Évaluation de la propriétés immunomodulatrices des mésenchymateuses humaines cellules souches (MSC)

Résumé

Les propriétés immunomodulatrices des cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC) apparaissent de plus en plus pertinentes pour l'application clinique. L'utilisation d'un système de co-culture de cellules souches mésenchymateuses et leucocytes du sang périphérique pré-colorées avec le succinimidyl ester de carboxyfluorescéine fluorescent du colorant (CFSE), nous décrivons l'évaluation de l'immunomodulation MSC in vitro sur la prolifération des leucocytes et effectrice des sous-populations spécifiques.

Résumé

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC) sont somatiques progéniteurs qui peuvent se différencier en lignées mésodermiques paraxiaux de l'os, le cartilage, le tissu adipeux et ^4/1, ainsi que de quelques lignées extramesodermal ^5. Première isolé de la moelle osseuse adulte, ces progéniteurs multilignée ont été trouvés dans de nombreux tissus ^6-8 et, de façon inattendue, montré pour avoir des propriétés immunomodulatrices fortes qui apparaissent prête très bien à l'application clinique ^9-12. Mécanismes détaillés impliqués dans les effets immunomodulateurs sont activement à l'étude pour une application efficace des entités pathologiques spécifiques. Une des façons les plus simples pour évaluer l'immunomodulation est en évaluant pour la suppression de la prolifération des leucocytes effecteur ^13. La plupart des leucocytes effectrices telles que les monocytes et les lymphocytes T prolifèrent prodigieusement lorsqu'elles sont stimulées ou activées. Fonction immunomodulatrice peut être évaluée lorsque la suppression deprolifération est mis en évidence.

Traditionnellement, les leucocytes effecteur prolifération a été évaluée par détection de ^la [3H] thymidine dans l'ADN. Cependant, cette méthode présente des inconvénients importants en raison des préoccupations de rayonnement et de l'utilisation post-élimination, ainsi que l'équipement complexe nécessaire. Bien qu'il existe des dosages non radioactifs pour évaluer la prolifération cellulaire, l'ester carboxyfluorescéine succinimidyl (CFSE) dosage présente d'autres avantages tels que permettant l'identification de populations cellulaires spécifiques, ce qui est particulièrement utile dans des expériences de co-culture impliquant plusieurs types de cellules. CFSE est un colorant fluorescent cellulaire qui peut être évaluée par analyse de cytométrie en flux. Comme les cellules se divisent, l'intensité de cette étiquette cellulaire est diminuée proportionnellement; cette détermination permet non seulement de la prolifération cellulaire en général, mais aussi permet d'évaluer le nombre de divisions cellulaires jusqu'à 8 divisions avant la fluorescence devient difficile de detect contre signal de fond. En outre, la stabilité du CFSE fluorescent permet un suivi in vivo de cellules marquées telles que les cellules peuvent être trouvées à de nombreux mois ^14.

Ce test peut également être modifiée pour évaluer des types spécifiques de leucocytes effectrices ou la fonction immunomodulatrice de populations spécifiques de MSC induite par les leucocytes, tels immunomodulateurs comme l'interleukine-10 (IL-10) la production de ^monocytes CD14 + ¹⁵ en effectuant magnétique bourrelet sélection de marqueur de surface de populations de cellules d'intérêt avant ou après la co-culture selon le cas. Notre protocole décrit l'essai de base de l'évaluation des effets immunomodulateurs de MSC sur les leucocytes effectrices (organigramme représenté sur la figure 1) et une variation sur ce test de base pour l'évaluation du MSC-induite immunomodulation de leucocytes sur CD4 ⁺ lymphocytes T effecteurs allogéniques (organigramme représenté la figure 4).

Protocole

Le consentement éclairé du patient, tel qu'approuvé par le conseil d'examen institutionnel doit être obtenue pour l'utilisation de cellules humaines.

1. Densité isolement Gradient de cellules mononucléaires du sang périphérique humain (CMSP)

1. Ajouter 25 ml du sang total hépariné dans un tube de 50 ml par 25 ml d'une pipette.
   1. Diluer les cellules avec 25 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
2. Ajouter 15 ml d'un gradient de densité Ficoll-Paque dans un nouveau tube de 50 ml, et tout en inclinant le tube, très lentement et avec précaution ajouter à 25 ml de la suspension cellulaire diluée sur le gradient de densité de sorte qu'il n'y a pas de mélange du sang entier avec le gradient de densité, à savoir., pas de perturbation de l'interface gradient de densité du sang.
3. Centrifugeuse la suspension de l'étape 1.2 à 400 g pendant 30 à 40 min dans un balancement rotor libre à température contrôlée, sans frein à 20 ° C.
   Remarque: Trois couches distinctes doivent être apparente après centrifugation: ee couche supérieure étant plasma; la couche inférieure étant clairement le gradient de densité Ficoll-Paque; et une mince couche cellulaire, du milieu étant les CMSP
4. Aspirer et jeter la couche supérieure par aspiration avec une pipette Pasteur, avec un soin de ne pas perturber la couche d'interphase de cellules mononucléaires (ie, lymphocytes, monocytes et les plaquettes).
5. Recueillir soigneusement cette couche de cellules mononucléaires avec une pipette de 10 ml à 50 ml d'un nouveau tube de centrifugation.
6. Remplir le tube avec 20 ml de PBS, bien mélanger, et centrifuger à 300 g pendant 10 min à 20 ° C. Retirer le surnageant complètement après centrifugation.
7. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 20 ml de PBS et on centrifuge à 200 g pendant 10 à 15 min à 20 ° C. Retirer le surnageant complètement après centrifugation.
   Remarque: Cette étape élimine les plaquettes qui sont-indésirables au sein de la CMSP; cette étape peut être répétée pour assurer une élimination complète des plaquettes.
8. Si aucune sélection de populations spécifiques eston le désire, culot de cellules de remettre en suspension dans des leucocytes du milieu complet (10% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de L-glutamine et 1% de pénicilline / streptomycine dans un milieu RPMI-1640) pour la culture après avoir effectué une numération des cellules ¹⁶ de suspension 1 ml de moyen par 10 ⁷ PBMC avant de passer à l'étape suivante.

