מדידה המרבית איזומטרי הכוח שנוצרה על ידי סיבי שריר שלד permeabilized

Summary

ניתוח של מאפייני ההתכווצות של סיבי שריר כימי עור, או permeabilized, שלד מציע אמצעי רב עוצמה שבאמצעותו להעריך את תפקוד שרירים ברמה של תא השריר הבודד. במאמר זה אנו מתארים טכניקה תקפה ומהימנה להכנה ובדיקת permeabilized סיבי שריר שלד במבחנה.

Abstract

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Introduction

התפקיד העיקרי של שרירי שלד הוא ליצור כוח. כוח השריר שהושרו בvivo דרך רצף אירועים מורכב הכולל פוטנציאלי עצב מוטורי פעולה, העברת עצבית-שרירית, פוטנציאל פעולת סיב שריר, שחרור של סידן תוך תאי, והפעלה של המערכת של חלבונים רגולטוריים והתכווצות. בגלל דור כוח הוא התוצאה הסופית של רצף זה, גירעון בכוח יכול להיגרם על ידי כישלון של אחד או יותר מהצעדים הבודדים. תכונת מפתח של הכנת סיבי permeabilized היא שזה מבטל את רוב הצעדים הנדרשים לדור כוח in vivo, עם רק את הפונקציות רגולטוריות והתכווצות הקשורים למנגנון myofibrillar שנותר. החוקר מניח את שליטה על האספקה ​​של הפעלת סידן ואנרגיה (ATP), וזוכה למערכת פשוטה המאפשרת הערכה של המבנים רגולטוריים והתכווצות המבודדים בשיתוף מולדתםnfiguration. מדידות של כוח באמצעות סיבי שריר שלד permeabilized הן כך יקרות כאשר להערכת שינויים בתפקוד שרירים נצפה in vivo. לדוגמא, השתמשנו בטכניקה זו כדי לאפיין את יכולת כוח יצירת של סיבים מעכברים חסרי מיוסטטין ¹ ולהעריך את הגורם לחולשת שרירים מתמשך הציגה הבא דמעות שרוול מסובב כרוני ^2,3.

המתודולוגיה סיבי permeabilized מודרנית ניתן לייחס ללימודי השפעה מוקדמים ^4,5 ונמצאת כעת בשימוש על ידי מספר קבוצות מחקר. למרות הטכניקות תוארו בספרות, הם עדיין לא הוצגו בפורמט וידאו. מטרתו של מאמר זה היא להמחיש טכניקה מעודכנת, תקפה ומהימנה למדידת קיבולת כוח להפקת המקסימום של סיבים בודדים מדגימות שריר שלד permeabilized כימית. כדי להשיג זאת, קטע סיבים בודד (ייקרא להלן ̶0; סיבים ") מופק מחבילה-permeabilized מראש של סיבים והניחו בתא ניסוי המכיל פתרון מרגיע, התכונה המגדירה של אשר היא ריכוז סידן שהם <10 ננומטר. הסיבים מחוברים אז בקצה אחד לכוח-רגשי ובקצה השני לאורך-בקר. עם הסיבים שנערכו באורך sarcomere אופטימלי, הוא מועבר לפתרון המפעיל שיש ריכוז סידן מספיק כדי לעורר הפעלה המרבית וכוח כיווץ איזומטרי כך מרבי. נתוני כוח נרכשים, מאוחסנים ונותחו באמצעות מחשב אישי.

Protocol

כל הנהלים הקשורים בנושאי בעלי חיים או בני אדם צריכים להתבצע בהתאם להנחיות רלוונטיות, תקנות, ורשויות רגולטוריות. אוניברסיטת מישיגן ועדת השימוש והטיפול של בעלי חיים (UCUCA) ואוניברסיטת מישיגן מרכז רפואית מוסדית המועצה לביקורת אישרו את כל בעלי החיים והנהלים האנושיים מתוארים במאמר זה.

1. הפוך הביתור וחפצי פתרון במלאי

הערה: ניתן לשנות את הכמויות הסופיות שנקבעו בהוראות הבאות או למטה בהתאם לצורך.

1. בכוס 1000 מיליליטר להוסיף 800 מיליליטר של מים ללא יונים (סוג ASTM 1). שמירת מערבבים בעדינות, להוסיף את כל החומרים המפורטים בטבלה 1 למים ללא יונים ולאפשר להם להתמוסס.

   מתחם	רצוי Conc. (ז)	משקל פורמולה (g / mol)	הוסף לL 1 (ז)
   K-propionate	0.250	112.17	28.040
   Imidazole	0.040	68.08	2.720
   EGTA	0.010	380.40	3.800
   MgCl 2 • 6 שעות 2 O	0.004	203.31	.813

רכיבי הביתור ופתרון מניות אחסון: טבלה 1.

2. מביא לנפח סופי של 1,000 מיליליטר עם מים ללא יונים. שים לב שאין צורך pH הפתרון בשלב זה. אחסן את פתרון המניות ב 4 מעלות צלזיוס.

2. הפוך את פתרון אחסון

1. כדי להפוך 200 מיליליטר של פתרון אחסון, להתחיל עם של לנתח ופתרון מניות אחסון בכוס 250 מיליליטר 100 מיליליטר. להוסיף Na מספיק ₂ H ₂ ATP להביא אדנוזין הסופיאדנוזין ריכוז (ATP) עד 2 מ"מ. מביא לנפח סופי של 200 מיליליטר עם גליצרול. התאם את ה- pH 7.00 עם אשלגן הידרוקסידי (KOH). אחסן את פתרון האחסון ב -20 ° C.
   הערה: בשל האופי צמיג של גליצרול זה יכול להיות קשה לוותר במדויק לפי נפח. בגלל זה, אנחנו בדרך כלל להוסיף גליצרול לפי משקל (של גליצרול 100 מיליליטר שוקל כ 126 ז).

3. הפוך הביתור פתרון

1. כדי להפוך 200 מיליליטר של ביתור פתרון, להתחיל עם של פתרון המניות לנתח ואחסון בכוס 250 מיליליטר 100 מיליליטר.
2. להוסיף ATP H ₂ Na ₂ המספיק כדי להביא ריכוז ATP סופי 2 מ"מ. התאם ל- pH 7.00 עם KOH. תביא את הנפח הסופי 200 מיליליטר עם מים ללא יונים. Aliquot בנפחים של 2.5 מ"ל ולאחסן ב -80 ° C.

