Слой за слоем Коллаген осаждения в микрофлюидных Устройства для стабилизации Microtissue

Резюме

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Аннотация

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

Введение

Although microfluidics allows for the exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells, especially primary cells, within microfluidic devices can be challenging. Many traditional cell culture techniques have been developed to sustain and stabilize cell function when cultured in tissue culture plates, but translating those techniques to microfluidic devices is often difficult.

One such technique is the culture of cells on or sandwiched between collagen gels as a model of the physiological 3D cell environment.¹ Type I collagen is one of the most frequently used proteins for biomaterials applications because of its ubiquity in extracellular matrix, natural abundance, robust cell attachment sites, and biocompatibility.² Many cells benefit from 3D culture with collagen, including cancer cells^3,45, microvascular endothelial cells⁶, and hepatocytes⁷, among others. While the use of collagen gels is easy in open formats, such as tissue culture plates, the limited channel dimensions and enclosed nature of microfluidic devices makes the use of liquids that gel impractical without blocking the entire channel.

To overcome this problem, we combined the layer-by-layer deposition technique⁸ with chemical modifications of native collagen solutions to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These layers can stabilize cell morphology and function similar to collagen gels and can be deposited on cells in microfluidic devices without blocking the channels with polymerized matrix. The goal of this method is to modify native collagen to create polycationic and polyanionic collagen solutions and to stabilize cells in microfluidic culture by depositing thin collagen matrix assemblies onto the cells. This technique has been used to stabilize the morphology and function of primary hepatocytes in microfluidic devices.⁹

Although layer-by-layer deposition has previously been reported with natural and synthetic polyelectrolytes¹⁰ to cover hepatocytes in plate culture^11,12 and as a seeding layer for hepatocytes in microfluidic devices^13,14, this method describes the deposition of a pure collagen layer on top of hepatocytes, mimicking the 3D collagen culture techniques. In this protocol, we use hepatocytes as example cells that can be maintained using 3D collagen layers. The many other types of cells that benefit from 3D culture in collagen may similarly benefit from culture after layer-by-layer deposition of an ultrathin collagen matrix assembly.

протокол

1. Приготовление раствора Родной растворимый коллаген

1. Подготовка или приобрести 200 мг подкисленной, растворимого типа, коллагена из хвостов крыс на 1-3 мг / мл с использованием стандартных протоколов выделения, как сообщает Piez др. ¹⁵
2. Шкала количество исходного материала на основе желаемого конечного объема модифицированных растворов коллагена. Приблизительно 25-30 мл сделать метилированных и 25-30 мл сукцинилированных решений коллаген, каждый по 3 мг / мл, от 200 мг растворимого нативного коллагена.

2. Коллаген Метилирование

1. Развести 100 мг нативного, подкисленной (рН 2-3) раствора коллагена в концентрации 0,5 мг / мл ледяной стерильной воде и держать на льду раствор, чтобы предотвратить гелеобразование.
2. Доводят рН раствора коллагена 9-10 с несколькими каплями 1 N NaOH и перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Соблюдайте коллагена осадок, в результате чего решение стать облачно.
3. Спин вниз осажденного раствора коллагена при 3000 г в течение 25 мин. Четкое гелеобразный осадок должен быть виден в нижней части трубы. Аспирируйте и надлежащим образом распоряжаться надосадочной жидкости.
4. Ресуспендируют осажденного коллагена в 200 мл метанола с 0,1 N HCl и оставляют реакционную метилирование происходить при перемешивании при комнатной температуре в течение 4 дней. Коллаген не растворяются, но должны распадаться на мелкие кусочки, которые видны сделают решение облачность.
5. После метилирования, центрифуги раствор при 3000 х г в течение 25 мин для осаждения метилированный коллаген. Аспирируйте и распоряжаться подкисленный метанол супернатанта.
6. Растворить метилированный коллаген в 25 мл стерильной PBS в, давая концентрации приблизительно 3 мг / мл, с повторным пипетированием и фильтруют раствор через клеточный фильтр 60 мкм. Доводят рН раствора до 7,3-7,4 с помощью 20 мкл с шагом в 1 N NaOH.
7. Оценить concentratioн раствора с использованием коммерческих крыса коллагена ELISA набор или набор гидроксипролина анализа. Развести решение 3 мг / мл стерильного PBS с.
8. Стерилизацию метилированный решение коллагена путем передачи его в стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой, тщательно отводками 3 мл хлороформа в нижней части бутылки, позволяют бутылка для установки O / N при 4 ° С, а затем асептически удалить и хранить Верхний слой, который является метилированный коллаген.
9. Хранить раствор при 4 ° С для использования в течение 1 месяца.

