Layer-by-layer collagene Deposizione nel Microfluidic Dispositivi per microtessuto Stabilizzazione

Riepilogo

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Abstract

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

Introduzione

Although microfluidics allows for the exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells, especially primary cells, within microfluidic devices can be challenging. Many traditional cell culture techniques have been developed to sustain and stabilize cell function when cultured in tissue culture plates, but translating those techniques to microfluidic devices is often difficult.

One such technique is the culture of cells on or sandwiched between collagen gels as a model of the physiological 3D cell environment.¹ Type I collagen is one of the most frequently used proteins for biomaterials applications because of its ubiquity in extracellular matrix, natural abundance, robust cell attachment sites, and biocompatibility.² Many cells benefit from 3D culture with collagen, including cancer cells^3,45, microvascular endothelial cells⁶, and hepatocytes⁷, among others. While the use of collagen gels is easy in open formats, such as tissue culture plates, the limited channel dimensions and enclosed nature of microfluidic devices makes the use of liquids that gel impractical without blocking the entire channel.

To overcome this problem, we combined the layer-by-layer deposition technique⁸ with chemical modifications of native collagen solutions to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These layers can stabilize cell morphology and function similar to collagen gels and can be deposited on cells in microfluidic devices without blocking the channels with polymerized matrix. The goal of this method is to modify native collagen to create polycationic and polyanionic collagen solutions and to stabilize cells in microfluidic culture by depositing thin collagen matrix assemblies onto the cells. This technique has been used to stabilize the morphology and function of primary hepatocytes in microfluidic devices.⁹

Although layer-by-layer deposition has previously been reported with natural and synthetic polyelectrolytes¹⁰ to cover hepatocytes in plate culture^11,12 and as a seeding layer for hepatocytes in microfluidic devices^13,14, this method describes the deposition of a pure collagen layer on top of hepatocytes, mimicking the 3D collagen culture techniques. In this protocol, we use hepatocytes as example cells that can be maintained using 3D collagen layers. The many other types of cells that benefit from 3D culture in collagen may similarly benefit from culture after layer-by-layer deposition of an ultrathin collagen matrix assembly.

Protocollo

1. Preparazione della soluzione nativa Solubile Collagene

1. Preparare o acquistare 200 mg di acidificato, solubile, collagene di tipo I da code di ratto a 1-3 mg / ml utilizzando i protocolli di isolamento standard, come riportato da Piez et al. ¹⁵
2. Scalare la quantità di materiale di partenza in base al volume finale desiderato soluzioni collagene modificati. Circa fare 25-30 ml di metilato e 25-30 ml di soluzione di collagene succinilate, ciascuno a 3 mg / ml, da 200 mg di collagene nativo solubile.

2. Collagene metilazione

1. Diluire 100 mg del, acidificata (pH 2-3) soluzione di collagene nativo ad una concentrazione di 0,5 mg / ml con ghiaccio acqua sterile fredda e mantenere la soluzione in ghiaccio per evitare la gelificazione.
2. Regolare il pH della soluzione di collagene di 9-10 con poche gocce di NaOH 1 N e agitare a temperatura ambiente per 30 min. Osservare il precipitato collagene, causando la soluzione per diventare torbida.
3. Spin giù la soluzione di collagene precipitato a 3.000 g per 25 min. Un chiaro, precipitato gelatinoso dovrebbe essere visibile nel fondo delle provette. Aspirare e smaltire il liquido surnatante.
4. Risospendere il precipitato collagene in 200 ml di metanolo con HCl 0,1 N e lasciare che la reazione di metilazione di verifica con agitazione a temperatura ambiente per 4 giorni. Il collagene non si dissolvono, ma dovrebbe rompersi in pezzi molto piccoli visibili che renderanno la soluzione torbida.
5. Dopo la metilazione, centrifugare la soluzione a 3.000 × g per 25 minuti per far sedimentare il collagene denaturato. Aspirare e smaltire il surnatante metanolo acidificato.
6. Sciogliere il collagene metilata in 25 ml di PBS sterile, dando una concentrazione di circa 3 mg / ml, con pipettaggio ripetute, e filtrare la soluzione attraverso un colino cella di 60 micron. Regolare il pH della soluzione a 7,3-7,4 usando 20 ml incrementi di 1 N NaOH.
7. Valutare la concentration della soluzione con un commerciale collagene topo kit ELISA o kit di analisi idrossiprolina. Diluire la soluzione di 3 mg / ml con PBS sterile.
8. Sterilizzare la soluzione di collagene denaturato trasferendolo ad una bottiglia di vetro con tappo a vite, stratificazione accuratamente 3 ml di cloroformio sul fondo della bottiglia, consentono la bottiglia per impostare O / N a 4 ° C, e poi asetticamente rimuovere e conservare la strato superiore, che è il collagene denaturato.
9. Conservare la soluzione a 4 ° C per l'uso entro 1 mese.