4. הפוך הביתור פתרון עם Brij 58

הערה: Brij 58 הוא חומר ניקוי שאינו יוני שמשבש (permeabilizes) bilayers שומנים.

1. כדי להפוך 200 מיליליטר של ביתור פתרון עם Brij 58, להתחיל עם 200 מיליליטר של הפתרון לנתח בכוס 250 מיליליטר. שמירת מערבבים בעדינות, להוסיף 1 גרם של Brij 58 (0.5% w / v) לפתרון לנתח ולאפשר לו להתמוסס. Aliquot בנפחים של 2.5 מ"ל ולאחסן ב -80 ° C.

5. פתרונות בדיקה

הערה: הבא מותאם Moisescu וThieleczek 1978 (6). ראה דיון על הערות נוספות על הכנת פתרונות בדיקה.

1. הכן שלוש 1,000 מיליליטר כוסות נפרדות שכותרתו "מרגיע", "פרה-הפעלה" ו" הפעלה ". להוסיף 400 מיליליטר של מים ללא יונים לכל כוס.
2. הוסף את התרכובות שצוינו בטבלה 2 לכוס המתאימה ולאחר מכן לחמם את הפתרונות לבין 70 מעלות צלזיוס ו -80 מעלות צלזיוס. לשמור על טמפרטורת פתרון של 70-80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תוך ערבוב מתמיד.
   הערה: טמפרטורה של 70-80 מעלות צלזיוס באסיסט elimiאומה של חומצה פחמתית שהוקמה על ידי התגובה של סידן פחמתי עם EGTA בפתרון המפעיל. מטופלים פתרונות פתרון מראש הפעלה המרגיעה באותה הצורה כמו הפתרון המפעיל לשמור על עקביות.

		פתרון מרגיע		פתרון PRE-הפעלה		פתרון הפעלה
מתחם	משקל פורמולה (g / mol)	ריכוז רצוי (מ"מ)	חובה המונית (ז)	ריכוז רצוי (מ"מ)	חובה המונית (ז)	ריכוז רצוי (מ"מ)	חובה המונית (ז)
HEPES (חומצה)	238.30	90.0	10.724	90.0	10.724	90.00	10.724
MgO	40.31	10.3	.208	8.5	.171	8.12	0.164
EGTA (חומצה)	380.40	52.0	9.890			52.00	9.890
HDTA (חומצה)	348.36			50.0	8.709
קאקו 3	100.10					50.00	2.503

טבלה 2: Relaxing, לפני הפעלה ורכיבי פתרון הפעלה.

3. לקרר את הפתרון לטמפרטורת חדר ומוסיף מספיק NaN ₃ / KOH להביא NaN ₃ ריכוז הסופי עד 1 מ"מ.
   זהירות: NaN ₃ (אזיד הנתרן) היא רעילה. עיין בגיליון הבטיחות הכימי לפני הטיפול כימי זה.
   1. כדי להפוך של פתרון אזיד הנתרן 100 מ"מ 100 מיליליטר, להוסיף 0.65 גר 'של נאן ₃ עד 10 מיליליטר של 1 N KOH. התאם לנפח סופי של עם מים ללא יונים 100 מיליליטר.
4. התאם את ה- pH של כ 7.10 באמצעות KOH.
5. הצעד הבא 5.4 להוסיף ATP Na ₂ מספיק H ₂ להביא את הריכוז הסופי ATP עד 8 ​​מ"מ וNa ₂ CRP מספיק כדי להביא את phosophate קריאטין הסופי ריכוז (CRP) עד 10 מ"מ.
6. להביא כל פתרון לנפח הסופי של 500 מיליליטר באמצעות מים ללא יונים. צ'יל או לחמם את הפתרונות לטמפרטורה שבה ניסויים יבוצעו, ולאחר מכן להשתמש KOH להביאpH 7.10 ל, תוך שמירה על הטמפרטורה ש.
7. להוסיף מרגיע פתרון לכוס המכילה פתרון מראש המפעיל כך שהפתרון מראש הפעלת הגמר הוא חלק 1 מרגיע פתרון ב500 פתרון ההפעלה מראש. Aliquot בנפחים של 2.5 מ"ל ולאחסן ב -80 ° C.

6. הפוך לולאות תפר

1. תתחיל עם קווצת תפר ניילון monofilament לא סטרילי USP 10-0.
2. השתמש במלקחיים כדי ליצור לולאה עם הגדיל באמצעות טכניקת קשר הבוהן הכפולה. להפחית את הקשר בגודל של כ -750 מיקרומטר קוטר. קוטר לולאה ניתן להעריך תחת מיקרוסקופ באמצעות סימוני רשת הגאוגרפית עינית.
3. השתמש microdissecting מספריים כדי להסיר תפר עודף ומשאיר רק את הלולאה וקטנה (500 מיקרומטר) זנבות משני הצדדים. דוגמא ללולאה מוגמרת מוצגת באיור 1.
4. חזור על שלבים 6.2-6.3 עד 4 לולאות שמישים נעשו. חנות הלולאות בPetr מצופה אלסטומר סיליקוןאני לחלק לשימוש עתידי.
   הערה: ארבע לולאות תפר נדרשות לכל סיב נבדק.

7. דוגמא Bundle

הערה: השלבים הבאים מתארים את ההליך לנתח המדגם המקורי ל'חבילות 'קטנות ניסיוניות שממנו הסיבים בודדים סופו של דבר חולצו ונבדקו. בכל עת המדגם יש להתייחס בזהירות. לצורך תיאור זה, יינתנו הוראות כאילו החוקר נכון בידיים.