3. Коллаген Сукцинилирование

1. Развести другой 100 мг нативного, подкисленной (рН 2-3) раствора коллагена в концентрации 0,5 мг / мл ледяной стерильной воде и держать на льду раствор, чтобы предотвратить гелеобразование.
2. Доводят рН раствора коллагена 9-10 с несколькими каплями 1 N NaOH и перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Коллаген должны ускорить, в результате чего решение стать облачно.
3. Растворите 40 мг SucCinic ангидрид (0,4 мг на мг коллагена) в 10 мл ацетона ^(1/20 объема раствора коллагена). Медленно (приблизительно 0,5 мл шагом) добавить эту смесь к раствора коллагена при перемешивании при непрерывном мониторинге рН. Поддержание рН выше 9,0, добавляя 1 или 2 капли 1 N NaOH, как рН 9,0 подходы.
4. Продолжить перемешивание при комнатной температуре в течение 120 мин после добавления всех нтарного ангидрида в ацетоне. Соблюдайте решение стать ясно, как сукцинилированный коллагена растворяется. Периодически проверяйте, чтобы обеспечить рН остается выше 9,0.
5. Доводят рН раствора до 4,0 с помощью 20 мкл с шагом 1 N HCl. Соблюдайте решение облачно снова, как сукцинилированный коллагена осаждается.
6. После сукцинилированием, центрифуги решение в 3000 × г в течение 25 мин для осаждения сукцинилированных коллагена. Аспирируйте и распоряжаться подкисленной супернатанта непрореагировавшего ангидрида янтарной кислоты.
7. Растворите сукцинилированных коллагенав 25 мл стерильной PBS, дающих концентрации приблизительно 3 мг / мл, при повторном пипеткой, и фильтрации раствора через ячейки сетчатого фильтра 60 мкм. Доводят рН раствора до 7,3-7,4 с помощью 20 мкл с шагом в 1 N NaOH.
8. Оценка концентрации раствора с использованием коммерческого коллагена крысы ELISA набор или набор для анализа гидроксипролина. Развести решение 3 мг / мл стерильного PBS с.
9. Стерилизацию сукцинилированных решение коллагена путем передачи его в стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой, тщательно отводками 3 мл хлороформа в нижней части бутылки, позволяют бутылка для установки O / N при 4 ° С, а затем асептически удалить и хранить Верхний слой, который является сукцинилированный коллагена.
10. Хранить раствор при 4 ° С для использования в течение 1 месяца.

4. Проверка коллагена Изменения

1. Подготовка 1 мл пробы из каждой из нативных, метилированных и сукцинилированных решений коллагеновых и разбавить до концentration 0,1 мг / мл стерильной воды для чистого водорода титрованием ионов. Далее разбавить буфер, по крайней мере 1000-кратного диализом против воды через 10 кДа отсечки membraneusing 3 раствора изменяется по крайней мере 4 ч каждой.
2. Отрегулируйте рН растворов до 7,3 с небольшими количествами NaOH и HCl. Использование рН 7,3 в качестве произвольного ссылке, выполнить ионов водорода титрованием на каждом из образцов, как описано Танфорду ¹⁶ для создания кривых титрования для нативных, метилированных и сукцинилированных решений коллагена.
3. Участок изменения рН на единицу объема добавленной кислоты по сравнению с количеством связанного ^ионов Н + на молекулу. Высокий уровень рН "амино" диапазон должен показать сдвиг в сукцинилированного коллагена к нейтральной точке (потеря аминогрупп) и низким рН "карбоксильной" диапазон должен показать левый поворот метилированного коллагена (потерю карбоксильных групп ) и сдвиг вправо в сукцинилированного коллагена (прирост в карбоксильной группес), по сравнению с нативного коллагена.
4. Оценка эффективности реакции сукцинилирования путем определения% аминогрупп в нативного коллагена заменен сукцинилирования использованием 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBA) колориметрическим методом, в соответствии со стандартными протоколами ^17,18.

5. Изготовление микрофлюидных устройств и сотовых Раздают

1. Изготовить микрожидкостных устройств, используя стандартные методы ^9. Используйте реплики формования PDMS от SU-8 мастеров на кремнии, определенной с помощью фотолитографии для создания микрожидкостных клеточной культуры камеры с 100 мкм в высоту, ширину 0.4-1.5 мм, 1-10 мм и длиной каналов для роста клеток.
2. Используйте чистящее средство в плазме для окисления поверхности устройства и стекло, а затем нажмите вместе, чтобы связью. После стерилизации устройства под воздействием УФ света в течение не менее 30 мин, заполнить камеру с 50 мкг / мл фибронектина в стерильной PBS и инкубируют при 37 ° С в течение 45 мин.
3. Семенной устройство с клетками, такими как первичный крысы или человека гепатоцитов, которые требуют коллагена гель для стабилизации фенотипа или состояния дифференцировки. Мы используем 20 мкл свежевыделенных первичной гепатоцитов крысы ^7,19 или коммерчески доступных криоконсервированных гепатоцитов первичных человеческих высевают в 14 × 10 ⁶ клеток / мл в устройстве.
4. Разрешить клетки приложить на 4-6 часа, а затем промыть одиноких клетки и заменить обшивки СМИ с ростом массовой информации. Выдержите O / N, чтобы обеспечить полное ячейку распространения и создать сливающийся монослой клеток.

