Permeabilize İskelet Kası Fibers tarafından oluşturulan Maksimum İzometrik Kuvvet Ölçümü

Özet

Kimyasal tenli, ya da permeabilize, iskelet kas liflerinin kasılma özelliklerinin analizi tek kas hücre düzeyinde kas fonksiyonunu değerlendirmek için bir güçlü bir araç sunuyor. Bu yazıda hazırlamak için geçerli ve güvenilir bir teknik anahat ve test in vitro iskelet kas lifleri geçirgenleştirildi.

Özet

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Giriş

iskelet kası birincil işlevi kuvveti üretmektir. Kas kuvveti motor sinir aksiyon potansiyelleri, nöromüsküler iletimi, kas lifi aksiyon potansiyelleri, hücre içi kalsiyum salınımını, düzenleyici ve kontraktil proteinlerin sistemin aktivasyonunu içeren olaylar karmaşık bir dizisi boyunca in vivo ortaya almaktadır. Kuvvet oluşturma bu dizinin nihai sonucu olduğu için, kuvvet bir eksiklik, bireysel adımların bir veya daha fazla yetersizliği neden olabilir. Permeabilize elyaf hazırlığı bir kilit özelliği, miyofibriler cihazı kalan ile ilişkili tek düzenleyici ve kontraktil fonksiyonla birlikte in vivo gücü üretimi için gerekli olan adımların çoğu ortadan kaldırmasıdır. Araştırmacı kalsiyum ve enerji (ATP) aktive teslim üzerinde kontrol varsayar ve onların yerli co izole düzenleyici ve kasılma yapılarının değerlendirilmesini sağlar basitleştirilmiş bir sistem ile ödüllendirilirnfiguration. In vivo gözlenen kas fonksiyonunda değişiklik değerlendirirken geçirgenleştirildi iskelet kas lifleri kullanarak kuvvet ölçümü ve böylece değerlidir. Örneğin, biz miyostatin eksik farelerde ¹ liflerin kuvvet üretme kapasitesini karakterize etmek ve kronik rotator manşet yırtığı ^2,3 aşağıda sergilenen kalıcı kas zayıflığı nedenini değerlendirmek için bu tekniği kullandık.

Modern Permeabilize lif metodolojisi erken etkili çalışmalara ^4,5 kadar takip ve araştırma gruplarının sayısına göre şu anda kullanımda olabilir. Teknikler literatürde tarif edilmiş olmasına rağmen, henüz video formatında sunulmamıştır. Bu makalenin amacı kimyasal geçirgen iskelet kası örneklerinden tek liflerin maksimum kuvvet üretme kapasitesini ölçmek için güncellenmiş, geçerli ve güvenilir bir teknik göstermektir. Bu, bir olarak adlandırılan tek bir lif parçası (gerçekleştirmek için ̶0 lif "), liflerin bir ön-geçirgen bir paket elde edilir ve rahatlatıcı çözeltisi ihtiva eden bir deney odasına yerleştirilir, belirleyici özelliği ise, 10

Protokol

Hayvan veya insan denekleri Tüm işlemler ilgili kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar çerçevesinde yapılmalıdır. Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Michigan Komitesi Üniversitesi (UCUCA) ve Michigan Tıp Merkezi Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi, tüm hayvan ve bu makalede açıklanan insan prosedürleri onayladı.

1. Marka Diseksiyon ve Depolama Stok Çözüm

Not: Aşağıdaki talimatlarda belirtilen son hacimleri büyütülüyor ya da istediğiniz gibi aşağı olabilir.

1. 1000 ml'lik bir cam olarak iyonu giderilmiş su (ASTM Tip 1) içinde 800 ml ekle. Yumuşak bir karıştırın muhafaza deiyonize suya Tablo 1'de listelenen bütün bileşikler ekleme ve bunları çözmek için izin verir.

   Bileşik	Conc İstenen. (M)	Formül Ağırlık (g / mol)	1 L (g) ekleyin
   K-propionat	0.250	112,17	28,040
   Imidazol	0.040	68.08	2.720
   EGTA	0.010	380,40	3.800
   MgCl2 • 6H 2 O	0.004	203,31	0.813

Tablo 1: Kesme ve depolama stok solüsyonu bileşenleri.

2. Iyonu giderilmiş su ile 1000 ml 'lik bir son hacme getirmek. Bu zamanda, çözelti pH'ının, gereksiz olduğuna dikkat edin. 4 ° C 'de stok solüsyonu saklayın.

2. Marka Depolama Çözümü

1. Depolama çözeltisi 200 ml yapmak için, kesme ve 250 ml'lik bir beher içinde, depolama stok çözeltisi, 100 ml ile başlar. Nihai adenozini getirmek için yeterli Na ₂ H ₂ ATP ekle2 mM'ye trifosfat (ATP) konsantrasyonu. Gliserol ile 200 ml'lik bir nihai hacme getirmek. Potasyum hidroksit (KOH) ile pH 7.00 ayarlayın. -20 ° C 'de depolama çözümü saklayın.
   Not: gliserol yapışkan niteliği nedeniyle doğru bir hacim olarak dağıtmak için zor olabilir. Bu nedenle, genellikle ağırlık olarak gliserol ekleyin (gliserol, 100 mi, yaklaşık 126 g ağırlığında).

3. Marka Diseksiyon Çözüm

1. Çözelti kesme 200 ml yapmak için, 250 ml'lik bir beher içinde kesme ve depolama stok çözeltisi, 100 ml ile başlar.
2. 2 mM nihai ATP konsantrasyonu getirmek için yeterli Na _{2H 2} ATP ilave edin. KOH ile 7.00 pH ayarlayın. Iyonu giderilmiş su ile, 200 ml nihai hacme getirmek. -80 ° C'de 2.5 ml hacimleri ve deposunda kısım.

Brij 58 ile Çözüm Diseksiyon 4. olun

Not: Brij 58 (permeabilizes) lipit iki katmanlı bozan iyonik olmayan deterjandır.

1. Brij 58 ile çözelti kesme 200 ml yapmak için, 250 ml'lik bir beher kesme çözeltisi 200 ml ile başlar. Yumuşak bir karıştırın koruyan Brij 58, 1 g kesme çözeltisine (ağ / hac% 0.5) ekleyin ve çözünmesi için izin verir. -80 ° C'de 2.5 ml hacimleri ve deposunda kısım.