1. להשיג המדגם של עניין ולהעביר אותו למתקן שבו הנתיחה תתקיים.
   הערה: שיטות של ביופסית רקמה משתנות בהתאם לדגם ניסיוני ועיצוב מחקר. במידת האפשר, זלוף שרירים צריך להישמר עד לזמן של הביופסיה.
2. אם המדגם הוא שיועבר בין אתר הקציר והאתר לנתח, להעביר אותו בבקבוקון המכיל פתרון לנתח מצונן בזמן שמר על קרח.
3. הכן צלחת פטרי מצופה-אלסטומר סיליקון 5 סנטימטר עם פתרון לנתח מצונן ו02:58 סיכות חרקים הרכבה (100 מיקרומטר קוטר, פלדת אל-חלד).
4. להעביר את המדגם לצלחת. ודא שהמדגם נותר שקוע על ידי הוספה עוד פתרון לנתח במידת צורך.
5. בדוק המדגם מתחת למיקרוסקופ ולתפעל אותו כדי ליישר את צירי האורך של הסיבים לכיוון כתף ימין של החוקר (איור 2). אז לעגן את המדגם לצלחת על ידי מצמיד בפינות.
   הערה: עשה שימוש בכל רקמת חיבור שנותרה כעיגון נקודות בשלב זה מאחר שזו תהיה למקסם את שימוש מדגם ולחסוך בשלמות סיבים. החבילה יכולה להיות מוצמדת במתח קל כדי לסייע בהגדרת שוליים בין סיבים.
6. עם המלקחיים ביד השמאל ומספרי microdissecting בימין, להתחיל בעדינות לנתח צרור בשולי האורך בין סיבים
   הערה: בהתאם להאורכו הכולל, נוסף לנתח את החבילה לחבילות קטנות יותר רבות.
7. ודא שמידות החבילה למדוד כ 0.5-1 מ"מ ברוחב ו≥3 מ"מ האורך. להעריך את הממדים באמצעות מיקרוסקופ עם סימוני רשת הגאוגרפית בעינית, או על ידי הצבת שליט מתחת לצלחת.
8. להסיר ולסלק כל רקמה שניזוק על ידי המלקחיים או סיכות כתוצאה מהתהליך לנתח.
9. חזור על התהליך עד מספר מספיק של חבילות כבר גזור או עד המדגם מוצה.
   הערה: מספר החבילות שניתן להשיג יהיו תלויים בגורמים רבים ובהם הגודל והמצב של המדגם הראשוני, המורפולוגיה של השריר, ואת המיומנות של החוקר.

8. סיבי Permeabilize

1. העבר את החבילות מהפתרון לנתח לתוך בקבוקון המכיל 2.5 מיליליטר של תמיסה טריות, צוננת, לנתח עם חומר הניקוי שאינו יוני 'Brij 58' הוסיף(0.5%, w / v). דגירה על קרח למשך 30 דקות עם תסיסה מדי פעם, עדינה. ודא שהחבילות נשארות שקועות בכל דגירה.
2. בסוף הדגירה 30 דקות, להעביר את החבילות לבקבוקון המכיל פתרון לנתח טרי (לא Brij 58) ולהתסיס בעדינות ובקצרה כדי להסיר כל חומר ניקוי שנותר.

9. מכינים חבילות לאחסון

1. העבר את החבילות לבקבוקון המכיל פתרון אחסון מקורר ודגירת הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס.

10. חבילות חנות

1. למחרת, להכין קופסא אחסון, מסוגלת לעמוד בפני -80 ° C, עם מספיק 0.5 מיליליטר פרט בורג צינורות חרוטי כובע כדי להכיל את כל החבילות המתקבלות בתהליך לנתח (חבילה אחת לכל צינור). כל צינור חרוטי צריך להיות מלא עם 200-400 μl של פתרון אחסון טרי.
2. העבר את החבילות לצינורות חרוטי שכותרתו בנפרד. ודא שהחבילה לא נדבקה להצד השני של צינור חרוטי או צף על פני השטח של הפתרון. מכסה את צינורות חרוטי ולאחסן הדגימות ב -80 ° C עד היום של בדיקות.

11. הכן מכשירים ניסויי

הערה: המנגנון המותאם אישית מורכב משלב שבו שוכן מתמר בקר אורך וכוח, מערכת תא נעה ומיקרוסקופ לנתיחה 10X. מתקני כונן מיקרומטר לאפשר מניפולציה מדויקת של משטחים מצורפים סיבים. דפוסי עקיפת לייזר משמשים לאמידת אורך sarcomere. הנתונים שנוצרו במהלך הניסויים נרשם במחשב אישי. עיין באיור 3 עבור תמונות של הניסוי הגדרה מבוארת.

1. להפשיר בקבוקון אחד כל אחד מ, מראש המפעיל המרגיעה ופתרונות הפעלה ולשמור על קרח. שים לב שה- ATP ו- CRP הם תרכובות יציבה שיש לשמור על בטמפרטורות קרות.
2. הכן את מיקרוסקופ, מנגנון בדיקה והמחשב הקשורים לשימוש.
3. מלא את תא הניסוי הראשון עם מרגיע פתרון. במנגנון שלנו, התא הראשון מכיל מנסרות המאפשרות לחוקר לצלם את הסיבים מהצד. מלא את תא הניסוי השני עם פתרון מראש המפעיל והשלישי עם הפעלת פתרון.
4. כוון את הטמפרטורה, כך שתצוגת המדחום ב- קאמרי קוראת 15 מעלות צלזיוס. נושא שתי לולאות תפר מוכנות על גבי המשטחים מצורפים נירוסטה המשתרעים משני הכוח-רגשי ואורך-בקר (איור 5 א).

12. תמצית permeabilized יחידה סיבים

1. להפשיר צרור סיבים של עניין, ולהעביר לצלחת פטרי מצופה-אלסטומר סיליקון עם פתרון טרי, צונן מרגיע. אבטח את החבילה עם סיכות בשני הקצוות ולוודא שהוא שקוע.
2. שימוש במלקחיים, לתפוס סיבים בקצה אחד ולהתחיל בצורה חלקה לחילוצו לאורך ציר האורך שלו.
   הערה: נזק לחיצה לסוף הסיבים הנגרמים על ידי המלקחיים הוא לא דאגה בשלב זה מאז תכונות ההתכווצות בתחום זה לא נבדקו. צריכה, עם זאת, יש לנקוט זהירות בעת חילוץ סיבים מהחבילה מאז הידבקויות בין סיבים ומטריקס עלולות לגרום למתח מוגזם, סופו של דבר מוביל לנזק למתוח-induced. שים לב ששונות ניכרות קיימים בין שרירים במידה שבה הסיבים לדבוק במטריקס שמסביב. סיבים שחשודים לניזוק על ידי מתיחה כזה צריכים להיות מושלך.
3. השתמש בסכין גילוח או אזמל כדי לשנות קצה pipet כפי שמוצג ב( איור 4). להציג את הסיבים לקצה, יחד עם כמות קטנה של מרגיע פתרון. העבר את הסיב הבודד מצלחת פטרי המצופה-אלסטומר סיליקון לתא הניסוי שמכיל את הפתרון מרגיע.

13. הר יחיד סיבים

הערה: depicti צעד-אחר-צעדניתן לצפות באיור 5.

