Préparation de mitochondriales fractions enrichies pour métabolique Analyse en<em&gt; Drosophila</em

Résumé

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Résumé

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions.

Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Introduction

Le but de cette procédure est de développer des fractions mitochondriales enrichis qui donnent suffisamment de métabolites mitochondriaux pour les études de métabolomique utilisant Drosophila melanogaster. Dans notre expérience, la métabolomique analyse en utilisant des méthodes d'extraction cellulaire entiers sont incapables de détecter les changements subtils de métabolites mitochondriaux chez la drosophile. Cependant, fractionnement mitochondrial avant l'analyse métabolomique augmente la sensibilité pour identifier les changements de métabolites mitochondriaux.

Les mitochondries sont des organelles cellulaires responsables de fournir 90% de l'énergie que les cellules ont besoin pour ^une fonction normale. Au cours des dernières années, il a été reconnu que les mitochondries jouent un rôle beaucoup plus dynamique dans la fonction cellulaire et organismique que de simplement produire de l'adénosine triphosphate (ATP), et sont maintenant reconnus comme des plaques tournantes pour la régulation de l'homéostasie métabolique ^2,3. Les mitochondries sont le résultat d'un processus d'endosymbiose dans laquelle DISlignées microbiennes tinctes fusionné ~ il ya 1,5 milliards d'années ^4. Comme les mitochondries ont évolué en véritables organites, les gènes de la endosymbiote ont été incorporés dans le génome nucléaire émergents. Chez les animaux aujourd'hui, environ 1500 protéines mitochondriales sont dotés d'codée tandis que 37 gènes restent dans la ADNmt, 13 qui codent pour des protéines mitochondriales qui sont des sous-unités des complexes enzymatiques de la phosphorylation oxydative ^5. La coordination entre les mitochondries et les compartiments nucléaires est nécessaire pour maintenir la fonction mitochondriale appropriée.

En utilisant les méthodes décrites ici, nous avons pu détecter des changements métaboliques mitochondriales chez la drosophile qui résultent de la manipulation de la coordination entre les génomes mitochondriaux et nucléaires. Nous avons utilisé une souche de Drosophila dans lequel l'ADNmt de son espèce sœur D. simulans a été placé sur un seul D. melanogaster fond nucléaire ^6. Cette mitonuclear «perturbé»génotype a été comparé au génotype mitonuclear «natif», ou co-évolué de D. melanogaster portant le même génome nucléaire avec son D. natif melanogaster ADNmt. Le D. D. melanogaster et simulans ADNmt différer de ~ 100 acides aminés et> 500 substitutions synonymes qui affectent la communication mitonuclear ^7,8. Nous avons généré des extraits de mouches entiers et des extraits enrichis mitochondrial pour étudier les changements de métabolites en réponse au stress pharmacologique. Ici, nous montrons que lorsque vous utilisez mitochondriales enrichi fractions nous détectons des changements marqués dans métabolites mitochondriaux entre le génotype de co-évolué natif portant le D. ADNmt melanogaster et le génotype perturbé transportant D. simulans ADNmt. En revanche, les modifications des métabolites entre ces deux génotypes sont subtiles en utilisant des procédés qui utilisent des normales à la mouche extrait entier. Par conséquent, cette méthode a fourni un trajet de comprendre comment ADNmt médiation modifications mitochondriales dansréponse à différents médicaments.

Protocole

1. Réactifs et solutions

1. Préparation de la nourriture à la mouche et les médias
   1. Chaleur mouche ingrédients 11% de sucre, 2% de levure autolysée, 5,2% de farine de maïs, de l'agar 0,79% p / v dans l'eau dans une plaque fixée à 90 ° C. Remuez régulièrement jusqu'à obtention d'un mélange homogène légèrement dense. Préparer un volume final de 550 ml de nourriture à la mouche pour un total de 100 flacons de 5 ml voler la nourriture dans chaque.
   2. Retirer de la source de chaleur, remuer de temps en temps jusqu'à ce que la nourriture refroidit à 80 ° C et ajouter 0,2% tegosept-méthyl 4-hydroxybenzoate dissous dans 95% d'éthanol.
   3. Diviser la nourriture en deux volumes égaux. Ajouter 1,1 ml de 50 mM dissous dans de l'éthanol rapamycine à un volume et 1,1 ml d'éthanol à l'autre volume. Agiter la rapamycine et les solutions d'éthanol dans l'aliment. Assurez-vous que la température diminue à 50 ° C avant d'ajouter des médicaments.
2. Isolement Buffer
   1. Préparez 500 ml d'isolement tampon [mM mannitol 225 mM, saccharose 75, 10 mM 3- (N </ em>-morpholino) propanesulfonique (MOPS) et 1 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 2,5 mg / ml d'albumine de sérum bovin (BSA)] dans l'eau.
   2. Ajuster le pH à 7,2 en utilisant de l'hydroxyde de sodium. Le pH initial sera acide.
   3. Utilisez des bouteilles de stockage de filtre stériles avec une taille de pores de 0,22 um pour stériliser la solution et de le stocker à 4 ° C.
3. Wash Buffer
   1. Préparer 500 ml de tampon de lavage [225 mM de mannitol, saccharose 75 mM, KCl 10 mM, Tris-HCl 10 mM et 5 mM de KH ₂ PO _4] dans l'eau.
   2. Ajuster le pH à 7,2 en utilisant de l'hydroxyde de sodium. Le pH initial sera acide.
   3. Utilisez des bouteilles de stockage de filtre stériles avec une taille de pores de 0,22 um pour stériliser la solution et de le stocker à 4 ° C.