5. Test Çözümleri olun

Not: Aşağıdaki Moisescu ve Thieleczek 1978 uyarlanmıştır (6). Test çözümleri hazırlamak ek yorumlar için Tartışma bakın.

1. "Rahatlatıcı" etiketli üç ayrı 1.000 ml'lik beher, "Pre-aktive edici" ve "Devreye" hazırlayın. Her behere iyonu giderilmiş su, 400 ml ilave edilir.
2. Uygun bir deney şişesine, Tablo 2'de belirtilen bileşik ekleyin ve daha sonra ° C ila 70 ° ila 80 ° C'ye çözüm ısıtın. Sürekli bir şekilde karıştırılarak 30 dakika boyunca 70-80 ° C'lik bir çözelti, sıcaklığı muhafaza edin.
   Not: Elimi 70-80 ° C asist bir sıcaklıkkarbonik asit Ulus aktive çözeltisi içinde EGTA ile kalsiyum karbonatın reaksiyona sokulması suretiyle oluşturulur. rahatlatıcı çözeltisi ve ön-aktive edici çözümler tutarlılığı korumak için aktive edici çözeltisi ile aynı şekilde muamele edilir.

		RAHATLATICI ÇÖZÜM		ÖN AKTİVATÖR ÇÖZÜM		AKTİVE ÇÖZÜM
Bileşik	Formül Ağırlık (g / mol)	İstenilen konsantrasyon (mM)	Gerekli kütle (g)	İstenilen konsantrasyon (mM)	Gerekli kütle (g)	İstenilen konsantrasyon (mM)	Gerekli kütle (g)
HEPES (asit)	238,30	90.0	10,724	90.0	10,724	90.00	10,724
MgO	40.31	10.3	0.208	8.5	0.171	8.12	0.164
EGTA (asit)	380,40	52.0	9,890			52.00	9,890
HDTA (asit)	348,36			50.0	8,709
CaCO 3	100,10					50.00	2,503

Tablo 2: Relaxing, ön ve aktive çözeltisi bileşenleri.

3. Solüsyon oda sıcaklığına kadar soğutulur ve 1 mM nihai konsantrasyon _NaN3 getirmek için yeterli _NaN3 / KOH ekleyin.
   DİKKAT: NaN ₃ (sodyum azid) zehirlidir. Bu kimyasal işleme önce kimyasal MSDS bakın.
   1. 100 mM sodyum azid çözeltisi, 100 ml yapmak 1 N KOH 10 ml NaN ₃ 0.65 g ekleyin. Iyonu giderilmiş su ile 100 ml'lik bir nihai hacme kadar ayarlayın.
4. Yaklaşık 7.10 KOH kullanılarak pH ayarlayın.
5. Aşağıdaki adım 5.4 10 mM nihai kreatin phosophate (CRP) konsantrasyonunun getirmek için 8 mM nihai ATP konsantrasyonu ve yeterli Na ₂ CRP getirmek için yeterli Na ₂ H ₂ ATP ekleyin.
6. Iyonu giderilmiş su ile, 500 ml nihai hacme kadar her çözüm getirmek. Chill veya deneyler yapılacaktır sıcaklığa çözümler ısı, daha sonra getirmek için KOH kullanın7.10 pH bu sıcaklık muhafaza edilirken.
7. Öncesi son aktive çözümü 500 ön aktive çözeltide çözüm rahatlatıcı 1 parçasıdır öncesi aktive çözümü içeren beher çözüm rahatlatıcı ekle şekilde. -80 ° C'de 2.5 ml hacimleri ve deposunda kısım.

6. Dikiş Loops olun

1. Steril olmayan USP 10-0 monolif naylon dikişin bir sarmalı ile başlayın.
2. Çift yukarıdan aşağı düğüm tekniği kullanılarak telin bir döngü oluşturmak için forseps kullanabilir. Yaklaşık 750 mikron çapa boyutu düğüm azaltın. Döngü çapı mercek graticule işaretlerini kullanarak mikroskop altında değerlendirilebilir.
3. Iki tarafında sadece döngü ve küçük (500 mikron) kuyrukları bırakarak fazla dikiş kaldırmak için makas microdissecting kullanın. Bitmiş döngünün bir örnek, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
4. Tekrarlayın 6,2-6,3 4 kadar kullanılabilir döngüler yapılmıştır adımları. Mağaza bir silikon elastomer kaplama petr döngülerBen ileride kullanmak üzere çanak.
   Not: Dört ameliyat dikiş ipliği döngüler test edilen her elyaf için gereklidir.

7. Paket Örnek

Not: Aşağıdaki adımlar tek lifler sonunda çıkarılan ve test edilecektir hangi küçük deneysel 'demetleri' orijinal numunenin diseksiyon için prosedürü açıklar. Her zaman örnek dikkatle ele alınmalıdır. Bu açıklama amacıyla, kullanım talimatları araştırıcı sağ elini olduğu gibi verilir.

1. Ilgi numunesi almak ve diseksiyon gerçekleşecek tesisine transfer.
   Not: doku biyopsisi yöntemleri deneysel model ve çalışma tasarımı bağlı olarak değişecektir. Mümkün olduğunda, kas perfüzyon biyopsi zamana kadar muhafaza edilmelidir.
2. Örnek hasat alanı ve kesme bölgesi arasında aktarılacak ise, buz üzerinde muhafaza ederken soğutulmuş kesme çözeltisi ihtiva eden bir şişe içine taşımak.
3. Soğutulmuş kesme çözeltisi ve 2-3 böcek montaj pimleri (100 mikron çapında paslanmaz çelik) bir 5 cm silikon elastomer kaplama petri hazırlayın.
4. Çanak örnek aktarın. Numune gerekirse daha fazla diseksiyon çözeltisi ilave edilerek batık kalır emin olun.
5. Mikroskop altında örnek inceleyin ve araştırmacı (Şekil 2) sağ omuz yönünde liflerin boyuna eksenlerini hizalamak için manipüle. Sonra köşelerde iğneleyerek çanak örnek çapa.
   Not: Bu örnek kullanımını maksimize ve lif bütünlüğünü muhafaza edecek çünkü şu anda puan ankraj olarak kalan bağ dokusu yararlanın. demet arası fiber marjları tanımlanmasında yardımcı olmak için hafif bir gerginlik tutturulmuş olabilir.
6. Sol elinde forseps ve sağ microdissecting makasla hafifçe lifleri arasında uzunlamasına kenarları boyunca bir paket diseksiyon başlar
   Not: bağlı onuntoplam uzunluğu, daha çok sayıda küçük demetler halinde paket teşrih.
7. Bu paket boyutları genişliği yaklaşık 0.5-1 mm ve uzunluğu ≥3 mm ölçen emin olun. Veya çanak altında bir cetvel koyarak mercek içinde graticule işaretleri ile bir mikroskop kullanılarak boyutlarını değerlendirir.
8. Çıkarın ve diseksiyon sürecinin bir sonucu olarak forseps veya pimleri ile hasarlı dokuyu atın.
9. Demetleri yeterli sayıda disseke veya örnek tükenene kadar edilene kadar işlemi tekrarlayın.
   Not: boyutu ve ilk örnek durumda, kas morfolojisi ve araştırmacının tecrübeli de dahil olmak üzere pek çok faktöre bağlı olacaktır elde edilebilir demetleri sayısı.

