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali di Università di Sydney.

1. Realizzazione di elettrodi

1. Costruire l'elettrodo positivo (quello che contattare la cornea) da un breve (5 cm) lunghezza del filo di platino 1-2 mm di diametro. Adatti in un loop di pochi mm di diametro. Collegare questo circuito ad un cavo tradizionale, abbastanza a lungo per raggiungere la fase di ingresso dell'amplificatore (vedi Figura 4).
2. Costruire l'elettrodo negativo (che andrà in bocca all'animale) utilizzando un Ag / AgCl pellet 1-2 mm di diametro, anche collegata ad un cavo convenzione (vedi Figura 4).
3. Come un elettrodo di riferimento (che entrerà in groppa dell'animale), utilizzare un ago ipodermico pulita (23 G), anche collegata ad un cavo di lunghezza appropriata (vedere Figura 4).
4. Idealmente, utilizzare cavi a tre lead forniti dai produttori di strumenti, per collegare i tre elettrodi (positiva U94; cornea, negativo → bocca, riferimento → groppa) all'amplificatore.

2. Connessione e calibrazione di stimolo luminoso e ERG Set-up

1. Creare (o individuare) un piccolo laboratorio di registrazione, che può essere fatta scuro. Dotare con uno o entrambi di una luce over-the-banco fatto rosso o una testa-spia rossa.
2. Utilizzare un metro lux per confermare che l'illuminamento a luci rosse raggiungere l'occhio del ratto durante l'installazione non supera 1 lux.
   Nota: un filtro a densità neutra può essere utilizzato per ridurre la luminosità della lampada e la sorgente di luce della lampada deve specificamente emettere luce rossa. Adattamento scuro sarà compromessa se fonti di luce emettono inferiori (visibili) lunghezze d'onda.
3. Sigillare tutta la luce parassita di entrare nel laboratorio di registrazione (questo spesso richiede la persistenza con nastro opaco) e preparare un filtro a densità neutra (questo può essere acquistato in fogli) grande abbastanza da contenere oltre, e così debole, qualsiasi schermo del computer si avrà nel laboratorio.
   Nota: luce diffusa ela luce di uno schermo sono sufficienti a pregiudicare adattamento scuro dell'occhio ratto.
4. Collegare l'amplificatore di hardware di acquisizione dati. Collegare i cavi, negativi e positivi di riferimento per l'amplificatore. Assicurarsi che il computer e l'unità di alimentazione Ganzfeld LED siano collegati a una presa di terra.
   Nota: Alcuni laboratori sono specializzati punti di terra, collegato ad una terra dell'edificio; un tubo di acqua è un'alternativa efficace.
5. Calibrare la sorgente luminosa a LED con un radiometro di ricerca di qualità. Fissare sensore dello strumento nella posizione in cui l'occhio dell'animale sarà situato durante un esperimento.
6. Programmare i LED Ganzfeld per eseguire un protocollo di ERG a tutto campo con aumenti passo-saggio in energia flash, durata del flash, flash ripetizione e tempo tra lampi, chiamato intervallo interstimuls (ISI), le impostazioni. Ad esempio, un protocollo a tutto campo si veda la tabella 1.
   Nota: Il full-campo ERG lampi passano da ripetitivi dim lampeggia per Blampeggia a destra in modo saggio passo. Il programma Twin Flash fa seguito al protocollo a tutto campo e consente l'isolamento di coni e bastoncelli risposte.

3. Giorno Prima di ERG Sperimentazione

1. Scuro adattare ratti Sprague-Dawley di 12 ore prima della registrazione. È conveniente fare questo in laboratorio di registrazione, una volta che la luce esterna è stata eliminata.

