Preparação de mitocondriais frações enriquecidas para Análise metabólica em<em&gt; Drosophila</em

Resumo

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Resumo

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions.

Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Introdução

O objetivo deste procedimento é desenvolver frações mitocondriais enriquecidos que produzem metabólitos mitocondriais suficientes para metabolômica estudos utilizando Drosophila melanogaster. Em nossa experiência, metabolômica análise usando métodos de extração celular inteiras são incapazes de detectar mudanças sutis metabólitos mitocondriais em Drosophila. No entanto, fracionamento mitocondrial antes da análise metabolômicas aumenta a sensibilidade para identificar mudanças de metabolitos mitocondriais.

As mitocôndrias são organelas celulares responsáveis ​​pelo fornecimento de 90% da energia que as células precisam para a função normal ^1. Nos últimos anos, tem sido reconhecido que as mitocôndrias desempenhar um papel muito mais dinâmico na função celular e do organismo do que simplesmente produzir trifosfato de adenosina (ATP), e são agora reconhecidos como hubs para a regulação da homeostase metabólica ^2,3. As mitocôndrias são o resultado de um processo em que endosymbiotic dislinhagens microbianas tinct fundiu ~ 1,5 bilhões de anos atrás ^4. Como as mitocôndrias evoluíram para verdadeiras organelas, genes da endosymbiont foram incorporados no genoma nuclear emergente. Em animais, hoje, cerca de 1.500 proteínas mitocondriais são codificados nuclear enquanto 37 genes permanecem na mtDNA, 13 dos quais codificam proteínas mitocondriais que são subunidades dos complexos de enzimas de fosforilação oxidativa ^5. A coordenação entre as mitocôndrias e compartimentos nucleares é necessária para manter a função mitocondrial adequada.

Usando os métodos descritos aqui, fomos capazes de detectar alterações metabólicas mitocondriais em Drosophila que resultam da manipulação da coordenação entre os genomas mitocondriais e nucleares. Nós usamos uma linhagem de Drosophila em que mtDNA de suas espécies irmãs D. simulans foi colocada sobre um único D. melanogaster fundo nuclear ^6. Este mitonuclear 'interrompido'genótipo foi comparado com o genótipo mitonuclear "nativo", ou co-evoluiu de D. melanogaster transportando a mesma com o seu genoma nuclear nativa D. melanogaster mtDNA. O D. melanogaster e D. simulans mtDNAs diferem por ~ 100 aminoácidos e> 500 substituições sinônimas que afetam mitonuclear ^7,8 comunicação. Geramos extratos mosca integrais e extratos enriquecidos mitocondriais para estudar mudanças de metabolitos em resposta ao estresse farmacológico. Aqui nós mostramos que, ao usar frações mitocondriais enriquecido detectamos mudanças acentuadas em metabólitos mitocondriais entre o genótipo nativa, co-evoluído levando a D. mtDNAs melanogaster e as genótipo rompidas transportando D. simulans mtDNA. Em contraste, as modificações do metabolito entre estes dois genótipos são subtis usando métodos normais que utilizam extracto mosca todo. Por conseguinte, este método forneceu um caminho para entender como mtDNAs mediar alterações mitocondriais emresposta a diferentes drogas.

Protocolo

1. Reagentes e Soluções

1. Preparação do alimento mosca e mídia
   1. Mosca calor ingredientes de açúcar 11%, 2% de levedura autolisada, 5,2% de farinha de milho, agar de 0.79% w / v em água em uma placa fixada em 90 ° C. Agita-se regularmente até uma mistura ligeiramente densa homogénea. Preparar um volume final de 550 ml de alimento mosca para um total de 100 tubos de ensaio com 5 ml em cada mosca alimentos.
   2. Remover a partir da fonte de calor, agita-se ocasionalmente até que o alimento tiver arrefecido até 80 ° C e adicionar 0,2% tegosept-metil 4-hidroxibenzoato de metilo Dissolveu-se em etanol a 95%.
   3. Dividir a comida em dois volumes iguais. Adicionar 1,1 ml de 50 mM de rapamicina dissolvidos em etanol para um volume e 1,1 ml de etanol para o outro volume. Agita-se a rapamicina e as soluções de etanol para a comida. Certifique-se de que a temperatura cai para 50 ° C antes da adição de drogas.
2. Tampão de isolamento
   1. Preparar 500 ml de tampão de isolamento [Manitol 225 mM, sacarose 75 mM, 10 mM de ácido 3- (N </ em>-morfolino) propanossulf único (MOPS) e 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 2,5 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA)] em água.
   2. Ajustar o pH para 7,2 utilizando hidróxido de sódio. O pH inicial irá ser ácido.
   3. Use garrafas de armazenamento filtro estéril com poros de 0,22 um para esterilização da solução e armazená-lo a 4 ° C.
3. Tampão de Lavagem
   1. Preparar 500 ml de tampão de lavagem [Manitol 225 mM, sacarose 75 mM, KCl 10 mM, Tris HCl 10 mM e 5 mM de KH _{2 PO 4]} em água.
   2. Ajustar o pH para 7,2 utilizando hidróxido de sódio. O pH inicial irá ser ácido.
   3. Use garrafas de armazenamento filtro estéril com poros de 0,22 um para esterilização da solução e armazená-lo a 4 ° C.

