Couche par couche dépôt de collagène dans les dispositifs microfluidiques pour Microbroyeur stabilisation

Résumé

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Résumé

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

Introduction

Although microfluidics allows for the exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells, especially primary cells, within microfluidic devices can be challenging. Many traditional cell culture techniques have been developed to sustain and stabilize cell function when cultured in tissue culture plates, but translating those techniques to microfluidic devices is often difficult.

One such technique is the culture of cells on or sandwiched between collagen gels as a model of the physiological 3D cell environment.¹ Type I collagen is one of the most frequently used proteins for biomaterials applications because of its ubiquity in extracellular matrix, natural abundance, robust cell attachment sites, and biocompatibility.² Many cells benefit from 3D culture with collagen, including cancer cells^3,45, microvascular endothelial cells⁶, and hepatocytes⁷, among others. While the use of collagen gels is easy in open formats, such as tissue culture plates, the limited channel dimensions and enclosed nature of microfluidic devices makes the use of liquids that gel impractical without blocking the entire channel.

To overcome this problem, we combined the layer-by-layer deposition technique⁸ with chemical modifications of native collagen solutions to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These layers can stabilize cell morphology and function similar to collagen gels and can be deposited on cells in microfluidic devices without blocking the channels with polymerized matrix. The goal of this method is to modify native collagen to create polycationic and polyanionic collagen solutions and to stabilize cells in microfluidic culture by depositing thin collagen matrix assemblies onto the cells. This technique has been used to stabilize the morphology and function of primary hepatocytes in microfluidic devices.⁹

Although layer-by-layer deposition has previously been reported with natural and synthetic polyelectrolytes¹⁰ to cover hepatocytes in plate culture^11,12 and as a seeding layer for hepatocytes in microfluidic devices^13,14, this method describes the deposition of a pure collagen layer on top of hepatocytes, mimicking the 3D collagen culture techniques. In this protocol, we use hepatocytes as example cells that can be maintained using 3D collagen layers. The many other types of cells that benefit from 3D culture in collagen may similarly benefit from culture after layer-by-layer deposition of an ultrathin collagen matrix assembly.

Protocole

1. Préparation de la solution de collagène natif soluble

1. Préparer ou acheter 200 mg de acidifiés, soluble, collagène de type I à partir de queues de rats à 1-3 mg / ml en utilisant des protocoles d'isolement classiques, tels que rapportés par Piez et al. ¹⁵
2. L'échelle de la quantité de matière de départ par rapport au volume final souhaité de solutions de collagène modifiés. Environ 25 à 30 ml de faire méthyle et de 25 à 30 ml de solutions de collagène succinylés, chacun à 3 mg / ml, à partir de 200 mg de collagène natif soluble.

2. Collagène méthylation

1. Diluer 100 mg de la, acidifié (pH 2-3) solution native de collagène à une concentration de 0,5 mg / ml avec de la glace de l'eau stérile froide et maintenir la solution sur de la glace pour empêcher la gélification.
2. Ajuster le pH de la solution de collagène à 10/09 avec quelques gouttes de NaOH 1 N et on agite à température ambiante pendant 30 min. Observez le précipité de collagène, entraînant la solution à devenir trouble.
3. Isoler le précipité de collagène solution à 3000 g pendant 25 min. Un précipité clair, gel doit être visible dans le fond des tubes. Aspirer et éliminer correctement le liquide surnageant.
4. Remettre en suspension le précipité de collagène dans 200 ml de méthanol avec HCl 0,1 N et laisser la réaction de méthylation de se produire avec agitation à température ambiante pendant 4 jours. Le collagène ne se dissout pas, mais devrait se briser en très petits morceaux visibles qui feront la solution trouble.
5. Après la méthylation, centrifugeuse la solution à 3000 g pendant 25 min pour sédimenter le collagène méthylé. Aspirer et éliminer le surnageant de méthanol acidifié.
6. On dissout le collagène méthylé dans 25 ml de PBS stérile, ce qui donne une concentration d'environ 3 mg / ml, avec pipetage répété, et filtrer la solution à travers un tamis cellulaire de 60 pm. Ajuster le pH de la solution à 7,3 à 7,4 en utilisant 20 ul incréments de NaOH 1 N.
7. Évaluer la Concentration de la solution en utilisant un collagène de rat commerciale kit ELISA ou kit de dosage hydroxyproline. Diluer la solution à 3 mg / ml avec du PBS stérile.
8. Stériliser la solution de collagène méthylé en le transférant à une bouteille en verre avec un bouchon à vis, marcottage soigneusement 3 ml de chloroforme au fond de la bouteille, laissez la bouteille pour régler O / N à 4 ° C, puis de façon aseptique Retirez et rangez les couche supérieure, qui est le collagène méthylé.
9. Conserver la solution à 4 ° C pour une utilisation dans un mois.

