הערכה של מאפייני המערכת החיסוניים של תאי גזע mesenchymal האדם (MSCs)

Summary

תכונות המערכת החיסונית של תאים האנושיים mesenchymal גזע (MSC) מופיעות רלוונטיות יותר ויותר ליישום קליני. באמצעות מערכת שיתוף התרבות של תאי גזע ולויקוציטים דם ההיקפי מראש צבעונית עם succinimidyl אסתר carboxyfluorescein צבע הניאון (CFSE), אנו מתארים את ההערכה במבחנה של תפקוד מערכת חיסון MSC על התפשטות יקוציט מפעיל ותת-אוכלוסיות ספציפיות.

Abstract

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

Introduction

תאים אנושיים גזע mesenchymal (MSCs) הם אבות גופניים שיכול להתמיין שושלות mesodermal הפרקסיאלית של עצם, סחוס, ורקמת שומן ^1-4, כמו גם לכמה שושלות extramesodermal ^5. בודד לראשונה ממח העצם המבוגר, אבות multilineage אלה עכשיו נמצאו במספר רב של רקמות ^6-8 ו, באופן בלתי צפוי, הראה את תכונות המערכת החיסונית חזקות שמופיעות נוח מאוד ליישום קליני ^9-12. מנגנונים מפורטים המעורבים בהשפעות המערכת החיסונית באופן פעיל נחקרים על יישום יעיל בגופים מחלה ספציפיים. אחת הדרכים פשוטות ביותר להערכת תפקוד מערכת חיסון הוא על ידי הערכה לדיכוי התפשטות יקוציט מפעיל ^13. רוב לויקוציטים מפעיל כגון לימפוציטים מסוג T ומונוציטים להתרבות להפליא כאשר מגורה או הופעל. פונקצית המערכת החיסונית ניתן להעריך מתי דיכויעדות לכך היא התפשטות.

באופן מסורתי, התפשטות יקוציט מפעיל הוערכה על ידי איתור של ^[3 H] התאגדות thymidine לתוך ה- DNA. עם זאת, בשיטה זו יש חסרונות משמעותיים עקב החששות של קרינה ורשות דואר לשימוש, כמו גם הציוד המורכב דרוש. אמנם יש מבחני לא רדיואקטיבי להעריך התפשטות תאים, יש assay succinimidyl אסתר carboxyfluorescein (CFSE) יתרונות אחרים כגון המאפשר זיהוי של אוכלוסיות סלולריות ספציפיות, שהוא שימושי במיוחד בניסויי שיתוף התרבות מעורבים סוגי תאים מרובים. CFSE הוא צבע סלולארי ניאון שניתן להעריך על ידי ניתוח התזרים cytometric. כתאים מתחלקים, עוצמת תווית סלולרית זה היא ירד באופן יחסי; זה לא רק מאפשר קביעת התפשטות תאים כוללת, אלא גם מאפשר להערכה על מספר חלוקות תא עד 8 חטיבות לפני הקרינה הופכת להיות קשה Detect נגד אות רקע. יתר על כן, יציבות CFSE הניאון מאפשרת מעקב in vivo של תאים שכותרתו כך שניתן דמיינו את תאים לחודשים רבים ^14.

assay זה יכול גם להיות מגוון כדי להעריך סוגים מסוימים של כדוריות דם לבנות מפעיל או פונקצית המערכת החיסונית של אוכלוסיות ספציפיות של MSC-induced לויקוציטים-כגון המערכת החיסונית כinterleukin-10 (IL-10) בהפקת CD14 ⁺ מונוציטים ¹⁵ על ידי ביצוע בחירת סמן משטח מגנטי חרוז של אוכלוסיות תאים של עניין לפני או אחרי שיתוף תרבות כמתאים. הפרוטוקול שלנו מתאר את assay הבסיסי של הערכת השפעות המערכת החיסונית של תאי גזע בלויקוציטים מפעיל (תרשים זרימה שמוצג באיור 1) ווריאציה על assay הבסיסי זה להערכת תפקוד מערכת חיסון יקוציט מושרה MSC בלימפוציטים מסוג T מסוג CD4 ⁺ מפעיל אלוגנאית (מוצג תרשים זרימה באיור 4).