8. Permeabilize Lifler

1. Iyonik olmayan deterjanın 'Brij 58' taze, soğutulmuş, kesme çözeltisi 2,5 ml su ihtiva eden bir şişe içine kesme çözeltisinden demetleri transfer eklendi(% 0.5, ağ / hac). Ara sıra nazik çalkalama ile 30 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edin. Demetleri inkübasyon boyunca batık kalır emin olun.
2. 30 dakika inkübasyon sonunda, taze kesme çözeltisi (Resim Brij 58) ihtiva eden bir şişeye demetleri aktarmak ve kalan deterjanı çıkarmak için yumuşak ve kısa bir süre için çalkalayın.

9. Depolama için Bundles hazırlayın

1. Soğutulmuş depolama çözeltisini ihtiva eden bir şişeye demetleri aktarın ve 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.

10. Mağaza Paketler

1. Ertesi gün, dayanma yeteneğine sahip bir depolama haznesi, hazırlanması -80 ° C, kadar tek tek 0.5 mi kesme işlemi (tüp başına tek bir paket) sırasında elde edilen tüm demetleri karşılamak için kap konik tüpler vidalı. Her konik tüp taze depolama çözümü 200-400 ul ile dolu olmalıdır.
2. Tek etiketli konik tüpler içine demetleri aktarın. Paket yapışmış olmadığından emin olunKonik boru veya çözeltinin yüzeyinde yüzen yan. Konik tüpler Cap ve test gününe kadar -80 ° C'de örnekleri saklamak.

11. Deney tesisatı hazırlayın

Not: Özel cihazı bir uzunlukta kumanda ve güç çeviricisi, hareket eden bir odacık sistemi ve 10X diseksiyon mikroskobu barındıran bir aşamada meydana gelir. Mikrometre sürücü tesisat lif eki yüzeylerin hassas manipülasyon için izin verir. Lazer difraksiyon paternleri sarkomer uzunluğunu belirlemek için kullanılır. Deney sırasında oluşturulan veriler bir kişisel bilgisayarda kaydedilir. Deneysel set-up açıklamalı görüntüler için Şekil 3'e bakınız.

1. Tek şişe rahatlatıcı, ön ve aktive çözümleri her çözülme ve buz üzerinde muhafaza. ATP ve CRP düşük sıcaklıklarda muhafaza edilmesi gerekir kararsız bileşikler olduğuna dikkat edin.
2. Kullanım için mikroskop, test cihazı ve ilgili bilgisayarı hazırlayın.
3. Çözüm rahatlatıcı ile ilk deneysel odasını doldurun. Bizim cihazında, birinci bölme araştırmacı tarafından elyaf fotoğraf izin prizmalar içerir. Ön aktive çözüm ve çözüm aktive üçüncü ikinci deneysel bölmesini doldurun.
4. In-odacık termometre ekran 15 ° C okur sıcaklığını ayarlar. Konu kuvvet dönüştürücü ve uzunluk-kontrolör (Şekil 5A) hem uzanan paslanmaz çelik eki yüzeylere iki hazırlanmış sütür döngüler.

12. Özü permeabilize Tek Fiber

1. Ilgi konusu bir elyaf demeti çözülme ve taze soğutulmuş rahatlatıcı çözeltisi ile bir silikon elastomer kaplama petri tabağına aktarın. Her iki ucunda iğne ile paket Güvenli ve batık emin olun.
2. Forseps kullanılarak, bir ucunda bir elyaf kavramak ve uzunlamasına ekseni boyunca düzgün bir şekilde ekstre başlar.
   Not: Bu Basınç hasarıforseps neden fiberin sonunda bu alanda kasılma özellikleri test olmayacak çünkü şu anda bir endişe değil. Elyaf ve hücre-dışı matris arasındaki yapışıklıklar, aşırı gerilim neden olabilir, sonuçta streç kaynaklı hasara yol, paket elyafların çıkarma dikkatli Bununla birlikte, dikkat edilmelidir. Önemli ölçüde değişkenlik elyafları çevreleyen hücre üstü matrisine yapışır hangi derecede kaslar arasında var olduğunu not edin. Böyle bir streç tarafından zarar görmüş şüphelenilen Fiberler atılmalıdır.
3. (Şekil 4) 'de gösterildiği gibi bir pipet ucu değiştirmek için bir traş makinesi bıçak ya da neşter kullanarak. Çözelti rahatlatıcı küçük bir miktarı ile birlikte ucu içine elyaf tanıtılması. Rahatlatıcı çözüm içeren deneysel odasına silikon elastomer kaplı petri tek lif aktarın.

13. Dağı Tek Fiber

Not: adım adım depictiŞekil 5 görülebilir.