3. Le collagène Succinylation

1. Diluer les 100 autres mg de la, acidifié (pH 2-3) solution native de collagène à une concentration de 0,5 mg / ml avec de la glace de l'eau stérile froide et maintenir la solution sur de la glace pour empêcher la gélification.
2. Ajuster le pH de la solution de collagène à 10/09 avec quelques gouttes de NaOH 1 N et on agite à température ambiante pendant 30 min. Le collagène devrait précipiter, entraînant la solution à devenir trouble.
3. Dissoudre 40 mg de Succinic anhydride (0,4 mg par mg de collagène) dans 10 ml d'acétone (20/01 ^ème volume de la solution de collagène). Lentement (environ 0,5 ml en incréments) ajouter à ce mélange la solution de collagène sous agitation tout en contrôlant en continu le pH. Maintenir le pH au-dessus de 9,0 par addition de 1 ou 2 gouttes de NaOH 1 N, le pH se rapproche comme 9,0.
4. Poursuivre l'agitation à température ambiante pendant 120 min après l'addition de l'ensemble de l'anhydride succinique dans de l'acétone. Observez la solution à devenir clair que le collagène succinylé dissout. Contrôler régulièrement le pH pour qu'il reste au-dessus de 9,0.
5. Ajuster le pH de la solution à 4,0 avec 20 ul de incréments de HCl 1 N. Observez la solution trouble à nouveau, comme le collagène succinylé précipite.
6. Après la succinylation, centrifugeuse la solution à 3000 g pendant 25 min pour sédimenter le collagène succinylé. Aspirer et éliminer le surnageant acidifié avec l'anhydride succinique qui n'a pas réagi.
7. Dissoudre le collagène succinylédans 25 ml de PBS stérile, ce qui donne une concentration d'environ 3 mg / ml, avec pipetage répété, et filtrer la solution à travers un tamis cellulaire de 60 pm. Ajuster le pH de la solution à 7,3 à 7,4 en utilisant 20 ul incréments de NaOH 1 N.
8. Évaluer la concentration de la solution en utilisant un collagène rat commerciale kit ELISA ou kit de dosage hydroxyproline. Diluer la solution à 3 mg / ml avec du PBS stérile.
9. Stériliser la solution de collagène succinylé en le transférant à une bouteille en verre avec un bouchon à vis, marcottage soigneusement 3 ml de chloroforme au fond de la bouteille, laissez la bouteille pour régler O / N à 4 ° C, puis de façon aseptique Retirez et rangez les couche supérieure, qui est le collagène succinylé.
10. Conserver la solution à 4 ° C pour une utilisation dans un mois.