Protocol

הסכמת המטופל הודיעה כפי שאושרו על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי יש לקבל לשימוש בתאים אנושיים.

1. בידוד צפיפות צבע של תאים ההיקפיים אדם הדם mononuclear (PBMCs)

1. הוסף 25 מיליליטר heparinized כל דם לתוך צינור 50 מיליליטר על ידי פיפטה 25 מיליליטר.
   1. לדלל תאים עם 25 מיליליטר של פוספט שנאגרו מלוח (PBS).
2. להוסיף 15 מיליליטר של שיפוע צפיפות Ficoll-Paque לתוך צינור 50 מיליליטר חדש, ותוך הטיית הצינור, מאוד לאט ובזהירות להוסיף 25 מיליליטר בהשעית התא המדולל מעל שיפוע הצפיפות כך שאין ערבוב של כל הדם עם שיפוע הצפיפות, כלומר., אין הפרעה של ממשק שיפוע דם בצפיפות.
3. צנטריפוגה ההשעיה מהצעד 1.2 בז × 400 במשך 30 עד 40 דקות בהרוטור מתנדנד-דלי טמפרטורה מבוקרת ללא בלם ב 20 ° C.
   שים לב: שלוש שכבות נפרדות צריכה להיות ברורות לאחר צנטריפוגה: הדואר פלזמה יצור שכבה העליונה; השכבה התחתונה ברורה ששיפוע צפיפות Ficoll-Paque; ושכבה דקה, בינונית סלולרית להיות PBMCs
4. לשאוב ולזרוק את השכבה העליונה על ידי שאיבה עם פיפטה פסטר, בזהירות שלא להפריע את שכבת הביניים של תאי mononuclear (כלומר, לימפוציטים, מונוציטים, וטסיות דם).
5. לאסוף בזהירות שכבת תאי mononuclear זה עם פיפטה 10 מיליליטר לצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר חדש.
6. מלא את הצינור עם 20 מיליליטר של PBS, מערבב היטב, וצנטריפוגות ב g × 300 עבור 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant לחלוטין לאחר צנטריפוגה.
7. Resuspend התא גלולה ב 20 מיליליטר של PBS ו צנטריפוגות ב 200 × גרם במשך 10-15 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant לחלוטין לאחר צנטריפוגה.
   הערה: צעד זה מסיר את טסיות הדם-שהם לא רצויים-בPBMCs; ניתן לחזור על שלב זה כדי להבטיח הסרת מלאה טסיות הדם.
8. אם אין בחירה של אוכלוסיות ספציפיות היארצוי, resuspend תא גלולה במדיום מלא לויקוציטים (10% בסרום שור עוברי (FBS), 1% L- גלוטמין, ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין במדיום RPMI-1640) עבור culturing לאחר ביצוע ספירת תאי ¹⁶ להשעות 1 מיליליטר של בינוני לכל 10 ⁷ PBMCs לפני שתמשיך לשלב הבא.

2. תיוג מגנטי של אוכלוסיות יקוציט (דלג לשלב 4 אם אין בחירה של אוכלוסיות ספציפיות נדרש)

1. ההשעיה צנטריפוגה PBMC בז × 300 במשך 10 דקות ולשאוב supernatant לחלוטין.
2. גלולה תא הגלול ב 80 μl של PBS לכל 10 ⁷ תאים כולל.
3. הוסף 20 μl של חרוזים מגנטיים שצוינו (כלומר, חרוזים מגנטיים CD14 לבידוד של מונוציטים, חרוזים מגנטיים CD4 לבידוד של לימפוציטים מסוג T) לכל 10 ⁷ תאים כולל.
4. מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות ב2 עד 8 מעלות צלזיוס במקרר.
5. להוסיף 1-2 מיליליטר של PBS לכל 10 ⁷ תאים לשטוף, ו צנטריפוגותבז × 300 במשך 10 דקות.
6. לשאוב supernatant לחלוטין וresuspend עד 10 ⁸ תאים ב500 μl של PBS.

