Использование электроретинограммы чтобы оценить функцию в грызунов Retina и защитные эффекты дистанционного конечностей ишемического прекондиционирования

Резюме

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

Аннотация

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the ‘flash’ ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

Введение

Эрг электрический потенциал, создаваемый сетчатки в ответ на свет, и записаны с поверхности роговицы глаза. Когда условия записи будут тщательно управлять, ЭРГ может быть использована в различных способов оценки функции сетчатки. Здесь мы описали, как записать 'флэш ЭРГ', потенциал генерируется, когда сетчатка подвергается краткого, яркой вспышкой, представленной в Ganzfeld фоне. Ganzfeld рассеивает свет равномерно и вспышка света достигает сетчатки весь приблизительно равномерно. Если сетчатка адаптируются к темноте перед записью, и темно-адаптация сохраняется, как животное готовится к записи, ЭРГ получены порождается как палочек и колбочек фоторецепторов.

Темно-адаптированы флэш ЭРГ имеет характерный сигнала, который был проанализирован в двух направлениях. Во-первых, ранние и поздние компоненты сигнала ЭРГ были отмечены, и связана с последовательностью нейронааль активации в сетчатке. Раннее компонент короткое время ожидания отрицательно собирается потенциал, волны (рис 1). Это сопровождается положительным потенциалом-происходит, называется би-волну. Растет фаза б-волны показывает колебания, которые считаются отдельным компонентом (колебательные потенциалы или ОП). Волны считается порождается фоторецепторов, б-волна клетками внутренней ядерного слоя, и ОП по амакринных клеток ^1.

Основываясь на прочность стимула, ответы на очень тусклые вспышки называется скотопическое порог срабатывания возможно. Скотопическое порог срабатывания понимается быть получены из ганглиозных клеток сетчатки ^2-4. Во-вторых, флэш-ЭРГ может быть отделена от световой адаптации, или в соответствии с протоколом двух флэш описано ниже, в rod- и конусных приводом компонентов. Под фотопических условиях, волны не прощупывается у крыс, потому что население конус низкий, но ОПС и б-волна вясно ^5. У приматов, чьи сетчатки имеют более высокие населения конуса, и rod- и cone- пути генерации обнаруживаемого а-волна ^6.

Два полезных мероприятия часто, извлеченные из вспышки ERG являются амплитуды а- и В-волн, измеренные как показано на рисунке 1, с типичными ответами флэш показанных на рисунке 2. При население фоторецепторов снижается, например, воздействия разрушительно яркий свет, все компоненты ЭРГ снижаются. Нейропротекторные вмешательства, такие как удаленный ишемическая предварительной подготовки (RIP), может быть подтверждено сохранение амплитуд а- и В-волн (рис 3). В целом, анализ ЭРГ позволяет сравнивать между здоровой, легкой и поврежденных neuroprotected сетчатки.

протокол

Этот протокол следует рекомендациям по уходу животное университета Сиднея.

1. Внесение Электроды

1. Построить положительный электрод (тот, который будет контактировать с роговицы) с короткого (5 см) длины платиновой проволоки 1-2 мм в диаметре. Изготовьте его в петлю на несколько мм в диаметре. Подключите эту петлю к обычной свинца, достаточно долго, чтобы достичь входного каскада усилителя (рисунок 4).
2. Построить отрицательный электрод (который пойдет в рот животного), используя Ag / AgCl осаждения 1-2 мм в диаметре, также подключенный к конференц-свинец (рисунок 4).
3. Как электрод (который будет идти в крупе животного), используйте чистую иглу (23 G), также подключенный к проводу соответствующей длины (см рисунок 4).
4. В идеале, используйте три свинцовых кабелей, предоставляемые производителями приборов, чтобы соединить три электрода (положительного U94; Роговица, отрицательный → рот ссылка → крупу) к усилителю.

2. Подключение и калибровка световой раздражитель и ERG Set-вверх

1. Создание (или местонахождение) небольшую лабораторию записи, которые могут быть сделаны темными. Одета с одного или обоих из света более-скамейки из красного или красной головой лампы.
2. Используйте метр люкса, чтобы подтвердить, что красный свет освещенности идущие глаз крысы во время установки не превышает 1 лк.
   Примечание: фильтр нейтральной плотности может быть использован для уменьшения яркости лампы и источником света лампы должны излучать специально красный свет. Темно-адаптация будет нарушена, если источники света излучают более низкие (видимые) длины волн.
3. Заглушить все рассеянный свет, поступающий в лабораторию записи (это часто требует настойчивости с непрозрачной лентой) и подготовить фильтр нейтральной плотности (это могут быть приобретены в листах), достаточно большой, чтобы соответствовать по, и так скептически, любой экран компьютера у вас будет в лаборатория
   Примечание: Рассеянный свет исвет экрана достаточно, чтобы нанести ущерб темно адаптации крыс глаз.
4. Подключите усилитель к оборудованию сбора данных. Подключите положительные, отрицательные и справочные ведет к усилителю. Убедитесь, что компьютер и LED Ganzfeld блок питания надежно подключен к источнику заземления.
   Примечание: Некоторые лаборатории специализируются точки заземления, подключается к строительной площадке; водопровод является эффективной альтернативой.
5. Калибровка светодиодный источник света с исследования качества радиометра. Fix датчик измерителя в положение, при котором глаз животного будет находиться во время эксперимента.
6. Запрограммируйте Ganzfeld светодиоды запустить полный поле ERG протокол с ступенчатых увеличивается в флэш энергии, длительности вспышки, вспышки повторения и время между вспышками, называется interstimuls интервал (ISI), настройки. Для протокола пример полного поля табл 1.
   Примечание: полный поле ERG мигает увеличится с повторяющимися вспышками тусклых бправый мигает в такт мудрым моды. Близнец программа флэш вытекает из протокола полный поля и позволяет изоляции палочек и колбочек ответов.

