הכנת הברים מועשר מיטוכונדריאלי לניתוח חילוף חומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em

Summary

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Abstract

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions.

Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Introduction

המטרה של הליך זה היא לפתח שברים המיטוכונדריה מועשרות שיניבו מספיק מטבוליטים המיטוכונדריה ללימודי metabolomics באמצעות melanogaster תסיסנית. מניסיוננו, metabolomics ניתוח תוך שימוש בשיטות מיצוי סלולארי כל אינם מסוגלים לזהות שינויי המטבוליט המיטוכונדריה עדינים בדרוזופילה. עם זאת, fractioning המיטוכונדריה לפני ניתוח metabolomics מגביר את הרגישות לזהות משמרות המטבוליט המיטוכונדריה.

המיטוכונדריה הם אברונים תאיים אחראים על מתן 90% מהאנרגיה שתאים צריכים לתפקוד נורמלי ^1. בשנים האחרונות זה כבר הכיר בכך שהמיטוכונדריה לשחק הרבה יותר דינמי תפקיד בתפקוד תאי והאורגניזם מאשר רק ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP), וכעת הם מוכרים כרכזות להסדרת ^2,3 הומאוסטזיס חילוף חומרים. המיטוכונדריה הוא התוצאה של תהליך שבו endosymbiotic דיסשושלות חיידקי tinct התמזגו ~ לפני 1.5 מיליארדים שנים ^4. כמיטוכונדריה התפתחה לאברונים אמיתיים, גנים מאנדוסימביוזה שולבו בגנום הגרעיני המתפתח. בבעלי חיים היום, כ -1,500 חלבוני המיטוכונדריה הם בקידוד גרעיניים תוך 37 גנים להישאר בmtDNA, 13 מהם לקודד חלבוני המיטוכונדריה שהם תת-יחידות של מתחמי האנזים של זרחון חמצוני ^5. יש צורך בתיאום בין המיטוכונדריה ותאים גרעיניים כדי לשמור על תפקוד המיטוכונדריה נכון.

שימוש בשיטות שתוארו כאן היינו מסוגל לזהות שינויים מטבוליים המיטוכונדריה בתסיסנית הנובעים ממניפולציה של התיאום בין הגנום המיטוכונדריאלי והגרעיני. אנחנו השתמשנו בזן של דרוזופילה בי mtDNA ממיני אחותה ד simulans הונח על ד בודד melanogaster רקע גרעיני ^6. mitonuclear 'שיבש' זהגנוטיפ הושווה לגנוטיפ mitonuclear 'הילידים', או-התפתח שיתוף של ד melanogaster נושא את אותו הגנום גרעיני עם ד המקורי שלו melanogaster mtDNA. ד melanogaster וד ' simulans mtDNAs שונה על ידי ~ 100 חומצות אמינו ו> 500 החלפות נרדפים המשפיעות ^7,8 תקשורת mitonuclear. אנחנו שנוצרנו תמציות לטוס כל ותמציות מועשרות המיטוכונדריה ללמוד משמרות המטבוליט בתגובה ללחץ תרופתי. כאן אנו מראים כי בעת שימוש שבברי המיטוכונדריה המועשרת לזהות שינויים בולטים במטבוליטים המיטוכונדריה בין גנוטיפ נשא ד הילידים, התפתח-שיתוף mtDNAs melanogaster וגנוטיפ שיבש נשא ד simulans mtDNA. לעומת זאת, שינויי המטבוליט בין שני גנוטיפים אלה הם עדינים תוך שימוש בשיטות רגילות לנצל תמצית לטוס כולה. לכן, שיטה זו סיפקה דרך להבין כיצד mtDNAs לתווך שינויי המיטוכונדריה בתגובה לתרופות שונות.