3. בחירה מגנטית של אוכלוסיות יקוציט

הערה: מגוון רחב של מפרידי חרוז מגנטיים ועמודות זמינים לבידודה של אוכלוסייה הספציפית של לויקוציטים ידי סמן תא שטח ממספר היצרנים. בידוד יכול להיות על ידי בחירה חיובית המבוססת על סמנים אחד או כמה חיוביים או על ידי בחירה שלילית לאחר הדלדול של אוכלוסיות לא רצויות. גישה כללית של ביצוע סלקציה חיובית באמצעות סמן אחד (כלומר, מסוג CD4 לימפוציטים T מסייע, או CD14 למונוציטים) מפורטת להלן.

1. הכן ומפריד מגנטי ראש כולל טור הפרדה על פי הוראות יצרן.
2. החל צינור המכיל המדגם של PBMCs שכותרת. לספק שני 15 מיליליטר צינורות צנטריפוגה לאיסוף וסר התווית שכותרתו חיוביתשברים אד תא, הבאים הוראות יצרן.
3. ספירת תאי מספר ¹⁵ וresuspend לויקוציטים חיובי שנבחר (כלומר, לימפוציטים מסוג CD4 ⁺ T או CD14 ⁺ תאים) במדיום מלא לויקוציטים, באמצעות 1 מיליליטר של מדיום לכל 10 ⁷ תאים.

4. CFSE הכתמה של לויקוציטים להערכה של הפצת נשק

הערה: CFSE כבר בשימוש נרחב בחקירות חיסוניות, לשניהם in vivo ובניסויים במבחנה. הפרוטוקול שלנו כבר מותאם למחקר במבחנה של MSC / PBMC (או לויקוציטים אחרים) אינטראקציות. בעוד מעורבים בניהול במבחנה תיוג CFSE הצעדים הכלליים דומים, שעשוי להיות הבדלים במינון ובעיתוי הספציפיים של הפרוטוקול ^14. זה יכול להיות בגלל מספר הגורמים, כלומר, סוג תא המסוים בשימוש, מספרים סלולריים המשומשים שסביר יכול להשפיע על עוצמת אות ניאון CFSE.

1. לדלל את פתרון CFSE מניות (10 מ"מ) ב- PBS לריכוז העבודה הרצוי של 10 מיקרומטר (פתרון CFSE-עבודה). הכן 10 ⁷ תאים (כלומר, PBMCs או תאי T) לתיוג עם פתרון CFSE-העבודה.
2. צנטריפוגה ב g × 300 במשך 10 דקות כדי להשיג תא גלולה ולשאוב supernatant.
3. Resuspend התאים בעדינות ב 1 מיליליטר של פתרון מחומם מראש (37 ° C) CFSE-עבודה ודגירת התאים במשך 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
4. כדי לשטוף את CFSE העודף, לדלל את ההשעיה התא עם 10x (לפי נפח) של precooled (4 ° C) בינוני RPMI המכיל 10% FBS. משקעי התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות וזורקים supernatant. שטוף את התא גלולה באופן זה עוד פעמיים.
5. גלולה-מחדש את התאים על ידי צנטריפוגה וספירת תאי מספר ^15. Resuspend 10 ⁷ תאים (או PBMCs או תאי T) במדיום מלא יקוציט prewarmed 1 מיליליטר טרי.

