Metabolik Analiz Mitokondriyal Zenginleştirilmiş Kesirler Hazırlanması<em&gt; Drosophila</em

Özet

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Özet

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions.

Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Giriş

Bu prosedürün amacı, Drosophila melanogaster'in kullanılmasının metabolomiks çalışmalar için yeterli mitokondriyal metabolitleri elde zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyonlar geliştirmektir. Bizim tecrübelerimize göre, tüm hücresel çıkarma yöntemlerini kullanarak metabolomik analiz Drosophila ince mitokondriyal metabolit değişikliklerini tespit edemiyoruz. Ancak önceki metabolomik analiz mitokondriyal fraksiyon mitokondriyal metabolit vardiya tanımlamak için hassasiyetini artırır.

Mitokondri hücreleri normal fonksiyon ¹ için gereken enerjinin% 90 sağlanmasından sorumlu hücresel organellerdir. Son yıllarda bu mitokondrinin sadece adenozin trifosfat (ATP) üretmek daha hücresel ve organizma işlevi çok daha dinamik bir rol oynayabilir ve şimdi metabolik homeostazı ^2,3 düzenlenmesi için hub olarak tanınan kabul edilmiştir. Mitokondri dis olan bir endosimbiyotik işleminin sonucudurTinct mikrobik soy 1,5 milyar yıl önce ⁴ ~ birleşti. Mitokondri gerçek organellere haline gibi, endosymbiont gelen genler ortaya çıkan nükleer genomu dahil edildi. 37 gen oksidatif fosforilasyon ⁵ enzim komplekslerinin alt birimleri olan mitokondriyal proteinleri kodlayan 13 olan mtDNA, kalırken hayvanlarda bugün yaklaşık 1.500 mitokondriyal proteinlerin, nükleer kodlanmış bulunmaktadır. Mitokondri ve nükleer bölmeleri arasında koordinasyon düzgün mitokondriyal fonksiyonunu korumak için gereklidir.

Burada açıklanan yöntemleri kullanarak mitokondriyal ve nükleer genomlarındaki arasındaki koordinasyon manipülasyon sonucu Drosophila mitokondriyal metabolik değişiklikleri tespit etmek mümkün. Biz hangi mtDNA D. kardeş türünden Drosophila bir yük kullanılan simulans tek D. yerleştirildi Nükleer arka plan ⁶ melanogaster. Bu "kesintiye 'mitonuclearGenotip D. 'doğal', ya da ko-evrimleşmiş mitonuclear genotip ile karşılaştırılmıştır kendi doğal D. ile aynı nükleer genomu taşıyan melanogaster mtDNA melanogaster. D. melanogaster ve D simulans mtDNAs 100 ~ tarafından amino asitler ve mitonuclear iletişim ^7,8 etkileyen> 500 eşanlamlı değiştirmelerin farklıdır. Biz farmakolojik strese yanıt olarak metabolit vardiya çalışmak için tüm sinek özleri ve mitokondriyal zenginleştirilmiş özleri üretti. Burada mitokondrial zenginleştirilmiş kesirler kullanırken biz D. taşıyan yerli, eş-evrim genotip arasındaki mitokondriyal metabolitleri belirgin değişimler tespit olduğunu göstermektedir melanogaster mtDNAs ve D. taşıyan kesintiye genotip simulans mtDNA. Buna karşılık, bu iki genotipleri arasındaki metabolit değişiklikleri tüm sinek özü kullanan, normal yöntemlerle ince olur. Bu nedenle, bu yöntem mtDNAs mitokondriyal değişiklikler arabuluculuk nasıl anlamak için bir yol sağladıFarklı ilaçlara yanıt.