1. Forseps ile yavaşça Rehberlik, pipet ucu lif kaldırmak ve ilk dikiş döngü kullanarak uzunluk-kontrolör (solda) için çapa.
   1. Forseps ile döngü sıkarken, tek bir düzgün hareket kullanın. Eşit ve ters bir germe ameliyat dikiş ipliğinin her iki ucuna uygulanan olduğundan emin olun.
   2. İlk döngü uzunluğu kontrol cihazı bağlantı yüzeyinin uçtan 2 mm yaklaşık 1 mm bağlanmalıdır.
2. (Sağ) kuvvet-transdüser doğru fiber diğer ucunu işleyin ve aynı prosedürü kullanarak lif sabitleyin. Microdissecting makas (Şekil 5C) kullanılarak fazla dikiş çıkarın.
3. X koordinatı mikrometre sürücü (Şekil 3A) kullanılarak uzunluk denetleyici ve kuvvet dönüştürücü kolları arasındaki mesafeyi artırarak gerginlik bir miktar altında lif yerleştirin.
4. İlk üzerinden ikinci döngü Konu ve lif çapakuvvet dönüştürücü eki yüzeyi (Şekil 5D) sonunda 0,2 mm içinde noktada.
   1. Microdissecting makas kullanarak fazla dikiş çıkarın.
5. Fiber bağlantı işlem odasından çözeltisi kaybına neden olabilir. Gerekirse, çözümün yüzey sağlamak için daha rahatlatıcı bir çözüm eklemek düz (ne içbükey dışbükey ne) 'dir. Lazer kırınımı kullanarak sarkomer uzunluğu değerlendirilirken düz bir yüzey önemlidir.
6. Y-ekseni istikametinde uzunluk-kontrol konumunu ayarlayarak deney odasının yan duvarları fiber paralel hizalayın.
7. Prizma yan görünümünü kullanarak elyaf yüzey araştırması ve elyaf odasının tabanına paralel oluncaya kadar z ekseni yönünde uzunluğu kontrolörünün konumunu ayarlamak.
   Not: bölmenin tabanında fiber paralel konumlandırılması elyaf ve t, bir ucunda birinci odaklanarak odası prizmalar olmadan gerçekleştirilebilirtavuk, mikroskop odak ayarlama onun z-ekseni mikrometre sürücü kullanarak odak noktası haline fiber diğer ucunu getirmeden.
8. Fiber, çarpık bükümlü veya montaj işleminin bir sonucu olarak zarar görmüş herhangi bir şekilde ise, lif atılır ve yeni bir elyaf eklenmelidir.

14. Set Optimal Sarkomer Uzunluk

1. Lif doğru odasının içinde hizalanmış edildiğinde, mikroskop ön yüzünde üzerine kalibre hedef ekranı takın ve ilk deneysel odasının üzerine hizalayın.
   Not: Hedef ekranı standart ızgara denklem kullanılarak kalibre edilir, λ = SL sinθ, SL sarkomer uzunluğu olduğu, θ 0 ° 1 ° kırınan kirişler ve λ arasındaki kırılma açısıdır lazer dalga boyudur.
2. Lazer açın ve lazer merkezinden geçer şekilde aşama konumunu ayarlamak.
   DİKKAT: Konsantre lazer ışığı t zarar olabilireyesight o. Lazer açıkken mikroskopla fiber görselleştirmek için çalışmayın.
3. (Şekil 6) lazer ışığı kırabilen ve kalibre edilmiş hedef ekranda bir girişim kalıbında gözlemlemek için lazer ışınına göre fiber yerleştirin. Daha açıkça bu desen görselleştirmek için ışıkları kapatın.
   Not: lazer ışınının doğru konumlandırılması ile, hiçbir girişim deseni görülür ise, bu fiberin miyofibriler bileşenleri zarar / anormal olduğunu göstermektedir ve lif taze biriyle değiştirilmesi gerektiğini.
4. Sarkomer uzunluğu, artış ayarlamak veya Kırınan ışık istenen boşluk hedef ekranda görülünceye kadar uzunluk-denetleyici x ekseni mikrometre sürücü kullanarak elyaf üzerindeki gerilimi azaltmak için.
   Not: fiberin uygun sarkomer uzunluktaki numune elde edildiği hayvanın türüne bağlı olacaktır. 2.7 um'lik bir sarkomer uzunluğu genel olarak zaman eşek uygun olduğu varsayılırinsan dokusu ^7,8 lifleri şarkı.
5. Optimal sarkomer uzunluğu ayarlandıktan sonra, iki içteki sütür arasındaki mesafeyi ölçün. Bu en kolay odasının x ekseni hareketini kontrol mikrometre sürücü üzerinde dijital okuma kullanılarak gerçekleştirilir. Mercek dikey, çapraz saç içteki dikiş iç sınırında hizalanmış şekilde odasına yerleştirin ve mikrometre sürücü üzerinde dijital okuma sıfır.
6. Diğer iç dikiş ulaşana kadar mikroskop x-eksen boyunca aşama Çevir. dijital ekran lif uzunluğunu gösterecektir. Bu değer, lif uzunluğu L _f olarak kaydedilmelidir.
   Not: Bu iki iç dikiş arasındaki mesafe kontraktil dokunun işlevsel uzunluğu değerlendirilmektedir belirleyecek anlaşılmalıdır. Araştırmacı bir içinde bu boyutta tutarlılık (yani L _f) için gayret etmelidirdeneyler serisi.

15. tahmin Çapraz kesit alanı (CSA)

1. L _f fiber korumak ve üst ve yan görünümleri hem lif orta kısmının yüksek büyütme görüntü yakalamak için mikroskop monte kamera kullanmak. Yandan görünüm görüntüleri odasının yan gömülü prizma kullanarak yakalanabilir.
   Not: Üst ve yan görünümleri arasında değişen zaman iki resim "kayıttaki" ve bu nedenle fiberin aynı bölümün iki farklı görünümleri göstermek sağlamak için sadece y yönünde mikroskop taşımak için önemlidir.
2. Çalışmada daha sonra mutlak güce normalleştirmek için şu anda ölçümleri alın. Bu ölçümlerin elde edilmesi için teknikleri, daha sonra tarif edilen ve Şekiller 7A ve 7B 'de gösterilmiştir.

16. çıkarmak İzometrik Kasılma

Not: Veriler bu deney sırasında ortaya çıkan ikens toplandı ve kuvvet yanıtlarının elde edilmesi, ekran, depolama ve analiz için avantajlıdır izin veren bir bilgisayar, yazılım kullanılmadan yorumlanabilir. Laboratuvarımızda tarafından oluşturulan özel LabVIEW yazılımı bu işlevleri yanı sıra yetenek bir deney sırasında uzunluk denetleyicisi eylem düzenleyen 'hareket trenleri' tasarlamayı sağlar.