2. Elevage des souches de drosophile

1. Pour contrôler la densité des larves au cours du développement, placer 25 paires de parents dans un flacon de culture et de leur permettre pondent des œufs pendant 48 heures.
2. Supprimer parents après 48 h pour réguler la densité des œufs.
3. Répétez les étapes 2.1 et 2.2 en utilisant la F1 progéniture émergents, de sorte que deux générations de ce contrôle de la densité est atteint.
4. Pour collecter des adultes, anesthésier les mouches utilisant du dioxyde de carbone (CO ₂₎ et séparée par sexe.
   1. Utilisez un régulateur en une seule étape à livré CO ₂ pur à partir d'un réservoir sous pression élevée à un flux continu de 5 psi. Pour éviter l'électricité statique, utiliser des tubes en plastique pour catalyser la _CO 2 dans un flacon de 500 ml de filtrage avec de l'eau.
   2. Utiliser un bouchon en caoutchouc avec un trou pour sceller le flacon. Utiliser un tube en plastique pour relier l'ouverture latérale du ballon à un pad _de CO 2.
   3. Placez les mouches dans le pad pour pas plus de 10-15 minutes. Laisser remettre de l'anesthésie pendant 24 heures avant de les placer dans des conditions expérimentales.
5. Pour générer suffisamment de métabolites de fractions enrichies mitochondriales, utiliser 300 mouches par échantillon. Ici, utiliser les femelles, mais Gender peut être différent dans d'autres expériences. Transférer 150 mouches à une maison 1 L démographie cage. Autoriser l'accès à 5 ml de nourriture à la mouche dans un flacon.
6. Transférer les 150 restants vol à une autre cage L. Ne pas surpeupler cages avec plus de 150 mouches.
7. Utilisez six échantillons répétés par condition expérimentale. Depuis des extraits d'animaux entiers donnent plus de métabolites, pour générer 1 échantillon de l'animal entier isole, transférer 50 mouches femelles une cage. Comme pour les isolats mitochondriales, utilisez six échantillons répétés par condition expérimentale.
8. La place des cages à 25 ° C avec un cycle de 12 heures de lumière et 12 h foncé.
9. Fournir de la nourriture fraîche tous les 2 ou 3 jours dans un flacon de 5 ml de nourriture pour maintenir la qualité des aliments.
10. Maintenir des mouches sur la nourriture pendant 10 jours. Cette étape est nécessaire pour le traitement de la rapamycine ^7. D'autres traitements ou conditions seront différentes.

3. Isolation des fractions mitochondriales

1. Dump vole d'une cage (150 mouches) dans unverre-téflon homogénéisateur Dounce rempli avec 1 ml de tampon d'isolement froid.
2. Homogénéiser en déplaçant le pilon de haut en bas pour 15 coups. Gardez le mortier sur la glace pour garder intacte mitochondries.
3. Transfert homogénat à un tube de 1,5 ml et centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C.
4. Prendre le surnageant et centrifuger à 6000 g pendant 10 min à 4 ° C pour enrichir en mitochondries.
5. Comme le surnageant contient la fraction cytosolique, jeter le surnageant ou de l'utiliser pour des expériences alternatives. Reprendre le culot dans 300 pl de tampon de lavage.
6. Répétez les étapes 3.1 à 3.5 pour la deuxième cage. Combiner les culots remis en suspension de deux cages dans un tube à centrifuger cryogénique.
7. Centrifugeuse à 6000 g pendant 10 min à 4 ° C.
8. Jeter le surnageant et flash-geler le culot dans de l'azote liquide.
9. Stocker les fractions enrichies mitochondriales à -80 ° C ou une température plus basse.
   1. Sinon, pour le pré de l'animal entierparation, placer les adultes dans un tube à centrifuger cryogénique. Flash geler le flacon dans de l'azote liquide et stocker des adultes à -80 ° C ou plus basse température.

Résultats

En utilisant le protocole exposé ci-dessus, nous avons effectué une analyse métabolomique fractions enrichies en mitochondrie et des extraits d'animaux entiers de tester l'effet du médicament sur ​​la rapamycine ADNmt ⁷ divergentes. Nous avons livré 200 uM de rapamycine par dissolution du médicament dans la nourriture des mouches. Les mouches ont été exposés à la rapamycine pendant 10 jours. Métabolites à partir d'extraits de mouches entières ...

Discussion

Les étapes les plus critiques de ce protocole sont les suivants: 1) l'élevage suffisamment vol dans l'espace en abondance. Il est très important de ne pas surpeupler les cages de la démographie de plus de 150 chaque vol; 2) modification de la nourriture des cages fréquemment pour éviter la concurrence alimentaire et le stress nutritionnel; et 3) le maintien de tous les échantillons à 4 ° C pour assurer l'intégrité lors de l'isolement de la fraction mitochondriale. Il est également recommandé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate	VWR	AAA14289
Ethanol	Sigma-Aldrich	792799
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Sigma-Aldrich	M1254
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	38057
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	5470
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Tris HCl	Sigma-Aldrich	RES3098T-B7
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1551139
CO2 pads to anesthetize flies	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
1 L cage	Web Restaurant Store	999RD32
1 L cage lid	Web Restaurant Store	999LRD
a glass-teflon dounce homogenizer	Fisher Scientific	NC9661231
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
rapamycin	LC Laboratories	R-5000
anti-porin	MitoSciences	MSA03
anti-alpha tubulin	Developmental Studies Hybridoma Bank	12G10
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
CO2 pad	Tritech Research, Inc	MINJ-DROS-FP
filter flask	enasco	SB08184M
rubber stopper	enasco	S08512M