Protokol

1. Reaktifler ve Çözümleri

1. Sinek gıda ve medya hazırlanması
   1. Isı uçucu bileşenler 90 ° C 'ye ayarlanmış bir ocak su içinde ağırlık / hacim olarak% 0.79 agar% 11 şeker,% 2 otolize uğramış mayası,% 5.2 mısır unu. Homojen biraz yoğun karışım elde edilinceye kadar düzenli olarak karıştırın. Her bir yiyecek kalkan 5 ml ile 100 şişelerde bir toplam uçucu gıda 550 ml'lik bir nihai hacim hazırlayın.
   2. Isıtma cihazından çıkar Gıda aşağı 80 ° C'ye gelene kadar zaman karışması ve% 95 etanol,% 0.2 tegosept-metil 4-hidroksibenzoat ekleyin.
   3. Iki eşit hacimlerde gıda bölün. Diğer hacim etanol, 50 mM bir hacme kadar etanol rapamisinin 1,1 ml 1,1 ml ilave edilir. Rapamisini ve gıda içine etanol çözümleri karıştırın. Sıcaklık ilaçlar eklemeden önce 50 ° C'ye düşer emin olun.
2. İzolasyon Tampon
   1. İzolasyon Tamponu [225 mM Mannitol, 75 mM sakaroz, 10 mM 3- (N <500 ml hazırlayın/ em> morfolino) propansülfonik asit (MOPS) ve 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 2.5 mg / ml sığır serumu albümini (BSA)] su içinde.
   2. Sodyum hidroksit kullanarak pH'ı 7.2'ye ayarlayın. Başlangıç ​​pH'ı asidik olacaktır.
   3. Solüsyonu sterilize etmek ve 4 ° C de saklamak için 0.22 um gözenek boyutuna sahip olan steril filtre depolama şişeler kullanın.
3. Yıkama Tamponu
   1. Yıkama tampon maddesi [225 mM Mannitol, 75 mM sakaroz, 10 mM KCI, 10 mM Tris HCI ve 5 mM KH ₂ PO _4] su içinde 500 ml hazırlayın.
   2. Sodyum hidroksit kullanarak pH'ı 7.2'ye ayarlayın. Başlangıç ​​pH'ı asidik olacaktır.
   3. Solüsyonu sterilize etmek ve 4 ° C de saklamak için 0.22 um gözenek boyutuna sahip olan steril filtre depolama şişeler kullanın.

Drosophila SUŞLARINDA 2. Yetiştirme

1. , Gelişim sırasında larva yoğunluğu kontrol bir kültür şişe ebeveynlerin 25 çift yerleştirmek ve onları 48 saat boyunca yumurtalarını bırakmak için izin vermek için.
2. Yumurta yoğunluğunu düzenlemek için 48 saat sonra anne çıkarın.
3. Yineleyin ortaya çıkan F1 yavru kullanarak 2.1 ve 2.2 adımları, bu nedenle bu yoğunluk kontrolü iki kuşak elde edilir.
4. Yetişkin toplamak için, karbondioksit _(CO2) ve cinsiyete göre ayrı kullanarak sinekler uyutmak.
   1. 5 psi sürekli bir akış bir yüksek basınçlı tanktan teslim saf _CO 2 tek aşamalı regülatör kullanın. Statik elektriği önlemek için, su ile balonun filtreleme 500 ml CO ₂ katalize etmek için plastik boru kullanılır.
   2. Şişeyi kapatmak için tek delikle bir lastik tıpa kullanın. _CO2 pede şişenin yanal açıklığı bağlamak için plastik boru kullanın.
   3. 10-15 dk daha fazlası için ped sinek yerleştirin. Deneysel koşullar koymadan önce 24 saat anestezi kurtarmak için izin verin.
5. Mitokondriyal zenginleştirilmiş kesirler için yeterli metabolitleri oluşturmak numune başına 300 sinekler kullanın. Burada, kadın kullanın, ancak gender, diğer deneylerde farklı olabilir. Bir ev yapımı 1 L demografi kafesine 150 sinekler aktarın. Bir şişe içinde uçucu gıda 5 ml erişimine izin verir.
6. Başka bir 1 L kafesine geri kalan 150 sinekler aktarın. 150'den fazla sinekler kafeslere overpopulate etmeyin.
7. Deneysel koşul başına altı çoğaltma örnekleri kullanın. Bütün hayvan ekstreleri fazla metabolitleri verim yana, bütün hayvan 1 örnek izolatlarının oluşturmak 50 kadın, bir kafes uçar aktarmak için. Mitokondriyal izolatların gelince, deneysel koşul başına altı çoğaltma örnekleri kullanın.
8. 12 saat ışık ve 12 saat karanlık çevrimi ile 25 ° C 'de yer kafesleri.
9. Gıda kalitesini korumak için gıda 5 ml bir şişe içinde her 2 ya da 3 gün taze yiyecek sağlamak.
10. 10 gün boyunca gıda sinekler koruyun. Bu adım, rapamisin tedavisi ⁷ için gereklidir. Diğer tedaviler veya şartlar farklı olacaktır.