1. מנחה בעדינות עם המלקחיים, להסיר את הסיבים מקצה pipet ולעגן אותו לאורכו בקר (משמאל) באמצעות תפר הלולאה הראשונה.
   1. השתמש תנועה אחת, חלקה כאשר הידוק הלולאה עם המלקחיים. ודא שמתח שווה והפוכים מוחל על כל צד של התפר.
   2. הלולאה הראשונה צריכה להיות קשורה סביב 1 מ"מ עד 2 מ"מ מהקצה של המשטח המצורף אורך-בקר.
2. מניפולציות הקצה השני של הסיבים לכיוון הכוח-המתמר (מימין) ולהבטיח את הסיבים באותו האופן. הסר תפר עודף באמצעות המספריים microdissecting (איור 5 ג).
3. מניחים את הסיבים תחת כמות קטנה של מתח על ידי הגדלת המרחק בין זרועות אורך-בקר וכוח-מתמר באמצעות (איור 3 א) x-לתאם כונן מיקרומטר.
4. השחל את הלולאה השנייה על הראשון ולעגן את הסיביםבנקודה בתוך 0.2 מ"מ של סוף המשטח המצורף כוח-מתמר (איור 5D).
   1. הסר תפר עודף באמצעות המספריים microdissecting.
5. תהליך התקשרות הסיבים יכול לגרום לאובדן של פתרון מהתא. במידת צורך, להוסיף פתרון מרגיע יותר על מנת להבטיח את פני השטח של הפתרון הוא שטוח (לא קעור ולא קמור). משטח שטוח הוא חשוב בעת הערכת אורך sarcomere באמצעות דיפרקציה לייזר.
6. יישר מקביל הסיבים הצדדיים של תא הניסוי על ידי התאמת העמדה של האורך-בקר בכיוון של ציר y.
7. סקר הסיבים באמצעות צד נוף פריזמה ולהתאים את המיקום של האורך-בקר בכיוון של ציר z עד הסיבים הוא מקבילים לרצפה של החדר.
   הערה: מיקום של מקביל סיבים על הרצפה של החדר יכול להיות מושלם בלי מנסרות תא על ידי ההתמקדות ראשונה בקצה אחד של הסיבים ולאתרנגולת, ללא התאמת מוקד מיקרוסקופ, מביא את הקצה השני של הסיבים אל מוקד באמצעות כונן מיקרומטר Z- הציר שלה.
8. אם הסיבים הוא בכל דרך מעוותת, מעוותת או ניזוק כתוצאה מתהליך ההרכבה, הסיבים צריכים להיות מושלכים וסיבים חדשים מצורפים.

אורך 14. הסט האופטימלי sarcomere

1. כאשר הסיבים כבר מיושרים כהלכה בתוך החדר, להכניס את מסך היעד המכויל על ההיבט הקדמי של מיקרוסקופ וליישר אותו על תא הניסוי הראשון.
   הערה: מסך היעד מכויל באמצעות המשוואה צורמת סטנדרטית, λ = sinθ SL, שבי SL הוא אורך sarcomere, θ היא הזווית העקיפה בין 0 ° ו° 1 הקורות וλ מתפזרות הוא אורך הגל של הלייזר.
2. הפעל את הלייזר ולהתאים את המיקום של השלב כזה שהליזר עובר דרך המרכז של הסיבים.
   זהירות: אור הלייזר מרוכז יכול להיות נזק לאo ראייה. לעולם אל תנסה לדמיין את הסיבים באמצעות מיקרוסקופ כאשר הלייזר הוא על.
3. מקם את הסיבים ביחס לקרן הלייזר לdiffract אור הלייזר ולבחון להג הפרעות על המסך המכויל היעד (איור 6). לכבות את האורות כדי להמחיש את הדפוס הזה בצורה ברורה יותר.
   הערה: אם, עם המיצוב הנכון של קרן הלייזר, אין תבנית התאבכות נראית, זה מצביע על כך שרכיבי myofibrillar של הסיבים הם לא נורמלים / פגום ושהסיבים צריכים להיות מוחלפים עם אחד טרי.
4. כדי להגדיר את אורך sarcomere, להגדיל או להקטין את המתח בסיבים באמצעות כונן מיקרומטר ציר x אורך-בקר עד המרווח הרצוי של האור מתפזר הוא ציין שעל מסך היעד.
   הערה: אורך sarcomere האופטימלי של הסיבים יהיה תלוי במינים של בעלי חיים שממנו הדגימה הושגה. אורך sarcomere של 2.7 מיקרומטר הנחה הוא בדרך כלל להיות אופטימלי כאשר ישבניםלשיר סיבים ^מ7,8 רקמה אנושית.
5. לאחר אורך sarcomere אופטימלי נקבע, למדוד את המרחק בין שני התפרים הפנימיים. המטרה זו מושגת בקלות באמצעות הצג הדיגיטלי בכונן מיקרומטר ששולט בתנועת ציר x של החדר. מקם את התא כך שהשיער הצלב האנכי של העינית מיושרת על הגבול הפנימי של התפר הפנימי ואפס הצג הדיגיטלי בכונן מיקרומטר.
6. תרגום השלב לאורך ציר x ביחס למיקרוסקופ עד שמגיע לתפר הפנימי האחר. התצוגה הדיגיטלית תציין את האורך של הסיבים. ערך זה צריך להיות מוקלט כאורך סיבים, _ו L.
   הערה: יש להבין שהמרחק בין שני התפרים הפנימיים יקבע את האורך הפונקציונלי של רקמת ההתכווצות נבדק. החוקר צריך לשאוף לעקביות בממד הזה _(ו L כלומר) בסדרה של ניסויים.

חתך 15. אומדן שטח (CSA)

1. לשמור על הסיבים _בF L ולהשתמש במצלמה רכוב מיקרוסקופ כדי ללכוד תמונה בהגדלה גבוהה של החלק מהסיבים המרכזי משני העליון ונופי צד. תמונות מבט מצד ניתן נתפסו באמצעות הפריזמה המוטבעת בצד השני של החדר.
   הערה: כאשר עוברים בין עליון ונופי צד חשוב להזיז את המיקרוסקופ רק בy-הכיוון כדי להבטיח ששתי תמונות הן "במרשם", ולכן להראות שתי תצוגות שונות של אותו הסעיף של הסיבים.
2. להשיג מדידות בשלב זה לנרמל כוח מוחלט בהמשך המחקר. הטכניקות להשגת מדידות אלה מתוארות בהמשך ומאויר באיורים 7 א ו7B.

