קולגן שכבת הפקדת-ידי שכבה במכשירי microfluidic לMicrotissue ייצוב

Summary

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Abstract

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

Introduction

Although microfluidics allows for the exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells, especially primary cells, within microfluidic devices can be challenging. Many traditional cell culture techniques have been developed to sustain and stabilize cell function when cultured in tissue culture plates, but translating those techniques to microfluidic devices is often difficult.

One such technique is the culture of cells on or sandwiched between collagen gels as a model of the physiological 3D cell environment.¹ Type I collagen is one of the most frequently used proteins for biomaterials applications because of its ubiquity in extracellular matrix, natural abundance, robust cell attachment sites, and biocompatibility.² Many cells benefit from 3D culture with collagen, including cancer cells^3,45, microvascular endothelial cells⁶, and hepatocytes⁷, among others. While the use of collagen gels is easy in open formats, such as tissue culture plates, the limited channel dimensions and enclosed nature of microfluidic devices makes the use of liquids that gel impractical without blocking the entire channel.

To overcome this problem, we combined the layer-by-layer deposition technique⁸ with chemical modifications of native collagen solutions to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These layers can stabilize cell morphology and function similar to collagen gels and can be deposited on cells in microfluidic devices without blocking the channels with polymerized matrix. The goal of this method is to modify native collagen to create polycationic and polyanionic collagen solutions and to stabilize cells in microfluidic culture by depositing thin collagen matrix assemblies onto the cells. This technique has been used to stabilize the morphology and function of primary hepatocytes in microfluidic devices.⁹

Although layer-by-layer deposition has previously been reported with natural and synthetic polyelectrolytes¹⁰ to cover hepatocytes in plate culture^11,12 and as a seeding layer for hepatocytes in microfluidic devices^13,14, this method describes the deposition of a pure collagen layer on top of hepatocytes, mimicking the 3D collagen culture techniques. In this protocol, we use hepatocytes as example cells that can be maintained using 3D collagen layers. The many other types of cells that benefit from 3D culture in collagen may similarly benefit from culture after layer-by-layer deposition of an ultrathin collagen matrix assembly.

Protocol

1. הכנת הפתרון המקומי מסיס קולגן

1. הכן או לרכוש 200 מ"ג של acidified, מסיס, סוג אני קולגן מזנבות עכברים ב1-3 מ"ג / מיליליטר באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים בידוד, כגון שדווח על ידי et al Piez. ¹⁵
2. קנה מידה של כמות חומר מוצא מבוסס על רצוי סוף הנפח של פתרונות קולגן שונה. כ לעשות 25-30 מיליליטר של מפוגל ו25-30 מיליליטר של פתרונות קולגן succinylated, כל 3 מ"ג / מיליליטר, 200 מ"ג משל קולגן ילידים המסיס.

2. מתילציה קולגן

1. לדלל של הפתרון המקומי, acidified (pH 2-3) קולגן 100 מ"ג לריכוז של 0.5 מ"ג / מיליליטר עם מים סטריליים קרים כקרח ולשמור על הפתרון על קרח כדי למנוע gelation.
2. התאם את ה- pH של תמיסת קולגן ל9-10 עם כמה טיפות של 1 N NaOH ומערבבים על RT למשך 30 דקות. שים לב למשקע קולגן, גורם פתרון להפך מעונן.
3. ספין למטה פתרון קולגן זירז ב3,000 × גרם במשך 25 דקות. משקע ברור, כמו ג'ל צריך להיות גלוי בחלק התחתון של הצינורות. לשאוב והשלכה נכונה של נוזל supernatant.
4. Resuspend קולגן זירז ב200 מיליליטר של מתנול עם 0.1 N HCl ולאפשר תגובת מתילציה להתרחש עם ערבוב על RT במשך 4 ימים. קולגן לא לפזר, אבל צריך להתפרק לחתיכות קטנות מאוד גלויות שיהפוך את פתרון מעונן.
5. לאחר מתילציה, צנטריפוגה הפתרון ב3,000 × גרם במשך 25 דקות עד גלולה קולגן מפוגל. לשאוב ולהיפטר supernatant מתנול acidified.
6. ממיסים את קולגן מפוגל ב 25 מיליליטר של PBS סטרילי, נותן ריכוז של כ 3 מ"ג / מיליליטר, עם pipetting החוזר והנשנה, ולסנן את הפתרון דרך מסננת תא 60 מיקרומטר. התאם את ה- pH של הפתרון ל7.3-7.4 באמצעות 20 μl מרווחים של 1 N NaOH.
7. להעריך את concentration של הפתרון באמצעות ערכת ELISA קולגן העכברוש המסחרי או ערכת assay hydroxyproline. לדלל את הפתרון עד 3 מ"ג / מיליליטר עם PBS סטרילי.
8. לעקר את פתרון קולגן מפוגל על ​​ידי העברתו לבקבוק זכוכית עם מכסה בורג, שכבות בזהירות 3 מיליליטר של כלורופורם בתחתית הבקבוק, לאפשר את הבקבוק להגדיר O / N ב 4 ° C, ולאחר מכן להסיר את הסביבה נקיה מחיידקים ולאחסן שכבה עליונה, שהוא קולגן מפוגל.
9. אחסן את הפתרון ב- C ° 4 לשימוש בתוך 1 חודש.