4. Vérification du collagène Modifications

1. Préparer des échantillons de 1 ml de chacune des solutions natives, méthylés, et collagène succinylé et diluer à une concntration de 0,1 mg / ml avec de l'eau pure stérile pour le titrage des ions hydrogène. Diluer le tampon d'au moins 1000 fois par dialyse contre de l'eau à travers une coupure de 10 kDa membraneusing 3 changements de solution pendant au moins 4 heures chacune.
2. Ajuster le pH des solutions à 7,3 avec de petites quantités de NaOH et HCl. Utilisation de pH 7,3 en tant que référence arbitraire, effectuer le titrage d'ions hydrogène sur chacun des échantillons, comme décrit par Tanford ¹⁶ pour créer des courbes de titration pour les solutions natives, méthylés, et collagène succinylé.
3. Tracer la variation de pH par volume d'acide ajoutée par rapport au nombre de H ⁺ ions lié par molécule. Le pH élevé "amino" gamme devrait montrer un changement dans le collagène succinylé vers le point neutre (une perte de groupes amines), et le faible pH "carboxyle" gamme devrait montrer un décalage vers la gauche dans le collagène méthylé (une perte de groupes carboxyle ) et un déplacement vers la droite dans le collagène succinylé (un gain en groupe carboxyles), par rapport au collagène natif.
4. Évaluer l'efficacité de la réaction de succinylation en déterminant le% de groupes amino dans le collagène natif remplacés par succinylation en utilisant l'acide 2,4,6-trinitrobenzène (TNBA) Méthode colorimétrique, suivant des protocoles standard ^17,18.

5. fabrication de dispositifs microfluidiques et la cellule de semis

1. Fabriquer des dispositifs microfluidiques en utilisant des procédés ^standard de 9. Utilisation réplique moulage de PDMS de SU-8 sur silicium maîtres définis par photolithographie microfluidiques pour créer des chambres de culture cellulaire avec 100 um de hauteur, 0,4-1,5 mm de large, et 1 à 10 mm de long des canaux pour la croissance cellulaire.
2. Utilisez un nettoyeur à plasma pour oxyder les surfaces de l'appareil et une lame de verre, puis appuyez ensemble pour obligataire. Après stérilisation du dispositif par exposition à la lumière UV pendant au moins 30 min, remplir la chambre avec 50 ug / ml de fibronectine dans du PBS stérile et incuber à 37 ° C pendant 45 min.
3. Initialiser le dispositif avec des cellules de rat, telles que les hépatocytes humains primaires ou qui nécessitent un gel de collagène pour la stabilisation du phénotype ou l'état de différenciation. Nous utilisons 20 pi d'hépatocytes primaires de rat fraîchement isolés ^7,19 ou disponibles dans le commerce des hépatocytes humains primaires cryoconservés ensemencées à 14 × 10 ⁶ cellules / ml par appareil.
4. Laisser les cellules se fixer pendant 4-6 heures, puis lavent cellules seules et remplacent les milieux d'étalement avec les médias de la croissance. Incuber O / N pour assurer la pleine étalement cellulaire et de créer une monocouche confluente de cellules.

6. couche par couche de collagène Deposition

1. Dans une hotte à flux laminaire de culture de tissu, préparer des volumes suffisants de solutions de collagène dénaturé et succinylées pour 10 applications de chaque solution par dispositif, ainsi que quelques ml de milieu. Conserver les solutions sur la glace. Nous utilisons 20 pi (10-15 fois le volume total du dispositif) de collagène par couche par appareil.
2. Êtreégrenage avec le (polycationique) solution méthylé, suppléant rinçage des appareils avec 20 pi de méthyle et puis succinylée solutions de collagène, en attendant 1 min entre chaque application. Rincer le dispositif un total de 10 fois par la solution, ce qui devrait prendre environ 20 min. Travaillez rapidement pour minimiser la quantité de temps les cellules sont sans médias.
3. Observez collagène accumuler lentement à l'entrée / sortie en fonction de sa taille. Si la résistance à l'écoulement fluide augmente, rincer l'appareil une ou deux fois avec les médias, et puis continuer stratification.
4. Après l'application de toutes les couches, rincer l'appareil deux fois avec un milieu frais et de revenir à l'incubateur. Selon le type cellulaire, les changements morphologiques induits par la matrice extracellulaire, tels que renforcement de polarisation dans les hépatocytes, doivent être visibles au bout de quelques heures.
5. Préparer dispositifs représentatifs des types de microscopie électronique à transmission en utilisant des procédés ^standard de 9 pour vérifier la présence d'une matrice de collagèneassemblage au-dessus des cellules cultivées.