Protocol

1. ריאגנטים ופתרונות

1. הכנת מזון זבוב ותקשורת
   1. מרכיבים לטוס חום סוכר 11%, 2% שמרי autolyzed, קמח תירס 5.2%, אגר 0.79% w / v במים בפלטה חשמלית נקבעה על 90 מעלות צלזיוס. מערבבים באופן קבוע עד לקבלת תערובת הומוגנית מעט צפופה מתקבלת. הכן נפח סופי של 550 מיליליטר של אוכל לטוס לסך של 5 עם 100 בקבוקוני מ"ל לטוס מזון בכל.
   2. מוציאים ממקור החימום, מערבבים מדי פעם עד שהאוכל מתקרר עד 80 מעלות צלזיוס ומוסיף 0.2% tegosept-מתיל 4 hydroxybenzoate-מומס באתנול 95%.
   3. לפצל את האוכל בשני כרכים שווים. להוסיף 1.1 מיליליטר של 50 מ"מ Rapamycin מומס באתנול לכרך אחד ו1.1 מיליליטר של אתנול להיקף האחר. מערבבים את rapamycin ופתרוני אתנול למזון. הקפד שהטמפרטורה יורדת ל -50 מעלות צלזיוס לפני הוספת תרופות.
2. בידוד מאגר
   1. הכן 500 מיליליטר של בידוד הצפת [225 מ"מ מניטול, 75 מ"מ סוכרוז, 10 מ"מ 3 (N </ Em> -morpholino) חומצת propanesulfonic (מגבים) וחומצת 1 מ"מ ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 2.5 מ"ג / מיליליטר אלבומין בסרום שור (BSA)] במים.
   2. התאם את ה- pH 7.2 באמצעות נתרן הידרוקסידי. PH הראשוני יהיה חומצי.
   3. להשתמש בבקבוקי אחסון סינון סטרילי עם גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר לעקר פתרון ולאחסן אותו על 4 מעלות צלזיוס.
3. הצפת לשטוף
   1. הכן 500 מיליליטר של חיץ לשטוף [225 מ"מ מניטול, 75 מ"מ סוכרוז, 10 מ"מ KCl, 10 מ"מ טריס HCl ו -5 מ"מ KH PO _{2 4]} במים.
   2. התאם את ה- pH 7.2 באמצעות נתרן הידרוקסידי. PH הראשוני יהיה חומצי.
   3. להשתמש בבקבוקי אחסון סינון סטרילי עם גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר לעקר פתרון ולאחסן אותו על 4 מעלות צלזיוס.

2. גידול של זני דרוזופילה

1. כדי לשלוט בצפיפות זחל במהלך פיתוח, מקום 25 זוגות של הורים לבקבוק תרבות ולאפשר להם להטיל ביצים במשך 48 שעות.
2. הסרת הורים לאחר 48 שעות להסדיר צפיפות ביצה.
3. חזור על שלבים 2.1 ו -2.2 שימוש בצאצאי F1 מתעוררים, כך שני דורות של שליטה בצפיפות זו מושגת.
4. לאסוף מבוגרים, להרדים את הזבובים באמצעות פחמן דו חמצני (CO ₂₎ ונפרדים לפי מין.
   1. השתמש ברגולטור שלב אחד לCO הטהור נמסר ₂ מטנק גבוה בלחץ בזרימה רציפה של 5 psi. כדי למנוע חשמל סטטי, להשתמש צינורות פלסטיק לזרז CO ₂ לסינון בקבוק 500 מיליליטר עם מים.
   2. השתמש בפקק גומי עם חור אחד לאטום את הבקבוק. השתמש בצינורות פלסטיק כדי לחבר את הצמצם לרוחב של הבקבוק לכרית CO _2.
   3. מניחים את הזבובים בפנקס ללא יותר מ 10-15 דקות. לאפשר להתאושש מהרדמה למשך 24 שעות לפני הצבתם בתנאי ניסוי.
5. כדי ליצור מספיק מטבוליטים לשברים מועשר במיטוכונדריה, להשתמש 300 זבובים לדגימה. הנה, להשתמש נקבות, אבל עדיןr עשוי להיות שונה בניסויים אחרים. העבר את 150 זבובים לכלוב דמוגרפיה 1 ליטר תוצרת בית. לאפשר גישה ל5 מיליליטר של אוכל לטוס בבקבוקון.
6. העבר את 150 הזבובים שנותר לעוד כלוב 1 ליטר. אל overpopulate כלובים עם יותר מ -150 זבובים.
7. השתמש בשש דגימות לשכפל לתנאי ניסוי. מאז תמציות בעלי חיים שלמות להניב יותר מטבוליטים, כדי ליצור מדגם 1 של כל בעלי החיים מבודד, להעביר 50 נקבה עפה לכלוב אחד. באשר למבודד במיטוכונדריה, להשתמש שש דגימות לשכפל לתנאי ניסוי.
8. כלובי מקום במהירות של 25 מעלות צלזיוס עם מחזור של 12 שעות אור וחושך 12 שעות.
9. לספק מזון טרי כל 2 או 3 ימים בבקבוקון עם 5 מיליליטר של מזון כדי לשמור על איכות מזון.
10. לשמור על זבובים על מזון במשך 10 ימים. צעד זה נחוץ לטיפול rapamycin ^7. טיפולים או מצבים אחרים יהיו שונים.