3. Il collagene succinilazione

1. Diluire l'altra 100 mg del, acidificata (pH 2-3) soluzione di collagene nativo ad una concentrazione di 0,5 mg / ml con ghiaccio acqua sterile fredda e mantenere la soluzione in ghiaccio per evitare la gelificazione.
2. Regolare il pH della soluzione di collagene di 9-10 con poche gocce di NaOH 1 N e agitare a temperatura ambiente per 30 min. Il collagene non precipitare, provocando la soluzione per diventare torbida.
3. Sciogliere 40 mg di succinico anidride (0,4 mg per mg di collagene) in 10 ml di acetone ^(1/20 il volume della soluzione di collagene). Lentamente (in circa 0,5 ml incrementi) aggiungere il composto alla soluzione di collagene sotto agitazione mentre continuo monitoraggio del pH. Mantenere il pH superiori a 9,0 aggiungendo 1 o 2 gocce di NaOH 1 N come il pH si avvicina 9,0.
4. Continua agitazione a temperatura ambiente per 120 minuti dopo l'aggiunta di tutti i anidride succinica in acetone. Osservare la soluzione a diventare chiaro come il collagene succinilata dissolve. Controllare periodicamente il pH per garantire che rimanga sopra 9,0.
5. Regolare il pH della soluzione a 4,0 con 20 microlitri di 1 incrementi N HCl. Osservare la soluzione torbida di nuovo, come il collagene succinilata precipita.
6. Dopo la succinilazione, centrifugare la soluzione a 3.000 × g per 25 minuti per far sedimentare il collagene succinilata. Aspirare e smaltire il surnatante acidificato con reagito anidride succinica.
7. Sciogliere il collagene succinilatain 25 ml di PBS sterile, dando una concentrazione di circa 3 mg / ml, con pipettaggio ripetute, e filtrare la soluzione attraverso un colino cella di 60 micron. Regolare il pH della soluzione a 7,3-7,4 usando 20 ml incrementi di 1 N NaOH.
8. Valutare la concentrazione della soluzione con un commerciale topo collagene kit ELISA o kit di analisi idrossiprolina. Diluire la soluzione di 3 mg / ml con PBS sterile.
9. Sterilizzare la soluzione di collagene succinilata trasferendolo ad una bottiglia di vetro con tappo a vite, stratificazione accuratamente 3 ml di cloroformio sul fondo della bottiglia, consentono la bottiglia per impostare O / N a 4 ° C, e poi asetticamente rimuovere e conservare la strato superiore, che è il collagene succinilata.
10. Conservare la soluzione a 4 ° C per l'uso entro 1 mese.