4. Giorno di ERG Sperimentazione

1. Disporre per l'animale sia dolcemente riscaldata durante la registrazione. Usiamo una piattaforma di metallo leggero costruito in modo che la testa dell'animale può riposare al giusto punto all'entrata al Ganzfeld. La piattaforma ha integrato tubo attraverso cui si pompa acqua preriscaldata a 40 ° C in un bagno d'acqua.
   Nota: L'esperienza dimostra che questo mantiene la temperatura interna dell'animale a 37 ° C.
2. Pesare il ratto in condizioni di oscurità. Peso record e portare corretto ketamina (60 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) dose. Trattenere il ratto gently e iniettare anestetico per via intraperitoneale.
3. Nota momento dell'iniezione. Una volta che l'animale è incosciente (di solito entro 5 min) verificare la profondità dell'anestesia pizzicando leggermente un rilievo del piede, per vedere se una risposta riflessa è presente. E 'meglio aspettare fino a quando questo riflesso è assente o debole, prima di procedere.
4. Applicare una sola goccia di atropina e un altro di proxmethacaine alla cornea.
5. Tagliare una lunghezza 10 centimetri di filo nero. Fare un cappio con un nodo semplice e scivolare l'anello sopra l'equatore dell'occhio. Stringere leggermente; l'effetto è quello di disegnare il bulbo oculare leggermente in avanti, con pressione minima. Ciò mantiene la cornea risulta dalle palpebre.
6. Applicare occhio carbomer scende verso la superficie della cornea. Garantire carbomer rimane sulla superficie corneale e non fuoriesca sulle palpebre o la faccia.
7. Posizionare assestamento assorbente in cima piattaforma riscaldato.
8. Posizionare topo sulla biancheria da letto, con la testa nel posto consigliato nell'apertura del Ganzfeld.
9. Inserisci intsonda di temperatura ernal nel retto. Sonda di temperatura sicuro in posizione con nastro adesivo il cavo della sonda fino alla coda.
10. Inserire l'elettrodo di riferimento (l'ago 23 G) per via sottocutanea nella gamba posteriore, e la connessione all'amplificatore.
11. Inserire l'elettrodo negativo (il pellet Ag / AgCl) saldamente in bocca. Per evitare che questo scivolare fuori dalla bocca, apporre il cavo di collegamento di una superficie stabile.
12. Posizionare l'elettrodo positivo sul centro della cornea. Utilizzando un micromanipolatore, assicurarsi che l'elettrodo tocca la cornea delicatamente.
13. Controllare la temperatura del corpo è al 37,0-37,5 ° C.
14. Una volta che l'animale è posizionato correttamente e gli elettrodi sono in atto, copre l'intero setup (Ganzfeld e animale) con un materiale opaco (per preservare adattamento al buio). Usiamo un panno morbido nera.
15. Nel software di acquisizione fissato a una frequenza di campionamento 2 KHz con un tempo di raccolta di 100-1000 msec con 5 msec di prelevamento dei campioni pre-collezione. Impostare i filtri passa banda a 1-1,000Hz e assicura che il campionamento viene attivato per assaggiare il periodo di ~ 250 msec dopo un lampo.
16. Controllare la linea di base della registrazione. Dovrebbe essere esente da disturbi esterni, ma mostrare un po 'di rumore amplificatore e una oscillazione respiratoria.
17. Se la linea di base mostra rumori estranei, iniziare la risoluzione dei problemi. La maggior parte dei problemi sono legati allo scivolamento in posizione degli elettrodi, o incaglio. Utilizzare una gabbia di Faraday per garantire registrazioni siano privi di rumore estraneo.
18. Eseguire un lampo di prova, 0,4 log scot cd.sm ^-2. Una forma d'onda ERG simile alla figura dovrebbe apparire 2A. Nelle nostre risposte tipiche di laboratorio per un 0,4 log scot cd.sm ^-2 Flash sono (a-wave: -474 ± 39 mV e b-wave: 1.512 ± 160 mV, n = 11).
19. Lasciare animale scuro riadattare per 10 min. E 'conveniente usare questi 10 minuti di ricontrollare la linea di base.
20. A seguito della conferma del segnale stabile avviare la registrazione.
21. Alla fine della sessione di registrazione, controllare che il corpo temperature è stata mantenuta. Rimuovere gli elettrodi. Riapplicare carbomer polimero cornee. Permettere agli animali di recuperare su un blocco di calore finché non è completamente mobile e attivo, prima di tornare a stabulazione degli animali.

5. Ischemia Remote

1. Eseguire ischemia a distanza sia in roditori svegli o anestetizzati.
2. Se l'animale è anestetizzato, adagiarlo su una piattaforma riscaldata (sopra) e infilare il bracciale sfigmomanometro sulla parte superiore della arti posteriori, chiara del ginocchio.
3. Se gli animali sono abituati ad essere manipolati, è possibile eseguire questa procedura senza anestesia; questo richiede due persone. Una persona trattiene l'animale delicatamente e il secondo si applica il bracciale sfigmomanometro e gestisce il misuratore di pressione.
4. Per gli animali svegli, utilizzare un pezzo di asciugamano ~ 15 centimetri x 30-50 cm per avvolgere delicatamente l'animale, con uno degli arti posteriori gratuito. Posare l'animale sul dorso su (ad esempio) l'avambraccio sinistro, con la testa infilata tra il braccio del titolare e il tronco, e luogoil bracciale come appena descritto.
5. Sgonfiare il bracciale e garantire la valvola dell'aria viene chiusa. Pompare il bracciale a 160 mmHg in animali anestetizzati, e a 180 mmHg negli animali svegli. Ciò supera la pressione sistolica (di solito 140 mmHg e 160 mmHg, rispettivamente).
6. Mantenere queste pressioni, come richiesto, utilizzando la pompa a mano.
7. Trascorso il tempo previsto per ischemia (usiamo 2 periodi di 5 minuti separati da 5 min riperfusione), sgonfiare la pressione del bracciale svitando la valvola dell'aria.
8. Confermare l'effetto di ischemia remota con una sonda di temperatura della pelle attaccata alla zampa. La temperatura cutanea scende tipicamente 32-30 ° C, più di 5 minuti e recupera su riperfusione.