16. לעורר איזומטרי התכווצות

הערה: הנתונים בזמן שנוצרו במהלך הניסוי הבאיםים ניתן לגבות ופירש ללא שימוש במחשב, תוכנה המאפשר לרכישה, תצוגה, האחסון וניתוח תשובות הכוח הוא יתרון. תוכנת LabVIEW המותאם אישית שנוצרה על ידי המעבדה שלנו מאפשרת פונקציות אלה, כמו גם את היכולת לעצב "רכבות תנועה" המסדירות את הפעולה של האורך-בקר במהלך ניסוי.

1. ודא שהטמפרטורה של טרום-המפעיל המרגיעה, ופתרונות הפעלה יציבים על 15 מעלות צלזיוס.
2. השתמש בתוכנה קאמרית השליטה להעביר את הסיבים לתא המכיל את הפתרון מראש המפעיל ודגירה שם במשך 3 דקות.
   הערה: הפתרון מראש ההפעלה-הוא שנאגרו בחולשה לCa ^{2 +,} וכתוצאה מכך פיתוח והפעלת הכוח מהיר מאוד על כניסתה של הסיבים לפתרון המפעיל.
3. עם 10 שניות שנותרו בפתרון מראש ההפעלה ואורך הסיבים נשמרים _בו L, להקים אפס FOרמת RCE בשיא הניסיוני.
   הערה: התנועה "מצא את חיל אפס 'של האורך-בקר חושפת את רמת כוח-רגשי שמתאימה לאפס כוח (כלומר הסיבים הופכים רפויים כתוצאה מהתנועה לזמן קצר). כוח פסיבי הוא ההבדל בין שאפס ורמת הכוח רק לפני תנועת איפוס-רגשי.
4. בסופו של 3 דקות, להעביר את הסיבים לתא המכיל את פתרון ההפעלה ומאפשר כוח איזומטרי מרבי לפתח כפי שמעיד רמה בכוח שקדמה לעלייה מהירה.
5. לאחר שהגיע כוח איזומטרי מרבי, להשתמש באורך-בקר לזהות את תפוקת כוח-רגשי שמתאימה לאפס כוח בתא המכיל את הפתרון המפעיל.
   הערה: זה הכרחי, כי תפוקת כוח-רגשי שמתאימה לאפס כוח היא, באופן כללי, שונה לכל תא מלא פתרון.
6. בעקבות השגת כוח שני plateau, להחזיר את הסיבים לתא המכיל את הפתרון מרגיע. הבדיקה הושלמה. כדי לבדוק סיבים מרובים במהלך כל לשאוב פגישה אחת את כל הפתרונות ולהוסיף פתרונות חדשים, מקוררים.
   הערה: הפרוטוקולים של הרכיבה על אופניים ברנר יש לשקול בעת לעורר התכווצויות מקסימליים על פני תקופה ארוכה של זמן. פרוטוקול זה הוכח כדי לחסוך בתכונות מבניות ומכאניות בסיבים המופעלים מקסימאלי ^9.

תוצאות

סיבים בריאים, permeabilized כימית יחיד אמורים להופיע בצורה אחידה ויש מרווח striation עקבי כאשר צפו בהגדלה גבוהה. סיבים שהם לא גמישים כאשר מניפולציות עם המלקחיים או נזק מבני ברור צריכים להיות מושלכים.

תמונות דיגיטליות בהגדלה גבוהה צולמו במהלך שלב 15 מנותחות במשך 5 מדידות קוטר לזווג לאורך הבטן של הסיבים. CSA סיבים נאמד בהנחת חתך אליפטי וממוצע 5 מדידות CSA בודדות כמתוארים באיור 7 א. איור 7 משמש גם כדי להמחיש כיצד ממדי סיבים בתצוגה אחת יכולים להיות שונים באופן משמעותי בהשוואה לממדים לזווג בתצוגה אחרת (כלומר, צולבת חלקים לא, ב, עגול כללי).

עקבות כוח נציג מסיבים איטיים ומהירים אנושיים מוצגות ב8A דמויות ו8B, בהתאמה. Voltagפלט דואר של הכוח-מתמר נרכש במהלך בדיקה והמיר לכפות (MN) באמצעות רכישת נתונים ותוכנת ניתוח (LabVIEW). איור 9 ממחיש את הגישה המשמשת להערכת כוח פעיל מרבי _(o F), המחושבת על ידי הפחתה את הכוח הדרוש כדי לשמור על הסיבים באורך sarcomere אופטימלי ואילו במצב רגוע (כוח פסיבי, F _P), מהכח הגדול ביותר איזומטרי פיתח במהלך הפעלת סיבים מקסימלי (הכוח מוחלט, F _T). מאז התפוקה של הכוח-רגשי שמתאים לאפס כוח הוא, באופן כללי, שונה לכל אחד מתאי הרחצה השונים, אנו ירפו לרגע הסיבים בשני הקדם-ההפעלה והפעלת פתרונות כדי ללכוד את רמת אפס-הכוח ב שיא ניסיוני. נורמליזציה של כוח פעיל מרבי על ידי CSA סיבים משמשת להפקת הערך של כוח ספציפי _(o SF) יותר אינפורמטיבי. כי זה לוקח בחשבון את CSA של הסיבים, _o SF מספק מידה מסוימת של יכולת ייצור כוח הפנימית של מנגנון ההתכווצות של הסיבים, ובכך לאפשר השוואות תפקודיות בין סיבים בגדלים שונים. צריך, עם זאת, לציין כי מדידות CSA אינן מסוגלות להבחין השיעור של הסיבים שנכבשו על ידי חוטי התכווצות לעומת השיעור שנכבש על ידי מבני subcellular אחרים.

מאפיינים טיפוסיים של בריא, סיבים מבוגרים מקלאפלין et al. 2011 ¹⁰ לאדם, Mendias et al. 2011 ¹ לעכבר וGumucio et al. 2012 ² לחולדה הם מפורטים בטבלה 3. כל הנתונים המוצגים בלוח 3 היו שנוצרו באמצעות טכניקות מתוארות במאמר זה.

