Preparazione di mitocondriali arricchiti frazioni per l&#39;analisi metabolica in<em&gt; Drosophila</em

Riepilogo

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Abstract

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions.

Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Introduzione

L'obiettivo di questa procedura è quello di sviluppare le frazioni mitocondriali arricchito che producono sufficienti metaboliti mitocondriali per metabolomica studi che utilizzano Drosophila melanogaster. Nella nostra esperienza, la metabolomica analisi che utilizzano interi metodi di estrazione cellulari sono in grado di rilevare i cambiamenti sottili metaboliti mitocondriali in Drosophila. Tuttavia, frazionamento mitocondriale prima dell'analisi metabolomica aumenta la sensibilità per identificare spostamenti metaboliti mitocondriali.

I mitocondri sono organelli cellulari responsabili della fornitura del 90% dell'energia che le cellule hanno bisogno per la normale funzione ^1. Negli ultimi anni è stato riconosciuto che i mitocondri hanno un ruolo molto più dinamico in funzione cellulare e organismal che soltanto la produzione di adenosina trifosfato (ATP), e sono ora riconosciuti come hub per la regolazione del metabolismo omeostasi ^2,3. I mitocondri sono il risultato di un processo in cui endosimbiontica dislignaggi microbiche stinti fuse ~ 1,5 miliardi di anni fa ^4. Come si sono evoluti in veri mitocondri organelli, i geni della endosimbionte sono stati incorporati nel genoma nucleare emergente. Negli animali oggi, circa 1.500 proteine ​​mitocondriali sono codificate dal nucleo, mentre 37 geni rimangono nel mtDNA, 13 dei quali codificano proteine ​​mitocondriali che sono subunità dei complessi enzimatici della fosforilazione ossidativa ^5. Coordinamento tra mitocondri e compartimenti nucleari è necessaria per mantenere una corretta funzione mitocondriale.

Utilizzando i metodi descritti qui siamo stati in grado di rilevare i cambiamenti metabolici mitocondriali in Drosophila che derivano dalla manipolazione del coordinamento tra genomi mitocondriali e nucleari. Abbiamo utilizzato un ceppo di Drosophila in cui mtDNA dalle specie sorelle D. simulans è stato posto su un singolo D. melanogaster sfondo nucleare ^6. Questo mitonuclear 'interrotto'il genotipo è stato confrontato con il 'nativo', o co-evoluti genotipo mitonuclear di D. melanogaster portando lo stesso genoma nucleare con la sua nativa D. melanogaster mtDNA. Il D. melanogaster e D. simulans mtDNA differiscono di ~ 100 amminoacidi e> 500 sostituzioni sinonime che influenzano mitonuclear ^7,8 comunicazione. Abbiamo generato estratti mosca integrali e estratti arricchiti mitocondriali per studiare cambiamenti metabolici in risposta allo stress farmacologico. Qui mostriamo che quando si utilizza mitocondriali arricchito frazioni rileviamo cambiamenti pronunciati in metaboliti mitocondriali tra i nativi, genotipo co-evoluta portando la D. mtDNA melanogaster e il genotipo perturbato che trasportano D. simulans mtDNA. Al contrario, le modifiche dei metaboliti tra questi due genotipi sono sottili utilizzando normali metodi che utilizzano estratto intero volo. Pertanto, questo metodo ha fornito un percorso per capire come mtDNA mediare i cambiamenti mitocondriali inrisposta ai farmaci diversi.

Protocollo

1. I reagenti e soluzioni

1. Preparazione di volare cibo e dei media
   1. Calore mosca gli ingredienti 11% di zucchero, 2% lievito Autolyzed, 5,2% farina di mais, agar 0,79% w / v in acqua in una piastra fissata a 90 ° C. Mescolare regolarmente fino ad ottenere una miscela omogenea leggermente densa. Preparare un volume finale di 550 ml di mosca cibo per un totale di 100 flaconcini con 5 ml volare alimentare in ogni.
   2. Rimuovere dalla fonte di calore, agitare occasionalmente finché il cibo si raffredda a 80 ° C e aggiungere 0,2% tegosept-metil 4-idrossibenzoato disciolto in 95% di etanolo.
   3. Dividere il cibo in due volumi uguali. Aggiungere 1,1 ml di 50 mM rapamicina sciolti in etanolo ad un volume e 1,1 ml di etanolo per l'altro volume. Mescolare il le soluzioni di etanolo nel cibo e rapamicina. Assicurarsi che la temperatura scende a 50 ° C prima di aggiungere farmaci.
2. Isolamento Buffer
   1. Preparare 500 ml di isolamento Buffer [225 mM Mannitolo, saccarosio 75 mm, 10 mM 3- (N </ em> -morpholino) propanosulfonico (MOPS) e 1 mm di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 2,5 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA)] in acqua.
   2. Portare il pH a 7,2 utilizzando idrossido di sodio. Il pH iniziale sarà acida.
   3. Utilizzare bottiglie di archiviazione filtro sterili con dimensione dei pori di 0,22 micron per sterilizzare soluzione e conservarlo a 4 ° C.
3. Tampone di lavaggio
   1. Preparare 500 ml di tampone di lavaggio [225 mM Mannitolo, saccarosio 75 mm, KCl 10 mm, 10 mM Tris HCl e 5 KH mM PO _{2 4]} in acqua.
   2. Portare il pH a 7,2 utilizzando idrossido di sodio. Il pH iniziale sarà acida.
   3. Utilizzare bottiglie di archiviazione filtro sterili con dimensione dei pori di 0,22 micron per sterilizzare soluzione e conservarlo a 4 ° C.