4. Verifica del collagene Modifiche

1. Preparare 1 ml campioni da ciascuna delle soluzioni collagene nativo, metilato, e succinilate e diluire ad una concentration di 0,1 mg / ml con acqua pura sterile per ioni idrogeno titolazione. Diluire ulteriormente il buffer almeno 1.000 volte con la dialisi contro acqua attraverso un taglio di 10 kDa membraneusing 3 soluzione cambia per almeno 4 ore ciascuna.
2. Aggiustare il pH delle soluzioni a 7.3 con piccole quantità di NaOH e HCl. Utilizzando pH 7,3 come riferimento arbitraria, eseguire ione idrogeno titolazione su ciascuno dei campioni come descritto da Tanford ¹⁶ per creare curve di titolazione per le soluzioni collagene nativo, metilato, e succinilata.
3. Tracciare la variazione di pH per volume di acido aggiunto rispetto al numero di ioni per molecola H ⁺ bound. La gamma "amino" alto pH dovrebbe mostrare un cambiamento nel collagene succinilata verso il punto neutro (perdita di gruppi amminici), e il basso pH range "carbossile" dovrebbe mostrare uno spostamento verso sinistra del collagene denaturato (perdita di gruppi carbossilici ) e uno spostamento verso destra della collagene succinilata (un guadagno in gruppo carbossilicos), rispetto al collagene nativo.
4. Valutare l'efficacia della reazione succinilazione determinando la% di gruppi amminici in collagene nativo sostituito da succinilazione utilizzando acido 2,4,6-trinitrobenzensulfonico (TNBA) metodo colorimetrico, seguendo protocolli standard ^17,18.

5. Realizzazione di dispositivi Microfluidic e il seeding cellulare

1. Realizzare dispositivi microfluidici utilizzando metodi standard di ^9. Utilizzare replica stampaggio di PDMS da SU-8 master sul silicio definita utilizzando fotolitografia per creare microfluidica camere di coltura cellulare con 100 micron di altezza, 0,4-1,5 mm e 1-10 mm di lunghezza canali per la crescita delle cellule.
2. Utilizzare un detergente plasma per ossidare le superfici del dispositivo e un vetrino, quindi premere insieme al legame. Dopo la sterilizzazione del dispositivo per esposizione a luce UV per almeno 30 minuti, riempire la camera con 50 ug / ml di fibronectina in PBS sterile e incubare a 37 ° C per 45 min.
3. Inizializzare il dispositivo con le cellule, come ratto primaria o epatociti umani, che richiedono un gel di collagene per la stabilizzazione del fenotipo o stato di differenziazione. Usiamo 20 l di appena isolate di ratto primario epatociti ^7,19 o disponibili in commercio crioconservati epatociti umani primari seminati a 14 ^× 10 6 cellule / ml al dispositivo.
4. Permettono alle cellule di allegare per 4-6 ore, e poi lavare le cellule non attaccati e sostituiscono i terreni in piastra con i media di crescita. Incubare O / N a garantire cella piena diffusione e creare un monostrato confluente di cellule.

6. strato per strato deposizione di collagene

1. In una cappa coltura tissutale flusso laminare, preparare volumi sufficienti di soluzioni collagene denaturato e succinilate per 10 applicazioni di ciascuna soluzione per dispositivo, nonché alcuni ml di media. Mantenere le soluzioni su ghiaccio. Usiamo 20 l (10-15 volte il volume totale del dispositivo) di collagene per strato per dispositivo.
2. Esseresgranatura con la soluzione di metilato (policationico), si alternano gli scarichi dei dispositivi con 20 ml di metilato e poi succinilata soluzioni di collagene, in attesa 1 minuto tra ogni applicazione. Lavare il dispositivo per un totale di 10 volte al di soluzione, che dovrebbe durare circa 20 minuti. Lavorare velocemente per minimizzare la quantità di tempo le cellule sono prive di mezzi.
3. Osservare collagene lentamente accumularsi in ingresso / uscita in funzione della sua dimensione. Se la resistenza al flusso fluido aumenta, a filo il dispositivo una o due volte con i media, e poi continuare stratificazione.
4. Dopo aver applicato tutti gli strati, sciacquare il dispositivo due volte con mezzi freschi e ritornare alla incubatore. A seconda del tipo di cellula, i cambiamenti morfologici extracellulare dalla matrice, ad esempio maggiore polarizzazione in epatociti, dovrebbero essere visibili entro poche ore.
5. Preparare dispositivi rappresentativi per microscopia elettronica a trasmissione utilizzando metodi standard ⁹ per verificare la presenza di una matrice di collagenemontaggio sulla parte superiore delle cellule in coltura.