1. Rahatlatıcı önceden aktive sıcaklığında emin olun ve aktive çözeltiler 15 ° C 'de stabildir.
2. Ön aktive çözeltisini ihtiva eden bölmeye elyaf hareket ve 3 dakika boyunca orada inkübasyona bölmesi kontrol yazılımı.
   Not: Ön aktive eriyiği, zayıf halde aktive çözeltisine lifin verilme üzerine çok hızlı aktivasyonu ve kuvvet gelişimi ile sonuçlanır, Ca2 ⁺ için tamponlanır.
3. 10 saniye önceden aktive çözeltisi ve L _f muhafaza lif uzunluğu kalan ile, bir sıfır fo oluşturulmasıDeneysel kayıtlarında rce seviyesi.
   Not: uzunluk-kontrolörünün 'Bul Kuvvet Zero' hareketi sıfır kuvvete karşılık gelen kuvvet dönüştürücü seviyesini (yani lif kısaca hareketin bir sonucu olarak gevşer) ortaya koymaktadır. Pasif kuvvet o sıfır ve dönüştürücü-sıfırlama hareketine hemen önce kuvvet seviyesi arasındaki farktır.
4. 3 dakika sonunda, aktive edici çözeltisi içeren bölmeye fiber taşımak ve hızlı bir yükseliş önce yürürlükte olan bir plato ile kanıtlandığı gibi yüksek izometrik geliştirmeye olanak sağlar.
5. Maksimum izometrik kuvvet ulaştıktan sonra, aktive çözeltisi içeren odasında sıfır kuvvete karşılık gelen kuvvet dönüştürücü çıkışı tanımlamak için uzunluk-kumandayı kullanın.
   Not: sıfır kuvvete karşılık gelen kuvvet dönüştürücü çıkışı, genel olarak, her bir çözüm dolu bölme için farklı olduğu için, bu gereklidir.
6. İkinci kuvvet ulaşılması ardından çoğateau, rahatlatıcı solüsyon içeren odasına fiber dönün. Test artık tamamlanmıştır. Herhangi bir oturum aspirat sırasında tüm çözümleri birden lifleri sınamak ve yeni, soğutulmuş çözümler ekleyin.
   Not: uzun bir süre boyunca maksimum kasılma ortaya çıkartılması sırasında Brenner'in Çevrim protokolleri dikkate alınmalıdır. Bu protokol, maksimum aktif lif ⁹ yapısal ve mekanik özelliklerini muhafaza etmek için gösterilmiştir.

Sonuçlar

Sağlıklı, kimyasal geçirgen tek lifler şeklinde üniforma görünür ve yüksek büyütme altında bakıldığında tutarlı çizgi çizgi aralığı olmalıdır. Forseps ile manipüle zaman esnek ya da bariz yapısal hasar Lifler atılmalıdır.

Adım 15 sırasında alınan yüksek büyütme dijital görüntüler lif orta kesimi boyunca 5 eşleştirilmiş çap ölçümleri için analiz edilir. Fiber CSA eliptik kesite varsayarak ve Şekil 7A'da gösterildiği gibi 5 ayrı CSA ölçümleri ortalama tahmin edilmektedir. Şekil 7B de tek bir görünümde lif boyutları diğer görünümü (yani çapraz eşleştirilmiş boyutlara ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde farklı olabilir nasıl göstermek için hizmet vermektedir bölümler) Genel, yuvarlak, değil.

İnsan yavaş ve hızlı liflerden Örnek kuvvet izleri, sırasıyla Şekiller 8A ve 8B'de gösterilmektedir. Voltajlıkuvvet dönüştürücünün e çıkışı test sırasında elde edilen ve veri toplama ve analiz yazılımı (LabVIEW) kullanarak (mN) zorlamak dönüştürülür. 9 Şekil çıkarılarak hesaplanan maksimum aktif güç (F _o) değerlendirmek için kullanılan bir yaklaşım göstermektedir Optimal sarkomer uzun uzadıya fiber korumak için gerekli kuvvet rahat bir devlet iken (pasif kuvvet, F _P), maksimal lif aktivasyonu sırasında geliştirilen büyük izometrik kuvvet (toplam kuvvet, F _T) den. Sıfır kuvvete karşılık gelen kuvvet dönüştürücünün çıkış yana olan, genel olarak, farklı banyo odaları her biri için farklı kısaca sıfır kuvvet seviyesini yakalamak için ön-aktive edici ve çözümler aktive hem de lif gevşetin Deneysel kaydı. Lif CSA maksimum aktif gücün Normalleştirme spesifik kuvvet (sF _o) daha bilgilendirici değeri oluşturmak için kullanılır. Göz önüne lif CSA aldığından, sF _o ve böylece farklı boyutlarda lifleri arasındaki işlevsel karşılaştırmalar sağlayan fiberin kontraktil aparat içsel kuvvet üretim kapasitesinin bir ölçü sağlar. Bununla birlikte, CSA ölçümleri diğer alt-hücresel yapılar tarafından işgal edilen oran karşı kontraktil filamentler tarafından işgal edilen fiber oranını ayırt etmek mümkün olmadığı not edilmelidir.

Tipik sağlıklı özellikleri, fare ve Gumucio ve ark Claflin ve ark., 2011, insan için ^10, Mendias ve ark., 2011 ¹ yetişkin lifleri. Sıçan için 2012 ² Tablo 3'te ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Kullanılarak elde edilmiştir Tablo 3'te sunulan tüm veriler Bu makalede tarif edilen teknikler.

	Insan (Vastus lateralis)				Fare (EDL)	Sıçan (Infraspinatus)
	Erkek		Kadın		Erkek	Erkek
	Tip 1	Tip 2a	Tip 1	Tip 2a	(Daktilo değil)	(Daktilo değil)
CSA (mikron 2)	6900 - 4880	8380 - 5270	5470 - 3870	5610 - 4010	3080 - 1850	8010 - 5290
F o (MN)	0,79-1,17	1,02-1,54	0,64-0,97	0,71-1,07	0,14-0,25	0,55-0,97
sF o (kPa)	142-182	165-210	156-193	172-214	67-94	102-131
n	129	160	149	207	37	94