Mitokondriyal Kesirler 3. İzolasyonu

1. Damperli bir içine bir kafes (150 sinekler) çıkışlı uçarCam-Teflon Dounce homojenleştirici soğutulmuş yalıtım 1 ml tampon ile doldurulmuştur.
2. Aşağı 15 vuruş için havaneli yukarı ve hareket ettirerek homojenleştirin. Sağlam mitokondri tutmak için buz üzerinde harç tutmak.
3. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de, 1.5 ml tüp ve santrifüj transfer homojenat.
4. Mitokondri için zenginleştirmek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6000 x g'de santrifüj süpernatan ve al.
5. Süpernatant sitozolik fraksiyonu içerdiğinden, süpernatant atın veya alternatif deneyler için kullanabilirsiniz. Yıkama tamponu 300 ul pelletini.
6. İkinci kafes için 3,5 - 3,1 tekrarlayın adımları. Bir kriyojenik mikrosantrifüj tüpü içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş, her iki kafesleri pelet birleştirin.
7. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6000 x g'de santrifüjleyin.
8. Süpernatantı atın ve sıvı azot içinde pelet flash dondurma.
9. -80 ° C veya daha düşük bir sıcaklıkta mitokondriyal zenginleştirilmiş kısımlar saklayın.
   1. Alternatif olarak, bütün hayvan öncesi içinTerkip, bir kriyojenik mikrosantrifüj tüp içinde yetişkin yerleştirin. C veya daha düşük sıcaklıkta -80 ° sıvı azot ve mağaza erişkinlerde şişeyi Flash dondurma.

Sonuçlar

Protokol Yukarıda açıklandığı kullanarak, farklı mtDNAs ⁷ rapamisin ilacın etkisini test etmek için, mitokondriyal zenginleştirilmiş fraksiyonları ve bütün hayvansal özler üzerine metabolomic analizi yapıldı. Biz sinek gıda ilaç çözerek rapamisinin 200 mcM teslim etti. Sinekler için 10 gün rapamisin maruz bırakılmıştır. Bütün uçucu ekstrelerinden ve mitokondriyal ekstrelerinden metabolitleri standart çözücü çıkarma yöntemleri kullana...

Tartışmalar

Bu protokolde en kritik adımlar şunlardır: 1) bol uzayda yeterli sinekler yetiştirme. 150'den fazla sinekler her biri demografi kafesleri overpopulate değil çok önemlidir; 2) sık sık gıda rekabeti ve beslenme stresi önlemek için kafes gıda değişen; ve 3), 4 ° C 'de, tüm numuneler muhafaza mitokondriyal fraksiyonunun izolasyonu sırasında bütünlüğünü sağlamak için. Ayrıca yalıtım tamponu, yıkama tamponu ve kullanımdan önce kullanılan cam teflon homojenleştirici soğuk Dounce tavs...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate	VWR	AAA14289
Ethanol	Sigma-Aldrich	792799
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Sigma-Aldrich	M1254
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	38057
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	5470
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Tris HCl	Sigma-Aldrich	RES3098T-B7
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1551139
CO2 pads to anesthetize flies	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
1 L cage	Web Restaurant Store	999RD32
1 L cage lid	Web Restaurant Store	999LRD
a glass-teflon dounce homogenizer	Fisher Scientific	NC9661231
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
rapamycin	LC Laboratories	R-5000
anti-porin	MitoSciences	MSA03
anti-alpha tubulin	Developmental Studies Hybridoma Bank	12G10
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
CO2 pad	Tritech Research, Inc	MINJ-DROS-FP
filter flask	enasco	SB08184M
rubber stopper	enasco	S08512M