	אדם (Lateralis vastus)				עכבר (אדי)	עכברוש (Infraspinatus)
	זכר		נקבה		זכר	זכר
	סוג 1	2a סוג	סוג 1	2a סוג	(לא הוקלד)	(לא הוקלד)
CSA (מיקרומטר 2)	4880 - 6900	5270 - 8380	3870 - 5470	4010 - 5610	1850 - 3080	5290 - 8010
o F (MN)	0.79-1.17	1.02-1.54	0.64-0.97	0.71-1.07	0.14-0.25	0.55-0.97
o SF (kPa)	142-182	165-210	156-193	172-214	67-94	102-131
n	129	160	149	207	37	94

3. מאפיינים טיפוסיים השולחן של סיבים מvastus אדם בריאים, מבוגר lateralis ^10, infraspinatus longus פושטי עכבר digitorum ¹ והעכברוש ² שרירים. אורכי sarcomere אופטימליים נקבעו על 2.7 מיקרומטר לסיבים אנושיים ^7,8 ו -2.5 מיקרומטר לשני העכבר (36, 37) וסיבי חולדה (38). טווחים _ו L ניסיוני (25 ^וה 75 רבעונים ^ה) היו 1.39-1.73 מ"מ, 1.17-1.53 ​​מ"מ ו1.32-1.59 מ"מ לאדם, עכבר וחולדה בהתאמה. הטווחים המוצגים מצביעים רבעונים ^-25 ו -75 ^וה n הוא מספר הסיבים נבדקו.

הבעיות הנפוצות ביותר שחוו במהלך הבדיקה כוללות תלוש תפר לולאה, וכתוצאה מכך respons כוחדואר עם "לתפוס" כמו שמודגם באיור 10 א, ודמעת עובי חלקית או מלאה של הסיבים, מה שגורם בתגובת כוח שחוזרת בפתאומיות לכיוון או ל( הפסקה) אפס ואילו הסיבים עדיין שקוע בהפעלת פתרון (איור 10 ב). אם להחליק, דמעה או הפסקה מתרחשת במהלך ניסוי, הסיבים צריכים להיות מושלכים ונתונים לא נכללו, למרות שמירה על תיעוד של כשלי סיבים יכולות להיות גם ¹¹ אינפורמטיבי. עוד תוצאה שלילית שעשויים להיות נתקלה היא ההפעלה המוקדמת של הסיבים ואילו בפתרון (10C איור) הפעלה מראש. הפעלה חלקית בפתרון מראש המפעיל מרמזת זיהום משמעותי צלב היטב (כלומר, גידול מכוון בריכוז סידן בטרום הפעלה גם). במקרה זה, יש להישאף כל האמבטיות ושטפה היטב במים ללא יונים. ייבוש משטחי החלוקה בין התאים הוא גם recommenטוליפ אין כמו לחות או עיבוי באזורים אלה עלולים להוביל לפתילה של פתרון בין אמבטיות. ההחלטה לכלול או לא לכלול נתונים סופו של דבר יהיו תלויים במוקד הניסיוני ולכן יש לשקול בעת תכנון המחקר.

איור 1: תפר לולאה (תפר ניילון 10-0 monofilament).

איור 2:. נתיחת Bundle מלקחיים נמצאים ביד שמאל, מספריים microdissection נמצאים ביד ימין. קו אדום מציין את הכיוון החיובי של שורש כף היד ומספריים עם צירי האורך של הסיבים.

איור 3: () מנגנון בדיקה עם רכיבים שכותרת. (א) תאי ניסיוני עם תחתית שקופה. (ב) אורך-בקר. חיל-מתמר (ג). מקור אור (ד). כונן מיקרומטר XYZ אורך-בקר עם תצוגה דיגיטלית (ה). (ו) כונן מיקרומטר הבמה עם תצוגה דיגיטלית. כונן מיקרומטר XYZ חיל-מתמר (ז). פלטפורמה (ח) למסך יעד לייזר עקיפה מכויל. שולחן בידוד רעידות (i). מבט מקרוב תאי הניסוי (B). משטח מצורף פלדה (י) נירוסטה המשתרע לאורך-בקר. משטח מצורף פלדה (k) נירוסטה המשתרע מהכח-רגשי. פריזמה צד להציג (L). שיכון (מ ') עבור מודולים קירור חימום. (N) צמד תרמי לte תא דיווחmperature.

איור 4: 100 השתנה קצה pipet μl משמש להעברת סיבים מצלחת לנתיחה לתא ניסוי.

איור 5:. התקנה יחיד סיבים על מנגנון ניסיוני () לולאות תפר מוכנות מושחלות על משטחים מצורפים נירוסטה. (ב) סיבים הועברו לתא ניסוי. סיבים (ג) מעוגנים למשטחים מצורפים נירוסטה על ידי הזוג הראשון של לולאות תפר עם תפר עודף הוסר. זוג שני של לולאות תפר הליכי מעל לולאות תפר הראשונות וקשורות במקום (ד ').

איור 6: אורך sarcomere נבחנים על ידי ההקרנה של תבנית התאבכות לייזר על גבי מסך יעד מכויל (א) מקור לייזר.. (ב) מראה. מסך יעד (ג). תבנית התאבכות לייזר (ד).

איור 7: קביעה (א) לאזור סיבי חתך באורך sarcomere האופטימלי (אדם = 2.7 מיקרומטר). בהנחת חתך אליפטי, CSA מחושב לכל אחד מחמישה מקומות לאורך בטן הסיבים והממוצע של חמש המדידות בודדות הוא כפי שדווח CSA סיבים. 2a מייצג קוטר מבט מלמעלה, והוא ציר אחד של האליפסה, 2b מייצג קוטר מבט מצד, והוא הציר האחר של האליפסה. (ב) תמונות סיבי נציג הממחישות כל אחד מחמש מדידות הקוטר המקבילה נלקחו בשני מבט מלמעלה וצד.

איור 8: עקבות כוח נציג מvastus אדם הבריא lateralis סיבי שריר () סוג הסיב 1 (CSA: 5710 מיקרומטר ^2, _o F: 0.89 Mn _וo SF: 156 kPa).. (ב) סוג סיבי 2a (CSA: 9510 מיקרומטר ^2, _o F: 1.66 Mn _וo SF: 174 kPa). סוג שרשרת כבדה שרירן סיבים נקבע באמצעות השימוש בטכניקות הפרדת electrophoretic וכסף מכתים ^22.

oad / 52,695 / 52695fig9.jpg "/>
איור 9: חישוב של כוח המרבי פעיל _(o F) (א) תצוגה מורחבת של כוח סיבי תגובה במהלך תנועה וישכנע רפויה של אורך-בקר יזם בפתרון ההפעלה מראש.. F _P הוא את הכוח הדרוש כדי לשמור על אורך sarcomere של 2.7 מיקרומטר עם הסיבים במנוחה. תצוגה מורחבת של תנועה וישכנע רפוי אורך-בקר (ב). שים לב _שo F = F _T - F _P.