İnsan vastus sağlıklı, erişkin liflerin Tablo 3. Tipik özellikleri ¹⁰ lateralis, fare ekstansör digitorum longus ¹ ve sıçan infraspinatus ² kaslar. Optimal sarkomer uzunlukları, hem fare insan liflerin ^7,8 için 2.7 mm ve 2.5 mm (36 olarak belirlenmiştir 37) ve sıçan elyaf (38). Deneysel fazla _F aralıkları ^(25. ve ^75. kuvartiller) 1,39-1,73 mm, 1,17-1,53 mm, sırasıyla insan, fare ve sıçan için 1,32-1,59 mm idi. Gösterilen aralıklar 25 ^inci ve 75 ^inci çeyrekleri gösterir ve n test liflerin sayısıdır.

test sırasında yaşanan en sık karşılaşılan sorunlar bir kuvvet yanıt vermeyen sonuçlanan bir dikiş döngü kayma içerirŞekil 10A'da gösterildiği şekilde, bir "tutulmuş" ve aniden doğru ya da (arası) döner bir kuvvet yanıt ile sonuçlanır lif, kısmi ya da tam kalınlıkta gözyaşı ile e sıfır fiber halen, çözelti aktive daldırılmış bir halde iken (Şekil 10B). Bir kayma, gözyaşı kırılma veya bir deney sırasında meydana gelirse, lif atılmalıdır ve lif arızaları kaydını muhafaza da ¹¹ bilgilendirici olabilir ama veriler hariç. Karşılaşılabilecek bir başka negatif sonuç ise, önceden aktive çözeltisi (Şekil 10 c) 'de fiber erken aktivasyonudur. Ön aktive çözeltisi içinde kısmi aktivasyon (örneğin, kalsiyum konsantrasyonunda bir artış istenmeyen sıra önceden aktive) önemli çapraz-çukurlu kontaminasyonu göstermektedir. Bu durumda, bütün hamam aspire edilmelidir ve iyonu giderilmiş su ile iyice durulandı. Odacıklar arasında bölünmesi yüzeyleri Kurutma de yapılması önerilmiştir olduğunuBu alanlarda nem veya yoğunlaşma olarak kayda banyoları arasında çözeltisi fitilleme neden olabilir. Karar içerir veya veri nihai deney odak bağlıdır ve çalışma tasarımı bu şekilde düşünülmelidir hariç tutmak.

Şekil 1: Dikiş döngü (10-0 monofilament naylon dikiş).

Şekil 2:. Bundle diseksiyon Forseps sol elinde olan mikrodisseksiyon makas sağ elinde bulunmaktadır. Kırmızı çizgi liflerin boyuna eksenleri ile el bileği ve makas olumlu yönünü gösterir.

Şekil 3: (A) test cihazı. (A) şeffaf dipleri ile deneysel odaları. (B) Boy-kontrolör. (C) Kuvvet-dönüştürücü. (D) Işık kaynağı. (E) dijital göstergeli Boy-denetleyici xyz mikrometre sürücü. Dijital göstergeli (f) Sahne mikrometre sürücü. (G) Kuvvet-dönüştürücü xyz mikrometre sürücü. Kalibre lazer difraksiyon Hedef ekranın (h) platformunda kaydedilmiştir. (I) Titreşim izolasyonu tablosu. (B) Deneysel odaları Close-up görünümü. Uzunluk denetleyici uzanan (j) Paslanmaz çelik eki yüzeyi. Kuvvet-transdüser uzanan (k) Paslanmaz çelik eki yüzeyi. (L) Yan görünüm prizma. Termoelektrik soğutma modülleri için (m) Konut. Raporlama odası te (n) Termokuplmperature.

Şekil 4: Deneysel odasına diseksiyonu çanak lif aktarmak için kullanılan 100 ul pipet ucu Modifiye.

Şekil 5:. Deneysel aparat üzerine tek bir lifin Montaj (A) Hazırlanan dikiş döngüler paslanmaz çelik eki yüzeylere dişli. (B) Elyaf deney bölmesine aktarıldı. (C) Elyaf kaldırıldı aşırı sütür ile sütür döngüler ilk çifti tarafından paslanmaz çelik eki yüzeylere demirledi. (D) birinci sütür döngüler üstünden dişli ve yerinde bağlı sütür döngüler İkinci çifti.

Şekil 6: Sarkomer uzunluğu, kalibre edilmiş bir hedef ekran üzerine bir lazer girişim deseni çıkıntı ile değerlendirilir: (a) lazer kaynağı.. (B) Ayna. (C) Hedef ekranı. (D) Lazer girişim deseni.

Şekil 7: uygun sarkomer uzunluğunda lif kesit alanının (A) belirlenmesi (2.7 um = insan). Eliptik kesiti varsayıldığında, CSA beş lif orta kesimi boyunca yer ve beş ayrı ölçümlerin ortalamasından her elyaf CSA olarak rapor edilir için hesaplanır. 2a üstten görünüm çapını temsil eder ve bir elips eksenlerinin, 2b yandan görünüşüdür çapını temsil eder ve elips diğer eksenidir. (B) hem üst hem de yan görünümde alınan beş karşılık gelen çap ölçümleri, her gösteren Örnek elyaf ve görüntüler.

Şekil 8: Sağlıklı insan vastus Temsilcisi kuvvet izleri kas liflerini lateralis (A) 1 lif (CSA: 5710 mikron ^2, F _o: 0.89 mN ve sF _o: 156 kPa) yazın.. (: 9510 mikron ^2, F _o: 1.66 mN ve sF _o: 174 kPa CSA) (B) 2a lif yazın. Elyaf miyozin ağır zincir tipi elektroforetik ayırımı ve gümüş boyama teknikleri ²² kullanımı ile tespit edilmiştir.

OAD / 52695 / 52695fig9.jpg "/>
Şekil 9: maksimum aktif kuvvet (F _o) hesaplanması önceden aktive çözelti içinde başlatılan uzunluğu kontrolörünün gevşek indükleyici hareketi sırasında lif kuvveti tepki (a) Genişletilmiş görünüm.. F _p istirahat fiber ile 2.7 um'lik bir sarkomer uzunluğunu korumak için gerekli kuvvettir. (B) uzunluk-denetleyici gevşek uyaran hareketin Genişletilmiş görünümü. F _P - o F _o = F _T unutmayın.