3. בידוד של שברי מיטוכונדריאלי

1. מזבלה עפה מכלוב אחד (150 זבובים) לhomogenizer dounce זכוכית טפלון מלא 1 מיליליטר של חיץ בידוד מצונן.
2. Homogenize ידי הזזת העלי למעלה ולמטה במשך 15 משיכות. שמור מרגמה על קרח כדי לשמור על שלמות מיטוכונדריה.
3. ההעברה homogenate לצינור 1.5 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
4. קח את supernatant ו צנטריפוגות ב6,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להעשיר למיטוכונדריה.
5. כsupernatant מכיל חלק cytosolic, לבטל את supernatant או להשתמש בו לניסויים חלופיים. Resuspend גלולה ב300 μl של חיץ לשטוף.
6. חזור על שלבים 3.1-3.5 לכלוב השני. מערבבים את כדורי resuspended של שני הכלובים בצינור microcentrifuge קריוגני.
7. צנטריפוגה ב 6000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
8. בטל supernatant ופלאש להקפיא את גלולה בחנקן נוזלי.
9. אחסן את השברים המועשר המיטוכונדריה ב -80 ° C או בטמפרטורה נמוכה יותר.
   1. לחלופין, לבעלי חיים שלפני כלparation, למקם את המבוגרים בצינור microcentrifuge קריוגני. פלאש-להקפיא את הבקבוקון במבוגרים חנקן נוזלים חנות ב -80 ° C או בטמפרטורה נמוכה יותר.

תוצאות

שימוש בפרוטוקול שהוסבר לעיל, ביצענו ניתוח metabolomic על שברים מועשרות המיטוכונדריה ותמציות בעלי חיים שלמות כדי לבדוק את ההשפעה של התרופה על Rapamycin mtDNAs מסתעף ^7. אנו נמסרו 200 מיקרומטר של rapamycin ידי המסת התרופה במזון הזבוב. זבובים נחשפו לRapamycin במשך 10 י?...

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הם: 1) גידול מספיק זבובים בחלל בשפע. זה מאוד חשוב שלא לגרום להתפוצצות אוכלוסין כלובי דמוגרפיה עם יותר מ -150 זבובים כל אחד; 2) שינוי המזון של הכלובים לעתים קרובות כדי למנוע תחרות מזון ומתח תזונתי; ו 3) שמירה על כל הדגימות ב 4 ° C כדי להבטיח א...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate	VWR	AAA14289
Ethanol	Sigma-Aldrich	792799
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Sigma-Aldrich	M1254
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	38057
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	5470
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Tris HCl	Sigma-Aldrich	RES3098T-B7
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1551139
CO2 pads to anesthetize flies	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
1 L cage	Web Restaurant Store	999RD32
1 L cage lid	Web Restaurant Store	999LRD
a glass-teflon dounce homogenizer	Fisher Scientific	NC9661231
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
rapamycin	LC Laboratories	R-5000
anti-porin	MitoSciences	MSA03
anti-alpha tubulin	Developmental Studies Hybridoma Bank	12G10
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
CO2 pad	Tritech Research, Inc	MINJ-DROS-FP
filter flask	enasco	SB08184M
rubber stopper	enasco	S08512M