6. Слой за слоем Коллаген осаждения

1. В ламинарном потоке капот культуры ткани, готовят достаточных объемов метилированных и сукцинилированных коллагеновых растворов в течение 10 приложений каждого раствора на устройстве, а также несколько миллилитров сред. Держите решения на льду. Мы используем 20 мкл (в 10-15 раз общий объем устройства) коллагена в слое на устройство.
2. Бытьхлопкоочистительное с метилированной (поликатионной) раствор, альтернативный промывки устройства 20 мкл метилированных и затем сукцинилированный растворов коллагена, ожидая 1 мин между каждым приложением. Промойте устройству в общей сложности 10 раз в растворе, который должен занять около 20 минут. Работают быстро, чтобы свести к минимуму количество времени, клетки без средств массовой информации.
3. Заметим, коллаген медленно накапливаются на входе / выходе в зависимости от его размера. Если сопротивление возрастает потока жидкости, промойте устройство один или два раза со средствами массовой информации, а затем продолжить наслоение.
4. После нанесения всех слоев, промыть устройство в два раза свежей средой и вернуться в инкубатор. В зависимости от типа клеток, внеклеточный матрикс-индуцированных морфологических изменений, таких как повышенной поляризации в гепатоцитах, должны быть видны в течение нескольких часов.
5. Подготовка репрезентативных устройства для электронной микроскопии с использованием стандартных методов ^{9 до} проверки присутствия коллагеновой матрицеУзел сверху культивируемых клеток.

7. Стабилизация клеточной фенотипа и функции

1. Изображение морфология клеток, жизнеспособность, и полярность с помощью стандартных методов типа клеток. Для гепатоцитов, собирать изображения в течение 14 дней, используя фазового микроскопа, LIVE / DEAD для окрашивания жизнеспособность и CMFDA краситель для апикальной поляризации, чтобы продемонстрировать последствия отложения коллагена.
2. Для морфологии клеток, промойте устройство через входное отверстие с помощью пипетки 20 мкл PBS, чтобы ополоснуть, вводят 20 мкл PBS, и изображение устройства с помощью фазово-контрастной микроскопии.
3. Для получения немедленной / DEAD окрашивания, промыть устройство через входное отверстие пипеткой с 20 мкл PBS, чтобы смыть, инъекционные 20 мкл LIVE / DEAD красящим раствором с DAPI подготовлен в соответствии с инструкциями изготовителя, инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С, промыть Устройство снова 20 мкл PBS, и изображение устройства с помощью флуоресцентной микроскопии.
4. Для желчных CanaliCuLi окрашивание, промойте устройство через входное отверстие с помощью пипетки 20 мкл PBS, чтобы ополоснуть, вводят 20 мкл 2 мкМ CMFDA красящим раствором с DAPI подготовлен в соответствии с инструкциями изготовителя, инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С, промыть устройство снова 20 мкл PBS, и изображение устройства с помощью флуоресцентной микроскопии.
5. Сбор отработанных массовой информации и измерения клеточных метаболических продуктов на соответствующих временных точках в течение срока культуры для определения функции клеток. Для гепатоцитов, измеряют количество альбумина и мочевины в истощенных средах.
6. Выполнение конечных функциональных анализов на самих клеток, таких как оценки уровней активности фермента, окрашивание антителом или анализа РНК. Для гепатоцитов, вызывают и измерить цитохрома Р450 деятельности или фазы II спряжения фермент глутатион S-трансферазы.

Результаты

Родной коллаген может быть изменен с помощью метилирования и Сукцинилирование создать поликатионные и полианионные коллагеновые решения для использования в слой за слоем осаждения. Сукцинилирование модифицирует Е-аминогрупп нативного коллагена с сукцинил групп, и метилирование из?...

Обсуждение

Ультратонкие чистый коллаген сборки могут быть нанесены на заряженных клеток или материальных поверхностей с использованием слой за слоем отложение модифицированных коллагенов. Результаты этого исследования показывают, что метилирование и Сукцинилирование из нативного коллагена ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
collagen type I, rat tail	Life Technologies	A1048301	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	Sigma-Aldrich	C3867-1VL	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	EMD Millipore	08-115	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	R%D Systems	3440-100-01	option for concentrated rat tail collagen
succinic anhydride	Sigma-Aldrich	239690-50G	succinylation reagent
anhydrous methanol	Sigma-Aldrich	322415-100ML	methylation reagent
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881-500G	pH precipitation reagent
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	320331-500ML	pH precipitation reagent
rat collagen type I ELISA	Chondrex	6013	option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit	Sigma-Aldrich	MAK008-1KT	option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit	Quickzyme Biosciences	QZBtotcol1	option for detecting collagen content