Şekil 10: kuvvet yükselişi sırasında kuvvet izlemesinde bir "catch" kanıtladığı (A) Sütür döngü kayma. Emin döngüler lif etkinleştirmeden önce güvenli olmak için kontrol edin. Etkinleştirme sırasında (B) Lif molası. Dikiş döngü bir yerde sırasında kötü lif bütünlüğü veya agresif lif tedavisine bağlı olabilirment. Nedeniyle Ca aktivasyon öncesi bölmesinin kirlenmesine (C) Erken kısmi fiber aktivasyonunu ^2+.

Tartışmalar

Permeabilize tek iskelet kas liflerinin kasılma özelliklerinin değerlendirmeler bağlamlarda çeşitli kas fonksiyonunu araştırmak için kullanılır. Örnekler yaşlanma etkilerini ¹² değerlendiren çalışmalar, ^10,13,14 egzersiz, uçuşunda ^15, yaralanma ^2,3,16, ilaç tedavileri ^17,18, hastalık ¹⁹ ve fiber yapısı ve fonksiyonu üzerine genetik manipülasyon ^20,21 sayılabilir. Nedeniyle doğrudan kendi doğal konfigürasyonda miyofibril kasılma performansını değerlendirmek için yeteneği, bu tekniğin mevcut potansiyel karıştırıcı etkileri miyofibriler işlevi Evde olmayan bir anlayış oluşturmak için cazip bir platform sağlar zaman nöromüsküler sinyal iletimi ve uyarma kaynaklı kalsiyum bırakma çalışılan sisteme dahil edilmiştir. Bundan başka, tek elyaflar fonksiyonel deneyler bu gibi kontraktil protein tanımlanması sonuçları tamamlamak için kullanılabilirimmünohistokimya veya jel elektroforez + western blot ²² ile elde edilmiştir.

Iskelet kası temel işlevlerinden biri kuvvet üretir etmektir. Sonuç olarak sF _o kasılabilir sistemin kendi kuvvetini üretici yeteneğinin bir ölçüsü, kas fizyolog büyük ilgi görmektedir. SF _o Güvenilir tahminler lif CSA ve F _o hem doğru önlemler gerektirir. Lifler olduğu CSA tahmininde, genel olarak, uzunlukları boyunca CSA de enine kesiti dairesel, ne tek tip, büyük dikkat gösterilmelidir. Bu amaçla, ölçümler 90 ° ile ayrılmış, iki bakış açısından, her konumda, fiberin uzunluğu boyunca çeşitli yerlerde yapılan ve edilmektedir. F _o güvenilir önlemler kalsiyum konsantrasyonu t bir aktive çözümü istihdam kalın ve ince filamentlerin örtüşme maksimize etmek için sarkomer uzunluğunun ayarlanması, pasif kuvvet için muhasebe dahil olmak üzere birçok ayrıntılara dikkat gerektirenazami etkinleşmesini hat sonuçları, arzu edilen deney sıcaklık muhafaza ve deney bir gün önce, elyafların en uygun saklama koşulları (sıcaklık ve süre) muhafaza.

Burada belirtilen adımlar, maksimum izometrik kuvvet değerlendirmek için prosedür tarif ederken, bu iskelet kas lifleri için diğer önemli fonksiyonel özellikleri değerlendirmek için sık sık arzu edilir. Bu lif ek mekanik manipülasyonlar dahil deney protokolü genişleterek elde edilebilir. Örneğin, fiber farklı yüklerin bir dizi karşı kısaltır hangi hız ölçümü kuvvet-güç ve hız-güç ilişkileri ^10,23,24 hesaplanabilir hangi kuvvet-hız ilişkisi, belirlenmesini sağlar. Ayrıca, yüksüz kısalma hızı gevşek kandıran kısalma adımlar ve measuri bir dizi uygulayarak oluşan "gevşek test" ^25, kullanılarak tespit edilebilirlif tarafından gerekli süreyi ng boşluğu kaldırın. Sık bildirilen bir başka kinetik parametre k _tr, geçici olarak tüm ayırır mekanik pertürbasyon aşağıdaki kuvvet yeniden geliştirilmesi için hız sabiti ²⁶ crossbridges olduğunu. Son olarak, kalsiyum konsantrasyonu ve etkin bir güç üretimi ("kuvvet-PCA ilişkisi") arasındaki ilişki, ilgi ¹⁸ genellikle ve eşik aşağıdaki kasılma aktive edilmesi için değişen kalsiyum konsantrasyonları çözeltilerin bir dizi elyaf maruz bırakılması ile tespit edilebilir Bu yeterli sistem maksimum aktivasyona ve bu nedenle maksimum kuvvet (F _o) ortaya çıkarmak için.

Söz konusu ekipmanın daha tek lif kasılma değerlendirmek için gerekli olsa da, diğer ekipman mutlaka gerekli değildir. uzunluğu kontrol cihazı, örneğin,, elyafın, hızlı ve kesin bir uzaması veya kısalması gerektiren herhangi bir deney protokolü için gerekli olanancak (kuvvet kayıtlarında sıfır kuvvet seviyesi hala bazı yollarla tespit edilmelidir rağmen) maksimum izometrik kuvvet değerlendirmek için kesinlikle gerekli değildir. Deney odası içinde lif konumlandırırken, kesit alanını değerlendirmek için kendi haklarıyla yararlı taraftan elyaf gözlem izin prizmalar, mutlaka gerekli değildir. Ayrıca, alternatif odaları veya hızlı bir şekilde doldurulmasına imkân verir, tek bir bölmenin elle çalıştırılan bir sistemin oluşturulması ve çözümlerin boşalma dahil olmak üzere kullanılabilir olabilir çeşitli deneysel çözümlere fiber maruz için araçlar. Böyle 15 ° C gibi alt-fizyolojik deneysel sıcaklıklar genellikle mekanik ölçümlerin ^{1,2,3,5,8,12,17,27} tekrarlanabilirliğini artırmak için kullanılır ise son olarak, diğer sıcaklıklarda ²³ geçerli veri oluşturmak mümkündür ^çözelti özelliklerine sıcaklığında (kalsiyum konsantrasyonu, pH, vs.) etkileri gibi ²⁸ sürece dikkate alınır.