6. Danni Luce

1. Assicurarsi che i ratti sono in un buio adattato durante la notte, prima che la procedura di danno chiaro.
2. Al momento opportuno a seguito di ischemia degli arti (nei nostri esperimenti senza indugio), ogni animale viene posto singolarmente in scatole di plexiglass, with acqua e cibo in contenitori di pavimento-based.
   Nota: il danno indotto dalla luce può essere intrapresa solo in animali albini.
3. Accendere una luce bianca pre-calibrato 1.000 lux a un tempo standard (di solito 09:00) e mantenere questa condizione per 24 ore.

7. ERG Estrazione dei dati e analisi

1. Acquisire forme d'onda medio della ERG. Se necessario, corretto per una linea di base non-zero, per sottrazione.
2. Misurare l'ampiezza della a-onda (presentato a metà a intensità elevate stimolo), come la differenza di tensione tra la linea di base e la prima (<30 msec latenza) trogolo (Figura 1).
3. Misurare l'ampiezza dell'onda b come la differenza di tensione tra il picco di una onda e il positivo delle seguenti onda, tipicamente si verificano in una latenza di 80-100 msec (Figura 1).
4. Isolare potenziali oscillatorie utilizzando una trasformata di Fourier per filtrare i dati 60-235 Hz, con una banda di transizione 90 Hz ^{7. Se necessario il isolato potenziale segnale oscillatorio può essere sottratta dalla forma d'onda non filtrato per confermare l'identità di un trogolo onda.}
5. Il tempo implicito (latenza) del tipo A e B onda picchi può anche essere una misura utile (Figura 1). Utilizzare i gemelli lampeggia per isolare la risposta canna. Sottrarre la risposta cono (flash 2) dalla risposta mista (flash 1) per isolare la risposta asta (Figura 2).
6. Normalizzare l'intensità della luce individuale un onda e ampiezze b-onda (post-trattamento / post-trattamento-base) o media per i gruppi di trattamento. Curve Intensity-risposta tracciare le ampiezze di gruppo e l'errore contro l'energia del flash.

Risultati

Il protocollo può essere utilizzato per misurare la funzione visiva di roditore retina in vivo. L'a-onda, una misura della funzione fotorecettori, e b-wave, una misura della funzione retina interna, vengono annotati in Figura 1.

I asta dominato ERG segnale aumenta con la crescente stimolo luminoso, come mostrato nella figura 2A. L'a-onda diventa chiaro a ~ 0,4 log scot cd.sm ^-2 e l'ampiezza delle onde un aumenta fino a satura...

Discussione

Il flash metodo di ERG adattata al buio sopra descritto è un metodo affidabile per valutare la funzione della retina nei ratti. Sia l'una-wave e b-wave sono stati ridotti del danno chiaro. Remote precondizionamento ischemico mitigata riduzioni danni indotti luce del un-wave e b-wave. Questa conservazione della funzione retinica suggerisce che a distanza precondizionamento ischemico ha indotto neuroprotezione, simile ad altre forme di precondizionamento protettivi quali ipossia, ischemia e l'esercizio ^8-10....

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware	AD Instruments	PL 35044	Acquistion of ERG
Animal Bio Amp	AD Instruments	FE 136	Amplifier for ERG
Lab chart	AD Instruments		Signal collection software
Ganzfield	Photometric solutions	FS-250A	Light stimulus
Ganzfield operating system	Photometric solutions
Research Radiometer	International light technologies	ILT-1700	calibrate light series
Lux meter		LX-1010B	check red light illumanation
Excel	Microsoft
Lead wires	AD Instruments		Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires - alligator	AD Instruments		ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95%	A&E metals		postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet	SDR	E205	negative electode
26 G needle	BD		ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe	Harvard Appartus	507222F
Atropine 1% w/v	Bausch & Lomb		topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v	Bausch & Lomb		topical anaesthetic
Visco tears eye drops	Novartis		carbomer polymer
Thread			retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive	Blu tac		Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		dissociative
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		muscle relaxant
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