3. За день до ERG экспериментированию

1. Темно-адаптировать Спрэг Dawley крыс в течение 12 часов до начала записи. Это удобно делать это в лаборатории записи, когда рассеянный свет был ликвидирован.

4. День ERG экспериментированию

1. Организовать животных, чтобы быть осторожно нагревают во время записи. Мы используем легкого металла платформу, созданную таким образом, чтобы голова животного может отдохнуть в правильной точке на входе в Ganzfeld. Платформа имеет встроенный трубки, через которую мы перекачивать воду, предварительно нагретую до 40 ° С на водяной бане.
   Примечание: Опыт показывает, что это удерживает внутреннюю температуру животного при 37 ° С.
2. Взвесьте крысы в ​​условиях низкой освещенности. Вес Запись и составляют правильный кетамин (60 мг / кг) и Ксилазин (5 мг / кг) дозы. Задержите крысу поколенияTLY и ввести анестетик внутрибрюшинно.
3. Примечание время инъекции. После того, как животное находится в бессознательном состоянии (обычно в течение 5 мин) проверить глубину анестезии, слегка зажимая одну ногу площадку, чтобы увидеть, если рефлекторный ответ присутствует. Лучше всего подождать, пока этот рефлекс не отсутствует или слабый, прежде чем продолжить.
4. Нанесите каплю атропина и другой из proxmethacaine к роговице.
5. Вырезать 10 см длины черной ниткой. Сделайте петлю с простым узлом и скольжения петли над экватором глаза. Затянуть слегка; Эффект привлечь глазное яблоко немного вперед, с минимальным давлением. Это позволяет роговицы видно из век.
6. Применить карбомер глазные капли на поверхности роговицы. Убедитесь, карбомер остается на поверхности роговицы и не проливать на веки или лица.
7. Поместите впитывающую постельные принадлежности поверх нагретой платформы.
8. Положение крысы на постельные принадлежности, с головой в рекомендуемой место в открытии Ganzfeld.
9. Вставьте INTernal датчик температуры в прямой кишке. Безопасный температурный зонд в положении лентой зонд шнур к хвосту.
10. Вставьте электрод сравнения (23 г) иглы подкожно в заднюю ногу, и подключиться к усилителю.
11. Поместите отрицательный электрод (осадок Ag / AgCl) надежно во рту. Чтобы предотвратить это ускользает из рот, закрепите соединительный провод к устойчивой поверхности.
12. Поместите положительный электрод по центру роговицы. Использование микроманипулятора, убедитесь, что электрод касается роговицы осторожно.
13. Проверьте температура тела на 37,0 - 37,5 ° С.
14. После того, как животное правильно и электроды находятся в месте, задрапировать всю установку (Ganzfeld и животных) с непрозрачного материала (для сохранения темно адаптации). Мы используем мягкую черную ткань.
15. В программное обеспечение сбора, установленного при частоте дискретизации 2 кГц при времени сбора 100-1000 мс с 5 мс выборки предварительно сбора. Установите полосовые фильтры 1-1,000Гц и обеспечить отбор срабатывает попробовать период ~ 250 мс следующей вспышки.
16. Проверьте записи базового. Он должен быть свободным от посторонних шумов, но показать некоторые усилитель шума и дыхательной колебания.
17. Если базовый показывает посторонний шум, начинают поиск и устранение неисправностей. Большинство проблем связано с проскальзывание в положении электрода или заземления. Используйте клетка Фарадея, чтобы записи были свободны от посторонних шумов.
18. Запуск тестовой вспышки, 0,4 журнала шотландец cd.sm ^-2. ЭРГ сигнала как на рисунке 2А должен появиться. В наших лабораторных типичных ответов на 0,4 журнала шотландец cd.sm ^-2 вспышки являются (волны: -474 ± 39 мкВ и б-волны: 1512 ± 160 мкВ, п = 11).
19. Разрешить животных до темно-ре-адаптации в течение 10 мин. Это удобно использовать эти 10 минут, чтобы перепроверить базовый уровень.
20. После подтверждения стабильного сигнала начать запись.
21. В конце сессии записи, проверить, что тела TEMPERATЮр была сохранена. Удалить электродов. Повторно карбомер полимера к роговицы. Разрешить животных для восстановления на тепловой площадку до тех пор, пока полностью мобильным и активным, прежде чем вернуться в помещениях для содержания животных.