test çözümleri bileşimleri burada açıklanan permeabilize fiber tekniklerinin en kritik yönleri arasında yer alıyor. Çözelti kompozisyonu ile ilgili Hususlar karmaşık ve bu makalenin kapsamı dışındadır. protokol bölümünün Aşama 5'te tarif edilen çözüm sabit bir iyonik kuvvet, katyonik bir bileşim, ve osmolarite ^6,29 korurken çözüm aktive önceden aktive olan transfer edildiği permeabilize elyaf hızlı aktivasyonu üzerine bir vurgu ile tasarlanmıştır. Çözelti bileşimine diğer yaklaşımlar diğer araştırma grupları tarafından önemli bir başarı ile kullanılan ve genellikle yayınlanan bağlanma sabitleri ve hesaplama araçları ^27,30,31 faydalanmak oylandı. Çeşitli aktive Çözeltilerin kalsiyum iyonları konsantrasyonları, bu kuvvet-PCA değerlendirmeler olarak submaksimal aktivasyonunu kapsayan çalışmalar için özellikle önemlidir. Böyle gibi elyaflar tamamen aktif olan deneyler için tarifD, burada aktive edici çözelti içinde kalsiyum konsantrasyonu tipik olarak tam olarak bilinmesi, daha az kritik hale maksimum kuvveti elde etmek için gerekli olan rahat bir farkla aşmaktadır. Kreatin fosfat ilavesi, aksi kontraktil aktivitesi ile ilişkili olacaktır intramyofibrillar ATP ve ADP dalgalanmaları tamponlanması için önemlidir. Kreatin kinaz ADP kreatin fosfat, fosfat transferini katalize etmek için gereklidir. Yüksek sıcaklıklarda çalışan ya da hızlı bir elyaf ³² yüksek hızlı kısalması ölçüm de dahil olmak üzere yüksek bir ATP devinimlerinin, neden deney koşulları altında, kreatin kinaz elyafa bağlı kalır endojen kreatin kinaz ek çözeltiye ilave edilmelidir. Daha az talep deneysel koşullar için, ATP rejenerasyon sistemi ²⁷ daha az kritiktir.

Permeabilize tek lif tekniği Sınırlamalar şunlardır. Bu testler tarafından oluşturulan veriler tanımlamakDeneysel cihazına bağlı olduğu, belirli miyofibriler biriminin kontraktil özellikler. Sonuç olarak, bu kademeli bir sırayla, kas içinde elyafların toplam sayısı küçük bir kısmını temsil ettiği, elde edildiği, tüm çekirdekli elyaf arasında sadece küçük bir kısmını çeker. Müfettişler bu nedenle dikkatli deneylerden çizilmiş herhangi bir sonuç desteklemek için gerekli örnekleme düşünmelisiniz. Ayrıca, lif fonksiyonu üzerinde bir egzersiz eğitim müdahalenin etkisini değerlendiren değerlendirilen lifler gerçekten eğitim sırasında alınmıştır varsayar. Protokol lifin doğal hücre içi ortam taklit etmek için çalışır rağmen, sarkolemma geçirimli hale sürecinin spesifik olmayan ve mutlaka çözülebilen hücre içi bileşenleri serbest banyo çözeltileri içine nüfuz sağlar. Membran geçirgenliğini bir başka sonucu elyaf hacmi ³³ bir şişme ile kanıtlandığı ozmotik dengesi bir değişikliktir.lif şişmesi Myofilament sistemi ^34,35 azaltılmış kalsiyum hassasiyet elde edilen aktin ve myosin filamentler arasındaki mesafe artar, ancak büyük, ozmotik açıdan aktif bileşikler ³⁴ girişi ile ters çevrilebilir. Dikkate nihai sınırlama deneysel aparatına lifleri bağlamak için kullanılan tekniğin sonucudur. Bu kaçınılmaz fonksiyonel açıklarının katılıyor, ek noktalarında ve yakın iplik sistemi içinde mekansal ilişki bozan gerektirir. Özellikle, en lif ve bağlantı noktalarına komşu bölgeleri işlevsel tehlikeye ve böylece ölçüm sistemine artefakt seri elastikiyetini katkıda bulunur.

Özetle, in vitro kimyasal olarak geçirgen, iskelet kas liflerinin kuvvet üreten kapasitesini değerlendirmek için bir vasıta tarif etmişlerdir. Bu yazının amacı, maksimum izometrik kuvvet generatin değerlendirilmesi olmuştur rağmeninsan iskelet kas liflerinin g kapasite, deneysel yaklaşım modifiye türleri, memeli ya da başka bir dizi boyunca kinetik parametreleri ve ilişkiler, çeşitli belirlemek için genişletilebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polystyrene culture test tube with cap	Fisher Scientific	14-956-3D
0.5 ml screw cap microcentrifuge	Fisher Scientific	02-681-334
0.5 ml microcentrifuge caps with o-ring	Fisher Scientific	02-681-358
Microcentrifuge cryobox	Fisher Scientific	5055-5005
pH meter	Mettler-Toledo	FE20
Petri dish	Fisher Scientific	08-757-11YZ
Nonsterile-suture 10-0 monofilament	Ashaway Line Twine	S30002
Insect pins	Fine Science Tools	26002-10
Forceps - Dumont #5	Fine Science Tools	11251-20
Microdissecting scissors	Fine Science Tools	15000-08
Stereo microscope	Leica Microsystems	MZ8
Micrometer drives	Parker Hannifin	3936M
Thermometer	Physitemp	BAT-12
Water bath circulator	Neslab Instruments	RTE-111
Temperature controller	Aplha Omega Instruments	Series 800
LabVIEW software	National Instruments	-
Computer	Varied	-
Chamber system	Aurora Scientific	802D
Length-controller	Aurora Scientific	312C
Force-transducer	Aurora Scientific	403A
Reagents
K-proprionate	TCI America	P0510
Imadizole	Sigma-Aldrich	I0125
MgCl2•6H20	Sigma-Aldrich	M2670
Brij 58	Sigma-Aldrich	P5884
EGTA (acid)	Sigma-Aldrich	E0396
Na2H2ATP•0.56H2O	Sigma-Aldrich	A7699
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279
HEPES (acid)	Sigma-Aldrich	H7523
MgO	Sigma-Aldrich	529699
HDTA (acid)	TCI America	D2019
CaCO3	Sigma-Aldrich	C4830
NaN3	Sigma-Aldrich	S8032
KOH (1 N)	Sigma-Aldrich	35113
HCL (1 N)	Sigma-Aldrich	318949
Na2CrP•4H2O	Sigma-Aldrich	P7936
pH 10 standard	Fisher Scientific	SB115
pH 7 standard	Fisher Scientific	SB107