5. עמית תרבות Mמאמנים עם לויקוציטים והפעלה של לויקוציטים

1. בינוני MSC טרום החם מלא (10% FBS (שנבדק מראש לצמיחה אופטימלית MSC), 1% L- גלוטמין, ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין במדיום גלוקוז DMEM נמוך) עד 37 מעלות צלזיוס במשך לא יותר מ -30 דקות.
2. MSCs זרע ב50,000 תאים ב 1 מיליליטר של מדיום מלא MSC בלוחות 24 גם (צפיפות MSC: 25,000 תאים / ² סנטימטר) לO המצורף / N בחממה 37 ° C, המאפשרים לתאי הגזע כדי להגיע למפגש 80%.
3. בינוני לשאוב, ומבוסס על מספרי MSC זרע, להוסיף PBMCs כותרת CFSE (שכותרתו בבקשה בעבר מתייחס לשלב פרוטוקול 4 לעיל) לתאי גזע בתרבית (שנזרע ביום הקודם בלוחות 24 גם) ב 1 מיליליטר של מדיום מלא לויקוציטים ב 01:10 (יחס תא) יחס שיתוף תרבות של תאי גזע לPBMCs.
4. הוסף את phytohemagglutinin mitogen (PHA), activator יקוציט שאינו ספציפי, לריכוז סופי של 10 מיליליטר / ק"ג בנפח כולל של מדיום מלא יקוציט 1 מיליליטר לכל טוב.
   1. Alternativאיליי, כדי לעורר להפעלה של לימפוציטים מסוג T במיוחד: להשתמש α-CD3 / 28 microbeads ולהוסיף לשיתוף תרבות שני התאים כדי להשיג יחס הלימפוציטים חרוז לT של 1: 1.
5. לביקורת שלילית, צלחת 500,000 PBMCs / טובה (או אוכלוסיית יקוציט מפעיל מסוימת; צפיפות תאים: 250,000 לויקוציטים / ² סנטימטר) בצלחת 24 גם עם בינוני מלא יקוציט רק 1 מיליליטר; לביקורת חיובית, בנוסף לציפוי אותו המספר של PBMCs / טוב, להוסיף PHA לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר.
6. ב -3 ויום 5 בניסוי שיתוף התרבות, להעריך התפשטות של לויקוציטים כותרת CFSE (ממוקם בצינורות עגולים התחתון) על ידי ניתוח התזרים cytometric ¹⁷ עם מסנני 488 עירור ננומטר ופליטה מתאימים להעמסה.
   הערה: מכתים ציטוקינים תאיים לניתוח התזרים cytometric יכול להתבצע גם לויקוציטים כותרת CFSE אלה בשלב זה להעריך לשינויים בפרופיל ביטוי ציטוקינים יקוציט כמוdulated ידי MSCs. מאז CFSE מוערך עם מסנן מתאים להעמסה, הנוגדנים שנבחרו להעריך ציטוקינים שונים צריכים להיות מצומדת לfluorochromes האחר מאשר העמסה או ספקטרום דומה (כלומר, Phycoerythrin, peridinin מורכב חלבון כלורופיל (PerCP)).

6. וריאציה: מגנטי Assay דיכוי מפעיל חרוזים נבחר, MSC-induced המערכת החיסוני Leukocytes על הופעל תאי מפעיל CD4 ⁺ T שכותרת CFSE