3. קולגן Succinylation

1. לדלל של הפתרון המקומי, acidified (pH 2-3) קולגן 100 מ"ג האחר לריכוז של 0.5 מ"ג / מיליליטר עם מים סטריליים קרים כקרח ולשמור על הפתרון על קרח כדי למנוע gelation.
2. התאם את ה- pH של תמיסת קולגן ל9-10 עם כמה טיפות של 1 N NaOH ומערבבים על RT למשך 30 דקות. קולגן צריך לזרז, גורם פתרון להפך מעונן.
3. Dissolve 40 מ"ג של sucאנהידריד cinic (0.4 מ"ג לכל מ"ג של קולגן) ב 10 מיליליטר של אצטון (1/20 ^ה הנפח של פתרון קולגן). לאט לאט (בכ 0.5 מיליליטר במרווחים) להוסיף את תערובת לפתרון קולגן עם ערבוב תוך מעקב pH ברציפות. לשמור על pH מעל 9.0 על ידי הוספת טיפות 1 או 2 של 1 N NaOH כpH 9.0 גישות.
4. ממשיך לבחוש בRT עבור 120 דקות לאחר הוספת כל אנהידריד succinic באצטון. שים לב לפתרון ליתברר כקולגן succinylated מתמוסס. מעת לעת לבדוק את ה- pH כדי להבטיח שהיא נשארת מעל 9.0.
5. התאם את ה- pH של התמיסה עד 4.0 עם 20 מרווחי μl של 1 N HCl. שים לב לפתרון מעונן שוב, כמו קולגן succinylated משקעים.
6. לאחר succinylation, צנטריפוגה הפתרון ב3,000 × גרם במשך 25 דקות עד גלולה קולגן succinylated. לשאוב ולהיפטר supernatant acidified עם אנהידריד succinic unreacted.
7. ממס את קולגן succinylatedב 25 מיליליטר של PBS סטרילי, נותן ריכוז של כ 3 מ"ג / מיליליטר, עם pipetting החוזר והנשנה, ולסנן את הפתרון דרך מסננת תא 60 מיקרומטר. התאם את ה- pH של הפתרון ל7.3-7.4 באמצעות 20 μl מרווחים של 1 N NaOH.
8. להעריך את הריכוז של הפתרון באמצעות ערכת ELISA עכברוש קולגן מסחרי או ערכת assay hydroxyproline. לדלל את הפתרון עד 3 מ"ג / מיליליטר עם PBS סטרילי.
9. לעקר את פתרון קולגן succinylated על ידי העברתו לבקבוק זכוכית עם מכסה בורג, שכבות בזהירות 3 מיליליטר של כלורופורם בתחתית הבקבוק, לאפשר את הבקבוק להגדיר O / N ב 4 ° C, ולאחר מכן להסיר את הסביבה נקיה מחיידקים ולאחסן שכבה עליונה, שהוא קולגן succinylated.
10. אחסן את הפתרון ב- C ° 4 לשימוש בתוך 1 חודש.