2. Governo dei ceppi di Drosophila

1. Per controllare la densità larvale durante lo sviluppo, inserire 25 coppie di genitori in una bottiglia cultura e di permettere loro di deporre le uova per 48 ore.
2. Rimuovi genitori dopo 48 ore di regolare la densità di uova.
3. Ripetere i punti 2.1 e 2.2 con la prole F1 emergente, così due generazioni di questo controllo della densità è raggiunto.
4. Per raccogliere gli adulti, anestetizzare linea utilizzando l'anidride carbonica _(CO 2) e separati per sesso.
   1. Utilizzare un unico regolatore fase consegnato CO ₂ pura da un serbatoio ad alta pressione in un flusso continuo di 5 psi. Per evitare l'elettricità statica, utilizzare tubi di plastica per catalizzare la CO ₂ in un matraccio da 500 ml di filtraggio con acqua.
   2. Utilizzare un tappo di gomma con un foro per sigillare nel pallone. Utilizzare tubi di plastica per collegare l'apertura laterale del pallone di un pad di CO _2.
   3. Posizionare le mosche in tampone per non più di 10-15 minuti. Permette di recuperare da anestesia per 24 ore prima di metterli in condizioni sperimentali.
5. Per generare abbastanza metaboliti frazioni arricchito mitocondriali, utilizzare 300 mosche per campione. Qui, utilizzare femmine, ma gender può differire in altri esperimenti. Trasferire 150 mosche per un 1 L demografia gabbia fatta in casa. Consentire l'accesso a 5 ml di mosca alimentare in una fiala.
6. Trasferire i restanti 150 mosche in un altro 1 L gabbia. Non sovrappopolare gabbie con più di 150 mosche.
7. Utilizzare sei campioni replicati per ogni condizione sperimentale. Poiché estratti animali interi resa più metaboliti, di generare 1 campione di tutto l'animale isolati, trasferire 50 femminile vola a una gabbia. Per quanto riguarda gli isolati mitocondriali, utilizzare sei campioni replicati per ogni condizione sperimentale.
8. Inserire gabbie a 25 ° C con ciclo di 12 ore di luce e 12 ore scuro.
9. Fornire cibo fresco ogni 2 o 3 giorni in una fiala con 5 ml di cibo per mantenere la qualità del cibo.
10. Mantenere mosche sul cibo per 10 giorni. Questo passo è necessario per il trattamento rapamicina ^7. Altri trattamenti o condizioni saranno diverse.

3. Isolamento di mitocondriali Frazioni

1. Dump vola da una gabbia (150 mosche) in unvetro-teflon Dounce omogeneizzatore riempita con 1 ml di tampone isolamento refrigerati.
2. Omogeneizzare spostando il pestello su e giù per 15 colpi. Tenere il mortaio su ghiaccio per mantenere intatto mitocondri.
3. Trasferimento omogenato in una provetta da 1,5 ml e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C.
4. Prendere il surnatante e centrifugare a 6000 xg per 10 min a 4 ° C per arricchire per mitocondri.
5. Come il surnatante contiene la frazione citosolica, scartare il surnatante o usarlo per esperimenti alternativi. Risospendere il pellet in 300 ml di tampone di lavaggio.
6. Ripetere i passaggi 3,1-3,5 per il secondo gabbia. Unire i pellet risospeso di entrambe le gabbie in una provetta criogenica.
7. Centrifugare a 6000 xg per 10 min a 4 ° C.
8. Scartare il surnatante e flash-congelare il pellet in azoto liquido.
9. Conservare le frazioni arricchite mitocondriali a -80 ° C o temperature inferiori.
   1. In alternativa, per tutta la pre animaleparazione, posizionare le adulti in una provetta criogenica. Flash-congelare la fiala in azoto e conservare adulti liquido a -80 ° C o la temperatura più bassa.

Risultati

Utilizzando il protocollo spiegato in precedenza, abbiamo effettuato l'analisi metabolomica sulle frazioni arricchito mitocondriali ed estratti di animali interi per testare l'effetto del farmaco rapamicina sul mtDNA divergenti ^7. Abbiamo consegnato 200 mM di rapamicina sciogliendo il farmaco nel cibo mosca. Le mosche sono stati esposti a rapamicina per 10 giorni. I metaboliti da estratti interi fly e da estratti mitocondriali sono stati ottenuti usando la spettro...

Discussione

Le fasi più critiche di questo protocollo sono: 1) l'allevamento abbastanza mosche nello spazio abbondante. E 'molto importante non sovrappopolare gabbie demografia con più di 150 mosche ciascuna; 2) cambiare il cibo delle gabbie frequentemente per evitare la concorrenza cibo e stress nutrizionale; e 3) il mantenimento di tutti i campioni a 4 ° C per garantire l'integrità durante l'isolamento della frazione mitocondriale. Si raccomanda inoltre di raffreddare il buffer di isolamento, il tampone di lav...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate	VWR	AAA14289
Ethanol	Sigma-Aldrich	792799
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Sigma-Aldrich	M1254
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	38057
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	5470
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Tris HCl	Sigma-Aldrich	RES3098T-B7
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1551139
CO2 pads to anesthetize flies	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
1 L cage	Web Restaurant Store	999RD32
1 L cage lid	Web Restaurant Store	999LRD
a glass-teflon dounce homogenizer	Fisher Scientific	NC9661231
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
rapamycin	LC Laboratories	R-5000
anti-porin	MitoSciences	MSA03
anti-alpha tubulin	Developmental Studies Hybridoma Bank	12G10
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
CO2 pad	Tritech Research, Inc	MINJ-DROS-FP
filter flask	enasco	SB08184M
rubber stopper	enasco	S08512M