5. Дистанционное ишемии

1. Выполните дистанционного ишемии либо активных или обезболивание грызунов.
2. Если животное находится под наркозом, положите его на разогретую платформы (выше) и скольжения сфигмоманометрическая манжету на верхней части задних конечностей, с отрывом от колена.
3. Если животные используются для обрабатывается, можно выполнить эту процедуру без анестезии; это требует двух человек. Один человек сдерживает животное осторожно и второй применяется сфигмоманометрическая манжеты и работает сфигмоманометре.
4. Для активных животных, использовать кусок полотенце ~ 15 см х 30-50 см, чтобы мягко обернуть животное, с одной задней конечности бесплатно. Положите животное на спину на (скажем) левого предплечья, с его головы заправленные между рукой и туловищем владельца и местаманжеты, как описано выше.
5. Выпустите манжету и обеспечить клапан давления воздуха закрыт. Насос манжету до 160 мм рт.ст. обезболивание животных и 180 мм рт.ст. в активных животных. Это превышает систолическое давление (обычно 140 мм рт.ст. и 160 мм рт.ст. соответственно).
6. Поддержание этого давления по мере необходимости, с помощью ручного насоса.
7. После запланированное время для ишемии (мы используем 2 периода по 5 минут, разделенных на 5 мин реперфузии), выкачать давление в манжете, ослабив клапан давления воздуха.
8. Подтверждение эффект дистанционного ишемии с температуры кожи зонда, прикрепленного к подушечку лапы. Температура кожи, как правило, падает с 32-30 ° С, в течение 5 мин и восстанавливает на реперфузии.

6. Свет Нанесенный

1. Убедитесь, что крысы в ​​темно-адаптированы ночь, перед процедурой легкий ущерб.
2. В соответствующее время после ишемии конечности (в наших опытах без задержки), каждое животное помещают отдельно в плексиглас коробки, Wiй воды и пищи в пол на основе контейнеров.
   Примечание: Свет-индуцированного повреждения могут быть предприняты только в белых животных.
3. Включение предварительно откалиброван 1000 лк белым светом при стандартной времени (как правило, 9 утра) и поддерживать это состояние в течение 24 ч.

7. ЭРГ Извлечение данных и анализ

1. Приобретать усредненные волновые формы ЭРГ. При необходимости, правильно для ненулевого базовой, путем вычитания.
2. Измерьте амплитуду а-волны (представленной на средних и высоких интенсивностей стимулирования), а разность напряжений между линией и первым (<30 мс задержки) корыто (Рисунок 1).
3. Измерьте амплитуду б-волны как разность напряжений между пиком а-волны и позитив следующей волны, как правило, происходит в латентности 80-100 мс (рис 1).
4. Изолировать колебательные потенциалы с помощью преобразования Фурье для фильтрации данных из 60-235 Гц, с 90 Гц переходной полосой ^{7. При необходимости изоляции колебательный потенциал сигнала затем могут вычитаться из нефильтрованного сигнала, чтобы подтвердить личность волны корыта.}
5. Неявный (задержки) из а- и б-волновых пиков также может быть полезной мерой (Рисунок 1). Используйте двойной вспышки, чтобы изолировать реакцию стержня. Вычтите ответ конуса (флэш 2) из смешанного ответ (флэш-1), чтобы изолировать реакцию стержня (рис 2).
6. Нормализовать отдельному интенсивности света а-волну и б амплитуд (пост-обработка / пост-обработка-Baseline), или в среднем по группам лечения. Кривые интенсивности-ответ участок амплитуды групповых и ошибки в отношении флэш-энергии.

Результаты

Протокол может быть использован для измерения зрительной функции сетчатки грызунов в естественных условиях. Волны, мера функции фоторецепторов, и б-волна, мера внутренней функции сетчатки, в примечаниях на рисунке 1.

Стержневые доминируют ERG сигнала возра?...

Обсуждение

Флэш-метод темного приспособлены ЭРГ описано выше надежный метод для оценки функции сетчатки у крыс. И волны и б-волна сократились на свет повреждения. Удаленная ишемическая предварительная смягчены сокращения легкие повреждения, вызванной в а-волны и В-волны. Это сохранение функции с...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware	AD Instruments	PL 35044	Acquistion of ERG
Animal Bio Amp	AD Instruments	FE 136	Amplifier for ERG
Lab chart	AD Instruments		Signal collection software
Ganzfield	Photometric solutions	FS-250A	Light stimulus
Ganzfield operating system	Photometric solutions
Research Radiometer	International light technologies	ILT-1700	calibrate light series
Lux meter		LX-1010B	check red light illumanation
Excel	Microsoft
Lead wires	AD Instruments		Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires - alligator	AD Instruments		ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95%	A&E metals		postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet	SDR	E205	negative electode
26 G needle	BD		ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe	Harvard Appartus	507222F
Atropine 1% w/v	Bausch & Lomb		topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v	Bausch & Lomb		topical anaesthetic
Visco tears eye drops	Novartis		carbomer polymer
Thread			retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive	Blu tac		Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		dissociative
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		muscle relaxant
Scale