7. Stabilisation de phénotype cellulaire et fonction

1. L'image de la morphologie cellulaire, la viabilité et la polarité en utilisant des procédés standard pour le type de cellule. Pour les hépatocytes, recueillir des images de plus de 14 jours en utilisant la microscopie de phase, coloration, LIVE / DEAD pour la viabilité, et CMFDA colorant pour la polarisation apicale de démontrer les effets des dépôts de collagène.
2. Pour la morphologie des cellules, rincer l'appareil à travers l'entrée à la pipette avec 20 pi de PBS pour rincer, injecter 20 pi de PBS, et l'image du dispositif utilisant microscope à contraste de phase.
3. Pour la coloration, LIVE / DEAD, rincer l'appareil à travers l'entrée à la pipette avec 20 pi de PBS à rincer, injecter 20 pi de solution de coloration, LIVE / DEAD avec DAPI préparés en suivant les instructions du fabricant, incuber pendant 30 min à 37 ° C, rincer le Dispositif de nouveau avec 20 pi de PBS, et l'image du dispositif utilisant la microscopie à fluorescence.
4. Pour la bile Canalicoloration Culi, rincer l'appareil à travers l'entrée à la pipette avec 20 pi de PBS pour rincer, injecter 20 pi de 2 solution de coloration uM CMFDA avec DAPI, préparées conformément aux instructions du fabricant, incuber pendant 30 min à 37 ° C, rincer l'appareil de nouveau avec 20 ul de PBS, et l'image de l'appareil en utilisant la microscopie de fluorescence.
5. Recueillir les milieux épuisés et mesurer les produits métaboliques cellulaires à des points de temps appropriés pendant la durée de la culture afin de déterminer la fonction des cellules. Pour les hépatocytes, de mesurer la quantité d'albumine et de l'urée dans les milieux épuisés.
6. Effectuer des analyses fonctionnelles de point final sur les cellules elles-mêmes, comme l'évaluation des niveaux d'enzymes d'activité, la coloration des anticorps, ou l'analyse de l'ARN. Pour les hépatocytes, induire et mesurer les activités enzymatiques du cytochrome P450 ou la phase II conjugaison enzyme glutathion-S-transférase.

Résultats

Le collagène natif peut être modifié en utilisant la méthylation et succinylation pour créer des solutions de collagène polycationiques et polyanioniques pour une utilisation dans le dépôt couche par couche. Succinylation modifie les groupes de collagène natif e-amino avec des groupes succinyle, et la méthylation modifie les groupes carboxyle du collagène natif avec un groupe méthyle (figure 1A). Ces modifications de la protéine de collagène chaînes latérales d'acides aminés modifie...

Discussion

Ultraminces ensembles de collagène pur peuvent être déposés sur les cellules chargées ou des surfaces de matériaux à l'aide de dépôt couche par couche de collagènes modifiés. Les résultats de cette étude démontrent que la méthylation et succinylation de collagène natif créer des solutions de collagène polycationiques et polyanioniques (figure 1) qui peut être utilisé avec la technique couche par couche à déposer les assemblages de matrice de collagène ultra-minces sur des cell...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
collagen type I, rat tail	Life Technologies	A1048301	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	Sigma-Aldrich	C3867-1VL	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	EMD Millipore	08-115	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	R%D Systems	3440-100-01	option for concentrated rat tail collagen
succinic anhydride	Sigma-Aldrich	239690-50G	succinylation reagent
anhydrous methanol	Sigma-Aldrich	322415-100ML	methylation reagent
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881-500G	pH precipitation reagent
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	320331-500ML	pH precipitation reagent
rat collagen type I ELISA	Chondrex	6013	option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit	Sigma-Aldrich	MAK008-1KT	option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit	Quickzyme Biosciences	QZBtotcol1	option for detecting collagen content