1. MSCs זרע ב250,000 תאים ב 3 מיליליטר של מדיום שלם MSC ב6-גם צלחות (צפיפות MSC: 25,000 תאים / ² סנטימטר) לO המצורף / N בחממה 37 ° C, המאפשרים לתאי הגזע כדי להגיע למפגש 80%. לפחות 3 6-גם צלחות נחוצות כדי להבטיח PBMCs MSC-cocultured מספיק לבחירה תת-אוכלוסייה.
2. בינוני לשאוב, ולהוסיף PBMCs מופרד לפי שלב 1 אבל ב6-גם צלחות על 2.5 x 10 ⁶ תאים / טוב (צפיפות תאים: 250,000 leukocytes / ² סנטימטר) עם 3 מיליליטר של מדיום מלא לויקוציטים. שיתוף תרבות ל48-72 שעות בחממה 37 ° C.
3. מגנטי חרוז-לבחור אוכלוסייה ספציפית של לויקוציטים המושרה MSC המערכת החיסונית (כלומר, CD14 ⁺ תאים) לפי סעיפים 2-3.
   הערות: מכתים ציטוקינים תאיים לניתוח התזרים cytometric יכולות להתבצע בשלב זה להעריך לשינויים בפרופיל ציטוקינים יקוציט ביטוי, כלומר, ביטוי של interleukin-10-כמווסת על ידי MSCs.
4. הוסף כותרת CFSE תאי CD4 ⁺ T אלוגנאית שנוצרו כאמור בסעיף 2-4 בלוחות 24 גם ב 1 מיליליטר של (צפיפות תאי T: 250,000 תאים / ² סנטימטר) יקוציט שלמה בינוניים לויקוציטים המושרה MSC-נבחר חרוז ביחסים שונים , כלומר, 01:10, 1: 5, 1: 2, ו- 1: 1 (תא לתא) יחסים.
5. כדי לעורר תאי CD4 ⁺ T, להוסיף α-CD3 / 28 microbeads מצומדות לקבל יחס חרוז אל התא של 1: 1.
6. לביקורת שלילית, צלחת 500,000 תאי CD4 ⁺ T / גם ב( צפיפות תאי T: 250,000 תאים / ² סנטימטר) 24 גם צלחת עם בינוני מלא יקוציט רק 1 מיליליטר; לביקורת חיובית, בנוסף לציפוי אותו המספר של תאי CD4 ⁺ T / טוב, להוסיף α-CD3 / 28 microbeads מצומדות לקבל יחס חרוז אל התא של 1: 1.
7. ביום ³ בשיתוף התרבות, להעריך התפשטות של תאי שכותרתו CFSE CD4 ⁺ T (ממוקמים בצינורות עגולים התחתון) על ידי ניתוח cytometric זרימה ¹⁶ עם מסנני 488 עירור ננומטר ופליטה מתאימים להעמסה.

תוצאות

איור 1 מציין את הסכימה הכוללת של הניסוי, ואיור 2 מדגים את המראה של תנאי תרבית תאים השונים כמו דמיינו ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד הפוך. MSCs הם תאים חסיד עם fibroblastic, מורפולוגיה דמוית כישור, ואילו PBMCs ולויקוציטים הם תאים שאינם חסיד עגולים קטנים. שני סוגי התאים שונים מורפ?...

Discussion

Increasingly, the immunomodulatory properties of MSCs are being translated into clinical use more rapidly than the multilineage capacity of these stem cells^18-20. Thus, co-culture techniques of MSCs with leukocytes and assays to evaluate immune function are important to further delineate the specific mechanisms involved in these properties for optimizing effective therapeutic application.

One of the most critical technical aspects for success in these assays is having adequate PBMC...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00 AG	Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE)	Life Technologies	V12883	Cellular label for detection of cell division
Phytoagglutinin (PHA)	Sigma	L8902	Activation of human PBMCs
Dynabeads Human T-Activator CD3/28	Life Technologies	111.32D	Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc.
autoMACS™ Separator	Miltenyi Biotec	autoMACS™ Separator	Magnetic based cell separator
autoMACS® Columns	Miltenyi Biotec	130-021-101	separation columns
CD14 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs
CD4 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-101	For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875	Human PBMC/leukocyte culture medium
DMEM, Low glucose, pyruvate	Life Technologies	11885	Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium
L-glutamine	Life Technologies	25030-081	Supplementation for MSC complete medium
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium
Fetal bovine serum (FBS)	1) Hyclone, for MSC culture                   2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations)	1) SH30070.03M 2) 10091-148	Pre-test lots for support of MSC in vitro culture
24-well cell culture plate	Corning	COR3524	Co-culture plate
50 ml centrifuge tube	Corning	430291	Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS
15 ml centrifuge tube	Corning	430766	Collection of the labeled and unlabeled cell fractions
Round-bottom tubes	BD Falcon	352008	Collection of cells for flow cytometric analysis