7. Stabilizzazione del fenotipo delle cellule e funzione

1. Immagine la morfologia cellulare, la vitalità, e la polarità utilizzando metodi standard per il tipo di cella. Per epatociti, raccogliere le immagini più di 14 giorni utilizzando la microscopia di fase, LIVE / colorazione MORTO per la vitalità, e CMFDA tintura per la polarizzazione apicale per dimostrare gli effetti della deposizione di collagene.
2. Per morfologia cellulare, lavare il dispositivo attraverso l'ingresso da pipetta con 20 ml di PBS per sciacquare, iniettare 20 ml di PBS, e l'immagine del dispositivo tramite microscopio a contrasto di fase.
3. Per LIVE / colorazione MORTO, lavare il dispositivo attraverso l'ingresso da pipetta con 20 ml di PBS per lavare, iniettare 20 ml di soluzione colorante LIVE / MORTO con DAPI preparati secondo le istruzioni del produttore, incubare per 30 minuti a 37 ° C, lavare il Dispositivo di nuovo con 20 ml di PBS, e l'immagine del dispositivo tramite microscopia a fluorescenza.
4. Per bile canalicolorazione culi, lavare il dispositivo attraverso l'ingresso da pipetta con 20 ml di PBS per sciacquare, iniettare 20 ml di 2 soluzione colorante mM CMFDA con DAPI preparati secondo le istruzioni del produttore, incubare per 30 minuti a 37 ° C, lavare il dispositivo di nuovo con 20 ml di PBS, e l'immagine del dispositivo usando la microscopia a fluorescenza.
5. Raccogliere i media spesi e misurare prodotti metabolici cellulari in appositi punti di tempo per tutta la durata della cultura per determinare la funzione delle cellule. Per epatociti, misurare la quantità di albumina e urea nei media spesi.
6. Effettuare analisi funzionali endpoint sulle cellule stesse, come la valutazione dei livelli degli enzimi di attività, colorazione degli anticorpi, o analisi di RNA. Per epatociti, indurre e misurare le attività enzimatici del citocromo P450 o di fase II coniugazione enzima glutatione S-transferasi.

Risultati

Collagene nativo può essere modificato con metilazione e succinilazione per creare soluzioni di collagene policationici e polianionici per l'uso in strato per strato di deposizione. Succinilazione modifica i gruppi ε-amino di collagene nativo con gruppi succinil e metilazione modifica i gruppi carbossilici di collagene nativo con un gruppo metilico (Figura 1A). Queste modifiche alle catene laterali di aminoacidi della proteina collagene alterano le curve di titolazione del pH per le soluzioni. Suc...

Discussione

Ultrasottili assiemi collagene puro possono essere depositati su cellule caricate o superfici dei materiali utilizzando deposizione layer-by-layer di collageni modificati. I risultati di questo studio dimostrano che la metilazione e succinilazione di collagene nativo creare soluzioni collagene policationici e polianionici (Figura 1) che può essere utilizzato con la tecnica layer-by-layer depositare assiemi matrice di collagene ultrasottili sulle cellule (Figura 2) o altro addebitate su...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
collagen type I, rat tail	Life Technologies	A1048301	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	Sigma-Aldrich	C3867-1VL	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	EMD Millipore	08-115	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	R%D Systems	3440-100-01	option for concentrated rat tail collagen
succinic anhydride	Sigma-Aldrich	239690-50G	succinylation reagent
anhydrous methanol	Sigma-Aldrich	322415-100ML	methylation reagent
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881-500G	pH precipitation reagent
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	320331-500ML	pH precipitation reagent
rat collagen type I ELISA	Chondrex	6013	option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit	Sigma-Aldrich	MAK008-1KT	option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit	Quickzyme Biosciences	QZBtotcol1	option for detecting collagen content