איור 10: להחליק () תפר לולאה, שמעיד "לתפוס" בכוח העקבות בעלייה בכוח. לבדוק כדי להיות בטוחים והמאובטח לולאות לפני הפעלת הסיבים. הפסקה (ב) סיבים במהלך הפעלה. יכול להיות בגלל יושרת סיבים עניה או טיפול אגרסיווי בסיבי מקום לולאת תפרment. הפעלת סיבים חלקית מוקדמת (ג) עקב זיהום של תא קדם-הפעלה עם Ca ^{2 +.}

Discussion

הערכות של תכונות התכווצות של סיבי שריר שלד יחידים permeabilized משמשות לחקור את תפקוד שרירים במגוון רחב של הקשרים. דוגמאות כוללות מחקרים שהעריכו את ההשפעות של הזדקנות ^12, לממש ^10,13,14, טיסה לחלל ^15, פציעה ^2,3,16, טיפולים תרופתיים ^{17,18, 19} ומחל מניפולציה גנטית ^20,21 במבנה סיבים ותפקוד. בשל היכולת להעריך ישירות את ביצועי ההתכווצות של myofibrils בתצורה המקורית שלהם, טכניקה זו מספקת פלטפורמה אטרקטיבית שממנו ניתן ליצור הבנה נעדרה פונקצית myofibrillar של השפעות שעלולים להיות מבלבלות שנמצאות כאשר אות שידור עצבית-שרירית ושחרור סידן מושרה עירור כלולים במערכת הנחקרת. יתר על כן, בדיקות פונקציונליות של סיבים יחידים יכולות לשמש כדי להשלים את תוצאות זיהוי חלבון התכווצות כגון אלהשהושג באמצעות אימונוהיסטוכימיה או ג'ל אלקטרופורזה + מערבי כתם ^22.

אחד מתפקידיו העיקריים של שרירי שלד הוא ליצור כוח. כתוצאה מכך _o SF, מדד ליכולת כוח יצירת הפנימית של מערכת התכווצות, הוא עניין רב לפיזיולוגים שריר. אומדנים מהימנים של _o SF דורשים אמצעים מדויקים של שני CSA הסיבים _וo F. מאז סיבים הם, באופן כללי, לא עגול בחתך, ולא אחיד בCSA לאורך שלהם, יש לנקוט זהירות רבה באמידת CSA. לשם כך, מדידות נעשות בכמה מקומות לאורך הסיבים ו, ​​בכל מקום, משתי נקודות מבט מופרדים על ידי 90 מעלות. אמצעים אמין של _o F דורשים תשומת לב לכמה פרטים כוללים היווה כוח פסיבי, התאמת אורך sarcomere למקסם חפיפה של חוטים עבים ודקים, המעסיק פתרון המפעיל עם T ריכוז סידןתוצאות כובע בהפעלה מקסימלי, שמירה על טמפרטורת הניסוי הרצויה, ושמירה על תנאים אופטימליים לאחסון (טמפרטורה ומשך זמן) של הסיבים לפני היום של הניסוי.

בעוד השלבים המתוארים כאן מתארים את ההליך להערכת כוח איזומטרי מרבי, הוא לעתים קרובות רצוי להעריך איכויות פונקציונליות חשובות אחרות של סיבי שריר שלד. זו יכולה להיות מושגת על ידי הרחבת פרוטוקול הניסוי לכולל מניפולציות מכאניות נוספות של הסיבים. לדוגמא, מדידה של המהירות שבה הסיבים מקצר נגד שורה של עומסים שונים מאפשרת קביעת יחסי כוח-מהירות, שממנו ניתן לחשב יחסי כוח-כוח ומהירות-כוח ^10,23,24. בנוסף, המהירות של קיצור טעון יכולה להיקבע על ידי המעסיק את "המבחן הרפוי" ^25, אשר מורכבים של יישום שורה של צעדי קיצור ישכנע רפויים וmeasuring הזמן הנדרש על ידי הסיבים כדי להסיר את החסר. עוד פרמטר הקינטית שלעתים קרובות הוא דיווח k _TR, שיעור קבוע לכוח שיפוץ הבא ההפרעות מכאניות שאופן זמני מתנתקת כל crossbridges ^26. לבסוף, את הקשר בין ריכוז סידן ודור כוח פעיל ("יחסי הכוח-PCA") הוא לעתים קרובות עניין ¹⁸ ויכול להיקבע על ידי חשיפת הסיבים לסדרה של פתרונות עם ריכוזי סידן נעים בין מתחת לסף להפעלת ההתכווצות מערכת מספקת אלה כדי לעורר הפעלה מקסימלי ולכן כוח מרבי _(o F).

למרות שהחלק גדול מהציוד שהוזכר יש צורך להערכת התכווצות סיב בודד, ציוד אחר הוא לא הכרחי. האורך-בקר, לדוגמא, הוא חיוני לכל פרוטוקול ניסוי שדורש הארכה או קיצור מהירים או מדויקת של הסיבים,אבל לא הכרחי להערכת כוח איזומטרי מרבי (אם כי ברמת אפס-כוח בשיא הכוח עדיין חייבת להיות מזוהה על ידי כמה אמצעים). המנסרות המאפשרות תצפית של הסיבים מהצד, בזמן ששימושי להערכת שטח חתך, אינן הכרחיים כאשר מיצוב הסיבים בתוך תא הניסוי. יתר על כן, אמצעים חלופיים לחשיפת הסיבים לפתרונות הניסיוניים השונים יכול להיות מועסקים, כולל תכנון מערכת-הפעלה ידנית של תאים או תא בודד שמאפשר למילוי מהיר וריקון של פתרונות. לבסוף, בעוד טמפרטורות ניסיוניות תת-פיסיולוגיות כמו 15 מעלות צלזיוס משמשות בדרך כלל כדי לשפר את שחזור של מדידות מכאניות ^{1,2,3,5,8,12,17,27,} ניתן להפיק נתונים תקפים בטמפרטורות אחרות ^{23 , 28,} כל עוד את ההשפעות של טמפרטורה על תכונות פתרון (ריכוז סידן, pH, וכו ') נלקחים בחשבון.