2. Criação de as estirpes de Drosophila

1. Para controlar a densidade larval durante o desenvolvimento, coloque 25 pares de pais em um frasco de cultura e permitir-lhes a pôr ovos durante 48 horas.
2. Remova os pais depois de 48 horas para regular a densidade dos ovos.
3. Repita os passos 2.1 e 2.2 utilizando a prole F1 emergentes, de modo duas gerações deste controle de densidade é atingida.
4. Para a coleta de adultos, anestesiar as moscas que utilizam o dióxido de carbono (CO ₂₎ e separados por sexo.
   1. Usar um único regulador de fase pura para entrega _de CO 2 a partir de um tanque de alta pressão com um fluxo contínuo de 5 psi. Para evitar a electricidade estática, utilizar um tubo de plástico para catalisar a CO ₂ em um frasco de 500 ml com água de filtragem.
   2. Usar uma rolha de borracha com um orifício para selar o frasco. Utilize tubos de plástico para ligar a abertura lateral do balão a uma almofada de CO _2.
   3. Coloque as moscas na almofada para não mais de 10-15 min. Deixa-se recuperar da anestesia durante 24 h antes de colocá-los em condições experimentais.
5. Para gerar metabólitos suficientes para fracções enriquecidas mitocondriais, use 300 moscas por amostra. Aqui, use as fêmeas, mas gendeR pode ser diferente em outras experiências. Transferir 150 moscas caseiras 1 L gaiola demografia. Permitir o acesso a 5 ml de alimentos num frasco de mosca.
6. Transferir os restantes 150 moscas para outro 1 L gaiola. Não overpopulate gaiolas com mais de 150 moscas.
7. Use seis amostras idênticas, por condição experimental. Desde extratos de animais inteiros render mais metabolitos, para gerar uma amostra de toda animais isolados, transferir 50 fêmea voa para uma gaiola. Como para os isolados mitocondriais, utilize seis amostras idênticas, por condição experimental.
8. Coloque gaiolas a 25 ° C, com ciclo de 12 horas de luz e 12 horas escuro.
9. Fornecer fresco a cada 2 ou 3 dias num frasco com 5 ml de alimento para manter a qualidade dos alimentos.
10. Manter moscas em comida para 10 dias. Este passo é necessário para o tratamento de rapamicina ^7. Outros tratamentos ou condições serão diferentes.

3. Isolamento de fracções mitocondriais

1. Dump voa de uma gaiola (150 moscas) em umvidro-Teflon homogeneizador Dounce cheio com 1 ml de tampão de isolamento arrefecido.
2. Homogeneizar movendo o pilão cima e para baixo por 15 tacadas. Mantenha a argamassa em gelo para manter mitocôndrias intactas.
3. Transferência homogeneizado para um tubo de 1,5 ml e centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
4. Tome-se o sobrenadante e centrifuga-se a 6000 xg durante 10 min a 4 ° C para enriquecer para mitocôndrias.
5. Como o sobrenadante contém a fracção citosólica, desprezar o sobrenadante ou usá-la para experiências alternativas. Ressuspender o sedimento em 300 ul de tampão de lavagem.
6. Repita os passos de 3,1-3,5 para a segunda gaiola. Combinam-se as peletes ressuspensas de duas gaiolas num tubo de microcentrífuga criogénico.
7. Centrifugar a 6.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
8. Descartar o sobrenadante e congelar o Flash-o sedimento em azoto líquido.
9. Armazenar as fracções enriquecidas mitocondriais a -80 ° C ou temperatura inferior.
   1. Como alternativa, para animais pré inteiroparation, colocar os adultos em um tubo de microcentrífuga criogénico. Flash congelar o frasco em azoto líquido e armazenar adultos a -80 ° C ou temperatura inferior.

Resultados

Usando o protocolo acima referido, foi realizada a análise fracções enriquecidas em metabolômico mitocondriais e extractos de animais inteiros para testar o efeito do fármaco rapamicina em mtDNAs divergentes ^7. Obtivemos 200 uM de rapamicina por dissolução da droga no alimento mosca. As moscas foram expostos a rapamicina durante 10 dias. Os metabolitos de extractos de mosca inteiras e extractos de mitocondriais foram obtidos utilizando um espectrómetro de massa de...

Discussão

Os passos mais críticos neste protocolo são: 1) criação de moscas suficientes no espaço abundante. É muito importante para as gaiolas não overpopulate demografia com mais de 150 moscas cada; 2) mudando a comida das gaiolas com freqüência para evitar a concorrência alimentar e estresse nutricional; e 3) a manutenção de todas as amostras a 4 ° C para assegurar a integridade durante o isolamento da fracção mitocondrial. Também é recomendado para relaxar o tampão de isolamento, o tampão de lavagem, e o ho...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate	VWR	AAA14289
Ethanol	Sigma-Aldrich	792799
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Sigma-Aldrich	M1254
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	38057
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	5470
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Tris HCl	Sigma-Aldrich	RES3098T-B7
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1551139
CO2 pads to anesthetize flies	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
1 L cage	Web Restaurant Store	999RD32
1 L cage lid	Web Restaurant Store	999LRD
a glass-teflon dounce homogenizer	Fisher Scientific	NC9661231
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
rapamycin	LC Laboratories	R-5000
anti-porin	MitoSciences	MSA03
anti-alpha tubulin	Developmental Studies Hybridoma Bank	12G10
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
CO2 pad	Tritech Research, Inc	MINJ-DROS-FP
filter flask	enasco	SB08184M
rubber stopper	enasco	S08512M