4. אימות של שינויי קולגן

1. הכן 1 מיליליטר דגימות מכל אחת מפתרוני קולגן ילידים, מפוגלים, וsuccinylated ולדלל לקונצרט כלשהוentration של 0.1 מ"ג / מיליליטר עם מים טהורים סטרילי לטיטרציה יון מימן. בהמשך לדלל החיץ לפחות 1,000 פי ידי דיאליזה נגד מים באמצעות 10 הפסקת membraneusing 3 שינויי פתרון kDa לפחות 4 שעות כל אחד.
2. התאם את ה- pH של הפתרונות ל7.3 עם כמויות קטנות של NaOH וHCl. באמצעות pH 7.3 כהתייחסות שרירותית, לבצע טיטרציה יון מימן על כל אחד מהדגימות כפי שתואר על ידי Tanford ¹⁶ כדי ליצור עקומות טיטרציה לפתרונות קולגן ילידים, מפוגלים, וsuccinylated.
3. עלילה השינוי ברמת חומציות לכל נפח של חומצה הוסיף לעומת המספר של H ⁺ יונים לכל מולקולה הקשורה. טווח "האמין" pH הגבוה צריך להראות שינוי בקולגן succinylated לעבר הנקודה הניטרלית (הפסד של קבוצות האמינים), והמגוון "carboxyl" pH הנמוך צריך להראות משמרת שמאלה בקולגן מפוגל (הפסד של קבוצות carboxyl ) ותזוזה ימינה בקולגן succinylated (רווח בקבוצת carboxylים), בהשוואה לקולגן הטבעי.
4. להעריך את היעילות של תגובת succinylation ידי קביעת% מקבוצות אמינו בקולגן הילידים הוחלף על ידי succinylation בשיטת חומצת 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic (TNBA) colorimetric, הבאים פרוטוקולים סטנדרטיים ^17,18.

5. ייצור של מכשירי microfluidic וזריעת תאים

1. לפברק מכשירי microfluidic תוך שימוש בשיטות סטנדרטית ^9. השתמש בדפוס העתק של PDMS מSU-8 מאסטרים על סיליקון המוגדר באמצעות photolithography ליצור תאי תרבית תאי microfluidic עם 100 מיקרומטר גבוה, רחב .4-1.5 מ"מ, ו1-10 מ"מ ערוצים ארוכים לצמיחת תאים.
2. השתמש בשואב פלזמה לחמצן את המשטחים של המכשיר ושקופיות זכוכית, ולאחר מכן לחץ יחד כדי אג"ח. לאחר חיטוי המכשיר על ידי חשיפה לאור UV במשך לפחות 30 דקות, למלא את התא עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין בPBS סטרילי ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות.
3. זרעי המכשיר עם תאים, כגון חולדה ראשונית או hepatocytes אדם, אשר דורשים ג'ל קולגן לייצוב של פנוטיפ או מדינת בידול. אנו משתמשים 20 μl של hepatocytes מבודד טרי עכברוש עיקרי ^7,19 או hepatocytes האנושי הראשוני cryopreserved זמין מסחרי זרע בגיל 14 × 10 ⁶ תאים / מיליליטר למכשיר.
4. אפשר התאים לצרף במשך 4-6 שעות, ולאחר מכן לשטוף את התאים פנויים ולהחליף את התקשורת עם ציפוי תקשורת צמיחה. דגירה O / N כדי להבטיח תא מלא מתפשט וליצור monolayer ומחוברות של תאים.

6. שכבה אחר שכבה קולגן הפקדת

1. בשכונת תרביות רקמת זרימה למינרית, להכין כמויות מספיקות של פתרונות קולגן מפוגלים וsuccinylated במשך 10 יישומים של כל פתרון לכל מכשיר, כמו גם כמה MLS של תקשורת. שמור את הפתרונות על קרח. אנו משתמשים 20 μl (10-15 פעמים בסך הכל מכשיר נפח) של קולגן לכל שכבה לכל מכשיר.
2. להיותginning עם הפתרון מפוגל (polycationic), חלופי שטיפת המכשירים עם 20 μl של מפוגל ולאחר מכן succinylated פתרונות קולגן, מחכה דק '1 בין כל יישום. לשטוף את המכשיר בסך הכל 10 פעמים בפתרון, שאמורה לקחת כ -20 דקות. לעבוד במהירות כדי לצמצם את כמות הזמן שהתאים ללא תקשורת.
3. שים לב קולגן לצבור לאט בכניסה / היציאה בהתאם לגודלה. אם ההתנגדות לזרימת נוזל עליות, לשטוף את המכשיר פעם או פעמיים עם תקשורת, ולאחר מכן להמשיך שכבות.
4. לאחר החלת כל השכבות, לשטוף את המכשיר פעמיים עם תקשורת טרי ולחזור לחממה. בהתאם לסוג התא, השינויים תאיים הנגרמת המטריצה ​​מורפולוגיים, כמו קיטוב משופר בhepatocytes, צריכים להיות גלויים בתוך כמה שעות.
5. הכן מכשירי נציג למיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים באמצעות שיטות סטנדרטי ⁹ כדי לאמת את הנוכחות של מטריצת קולגןהרכבה על גבי התאים בתרבית.