היצירות של פתרונות הבדיקה הן בין ההיבטים הקריטיים ביותר של טכניקות סיבי permeabilized המתוארות כאן. שיקולים לגבי הרכב פתרון הם מורכבים ומעבר להיקף של מאמר זה. הפתרונות מתוארים בשלב 5 של סעיף הפרוטוקול נועדו עם דגש על הפעלה מהירה של סיבי permeabilized עם העברתה מקדם-הפעלה להפעלת פתרונות תוך שמירה על כוח קבוע יוני, הרכב קטיוני, וosmolarity ^6,29. גישות אחרות להרכב פתרון כבר מועסקות בהצלחה ראויה לציון על ידי קבוצות מחקר אחרות, ובדרך כלל עושות שימוש בקבועים מחייבים שפורסמו וכלים חישוביים ^27,30,31. הריכוזים של יוני סידן בפתרונות המפעיל השונים חשוב במיוחד במחקרים שכלל הפעלת submaximal כגון הערכות הכוח-PCA. בניסויים שבי סיבים מופעלים באופן מלא, כמו אלה שתארוד כאן, ריכוז סידן בפתרון המפעיל בדרך כלל עולה בהפרש נוח שנדרש כדי להשיג את הכוח מקסימאלי, מה שהופך את הידע המדויק שלה פחות קריטי. תוספת של קריאטין פוספט היא חשובה לחציצת תנודות ATP וADP intramyofibrillar שאחרת היה קשורות לפעילות התכווצות. קריאטין קינאז נדרש לזרז את העברת פוספט מקריאטין פוספט לADP. תחת תנאי ניסוי שמובילים לשיעורים גבוהים ATP מחזור, כוללים עבודה בטמפרטורות גבוהות או מדידת קיצור במהירות גבוהה בסיבים מהירים ^32, קריאטין קינאז יש להוסיף לפתרון להשלים קריאטין קינאז אנדוגני שנשאר קשור לסיבים. לתנאי ניסוי פחות תובעניים, מערכת התחדשות ATP היא פחות קריטית ^27.

מגבלות של טכניקת הסיב בודדת permeabilized כוללות את הבאים. נתונים שנוצרו על ידי בדיקות אלה מגדיריםתכונות התכווצות של יחידת myofibrillar הספציפית שצורפה למכשיר הניסיוני. כתוצאה מכך, זה לוכד רק חלק קטן של סיבי multinucleated כל שממנו הקטע הושג ש, בתורו, מייצג חלק קטן מהמספר הכולל של סיבים בתוך השריר. חוקרים צריכים לשקול בזהירות ובכך הדגימה הדרושה כדי לתמוך בכל מסקנות מהניסויים. בנוסף, בוחן את ההשפעה של התערבות אימון גופני על תפקוד סיבים מניח כי הסיבים העריכו גויסו אכן במהלך האימון. למרות שהפרוטוקול מנסה לחקות את הסביבה תאית הטבעית של הסיבים, תהליך permeabilization sarcolemma הוא לא ספציפי ובהכרח מאפשר מרכיבים תאיים מסיסים לנטרל באופן חופשי לפתרוני הרחצה. תוצאה נוספת של חדירות הקרום היא שינוי במאזן האוסמוטי שמעיד נפיחות בסיבים נפח ^33.נפיחות סיבים מגדילה את המרחק בין סיבי אקטין ומיוזין וכתוצאה מכך רגישות מופחתת של סידן במערכת myofilament ^34,35, אבל יכולות להיות הפוכה על ידי ההקדמה של תרכובות גדולות, אוסמוטי פעילה ^34. הגבלה סופית לשקול היא התוצאה של הטכניקה המשמשת לחיבור סיבים למנגנון הניסיוני. זה תמיד דורש לעוות את הקשר המרחבי בתוך מערכת נימה ובסמוך לנקודות המצורף, עם השתתפות גירעונות תפקודיים. באופן ספציפי, האזורים של הסיבים ובסמוכים לנקודות החיבור באופן פונקציונלי בסכנה ובכך לתרום גמישות סדרת artifactual למערכת המדידה.

לסיכום, יש לנו תארנו אמצעי שבעזרתו להעריך את יכולת כוח-יצירת של סיבי שריר שלד permeabilized כימית במבחנה. למרות ההתמקדות של מאמר זה הייתה על הערכת generatin כוח איזומטרי המרביקיבולת גרם של סיבי שריר שלד אדם, הגישה הניסויית יכולה להיות משונית והרחיבה כדי לקבוע מגוון רחב של פרמטרים ויחסים הקינטית במגוון מינים, יונקים או אחר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polystyrene culture test tube with cap	Fisher Scientific	14-956-3D
0.5 ml screw cap microcentrifuge	Fisher Scientific	02-681-334
0.5 ml microcentrifuge caps with o-ring	Fisher Scientific	02-681-358
Microcentrifuge cryobox	Fisher Scientific	5055-5005
pH meter	Mettler-Toledo	FE20
Petri dish	Fisher Scientific	08-757-11YZ
Nonsterile-suture 10-0 monofilament	Ashaway Line Twine	S30002
Insect pins	Fine Science Tools	26002-10
Forceps - Dumont #5	Fine Science Tools	11251-20
Microdissecting scissors	Fine Science Tools	15000-08
Stereo microscope	Leica Microsystems	MZ8
Micrometer drives	Parker Hannifin	3936M
Thermometer	Physitemp	BAT-12
Water bath circulator	Neslab Instruments	RTE-111
Temperature controller	Aplha Omega Instruments	Series 800
LabVIEW software	National Instruments	-
Computer	Varied	-
Chamber system	Aurora Scientific	802D
Length-controller	Aurora Scientific	312C
Force-transducer	Aurora Scientific	403A
Reagents
K-proprionate	TCI America	P0510
Imadizole	Sigma-Aldrich	I0125
MgCl2•6H20	Sigma-Aldrich	M2670
Brij 58	Sigma-Aldrich	P5884
EGTA (acid)	Sigma-Aldrich	E0396
Na2H2ATP•0.56H2O	Sigma-Aldrich	A7699
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279
HEPES (acid)	Sigma-Aldrich	H7523
MgO	Sigma-Aldrich	529699
HDTA (acid)	TCI America	D2019
CaCO3	Sigma-Aldrich	C4830
NaN3	Sigma-Aldrich	S8032
KOH (1 N)	Sigma-Aldrich	35113
HCL (1 N)	Sigma-Aldrich	318949
Na2CrP•4H2O	Sigma-Aldrich	P7936
pH 10 standard	Fisher Scientific	SB115
pH 7 standard	Fisher Scientific	SB107