7. ייצוב של הפנוטיפ תא ותפקוד

1. תמונת מורפולוגיה תא, כדאיות, וקוטביות בשיטות סטנדרטית לסוג התא. לhepatocytes, לאסוף תמונות מעל 14 ימים באמצעות מיקרוסקופ שלב, מכתים חי / מת כדאיות, וצבע CMFDA לקיטוב הפסגה כדי להדגים את ההשפעות של תצהיר קולגן.
2. למורפולוגיה תא, לשטוף את המכשיר דרך הכניסה על ידי פיפטה עם 20 μl של PBS לשטוף, להזריק 20 μl של PBS, ותמונת המכשיר באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב.
3. עבור מכתים חי / מת, שטוף את המכשיר דרך הכניסה על ידי פיפטה עם 20 μl של PBS לשטוף, להזריק 20 μl של פתרון בשידור חי / מת מכתים עם DAPI הכין הבאים הוראות היצרן, דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף מכשיר שוב עם 20 μl של PBS, ותמונת המכשיר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
4. לקנלי מרהצביעת culi, לשטוף את המכשיר דרך הכניסה על ידי פיפטה עם 20 μl של PBS לשטוף, להזריק 20 μl של 2 פתרון מכתים מיקרומטר CMFDA עם DAPI הכין הבאים הוראות היצרן, דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף את המכשיר שוב עם 20 μl של PBS, ותמונת המכשיר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
5. לאסוף את התקשורת בילתה ולמדוד מוצרי חילוף חומרים תאיים בנקודות זמן מתאימות על משך התרבות כדי לקבוע את תפקוד התא. לhepatocytes, למדוד את הכמות של אלבומין ואוריאה בתקשורת בילתה.
6. לבצע ניתוחים תפקודיים נקודות קצה בתאים עצמם, כגון רמות הערכת אנזים פעילות, מכתים נוגדן, או ניתוח RNA. לhepatocytes, לעורר ולמדוד את פעילות אנזים ציטוכרום P450 או שלב S-transferase גלוטתיון האנזים השני הצמידה.

תוצאות

קולגן ילידים יכול להיות שונה באמצעות מתילציה וsuccinylation ליצור פתרונות קולגן polycationic וpolyanionic לשימוש בתצהיר שכבה אחר שכבה. Succinylation משנה את קבוצות ε-אמינו של קולגן יליד עם קבוצות succinyl, ומתילציה משנה את קבוצות carboxyl של קולגן יליד עם קבוצה מתיל (איור 1 א). שינויים אלה ל?...

Discussion

ניתן להפקיד מכלולי קולגן הטהור Ultrathin על תאים טעונים או surfaces חומר באמצעות תצהיר שכבה אחר שכבה של collagens שונה. תוצאות מחקר זה מראות כי מתילציה וsuccinylation של קולגן ילידים ליצור פתרונות קולגן polycationic וpolyanionic טעון (איור 1) שניתן להשתמש בו עם טכניקת שכבה אחר שכבה להפקיד ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
collagen type I, rat tail	Life Technologies	A1048301	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	Sigma-Aldrich	C3867-1VL	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	EMD Millipore	08-115	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	R%D Systems	3440-100-01	option for concentrated rat tail collagen
succinic anhydride	Sigma-Aldrich	239690-50G	succinylation reagent
anhydrous methanol	Sigma-Aldrich	322415-100ML	methylation reagent
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881-500G	pH precipitation reagent
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	320331-500ML	pH precipitation reagent
rat collagen type I ELISA	Chondrex	6013	option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit	Sigma-Aldrich	MAK008-1KT	option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit	Quickzyme Biosciences	QZBtotcol1	option for detecting collagen content