2. marquage magnétique des leucocytes populations (passez à l'étape 4 si aucune sélection des populations spécifiques est requis)

1. Centrifugeuse CMSP suspension à 300 g pendant 10 min et aspirer le surnageant complètement.
2. Resuspendre le culot cellulaire dans 80 pi de PBS par 10 ⁷ cellules totales.
3. Ajouter 20 pi de billes magnétiques spécifiées (c.-à-billes magnétiques CD14 pour l'isolement des monocytes, des billes magnétiques CD4 pour l'isolement de lymphocytes T) par 10 ⁷ cellules totales.
4. Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes à 2 à 8 ° C au réfrigérateur.
5. Ajouter 1-2 ml de PBS par 10 ⁷ cellules pour se laver, et centrifugerà 300 xg pendant 10 min.
6. Aspirer le surnageant complètement et remettre en suspension jusqu'à 10 ⁸ cellules dans 500 pi de PBS.

3. Sélection magnétique des sous-populations leucocytaires

Remarque: Une variété de séparateurs et des colonnes de billes magnétiques sont disponibles pour l'isolement de la population spécifique de leucocytes par le marqueur de surface cellulaire à partir d'un certain nombre de fabricants. L'isolement peut être par sélection positive à base d'un ou de quelques marqueurs positifs ou négatifs de sélection après l'épuisement des populations non désirées. Une approche générale pour effectuer la sélection positive en utilisant un marqueur (c.-à-CD4 des lymphocytes T auxiliaires, ou pour les monocytes CD14) est décrit ci-dessous.

1. Préparer et séparateur magnétique PRIME, notamment la colonne de séparation selon les instructions du fabricant.
2. Appliquer tube contenant l'échantillon de PBMC étiquetés. Fournir deux tubes de 15 ml de centrifugeuses pour la collecte et de l'unlabel marqué positivementfractions cellulaires ed, en suivant les instructions du fabricant.
3. Compter le nombre de cellules ^{15 et} remettre en suspension les leucocytes sélectionnés positive (soit ^lymphocytes T CD4 + ou ^cellules CD14 +) dans leucocytes milieu complet, en utilisant 1 ml de milieu par 10 ⁷ cellules.

4. CFSE coloration des leucocytes pour l'évaluation de la prolifération

Remarque: CFSE a été largement utilisé dans les enquêtes immunologiques, à la fois in vivo et des études in vitro. Notre protocole a été optimisé pour l'étude in vitro de MSC / CMSP (ou d'autres leucocytes) interactions. Bien que les étapes générales impliquées dans la conduite de CFSE marquage in vitro sont similaires, il peut y avoir des différences dans la dose et le calendrier spécifique du protocole ^14. Cela peut être dû à un certain nombre de facteurs, à savoir, le type de cellule spécifique utilisé, le nombre de cellules utilisées qui peuvent probablement-affecter l'intensité du signal de fluorescence CFSE.

1. Diluer la solution stock CFSE (10 mM) dans du PBS à la concentration de travail désirée de 10 pm (solution CFSE-travail). Préparer 10 ⁷ cellules (c.-à-CMSP ou cellules T) pour l'étiquetage de la solution CFSE-travail.
2. Centrifuger à 300 g pendant 10 min pour obtenir un culot cellulaire et aspirer le surnageant.
3. Remettre les cellules doucement dans 1 ml de solution préchauffé (37 ° C) CFSE-travail et incuber les cellules pendant 10 min à 37 ° C.
4. Pour laver l'excès de CFSE, diluer la suspension cellulaire avec 10x (en volume) de pré-refroidie (4 ° C) du milieu RPMI contenant 10% de FBS. Sédimenter les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min et jeter le surnageant. Laver deux fois plus le culot cellulaire de cette manière.
5. Re-sédimenter les cellules par centrifugation et de compter le nombre de cellules ^15. Reprendre 10 ⁷ cellules (soit PBMC ou cellules T) dans 1 ml de milieu complet frais de leucocytes préchauffé.

5. Co-culture de MSC avec des leucocytes et l'activation des leucocytes

1. Moyen de pré-chaud MSC complet (FBS à 10% (pré-testé pour la croissance des MSC optimal), 1% de L-glutamine et 1% de pénicilline / streptomycine dans un milieu DMEM-bas milieu de glucose) à 37 ° C pendant pas plus de 30 min.
2. MSC de semences à 50.000 cellules dans 1 ml de MSC du milieu complet dans des plaques de 24 puits (densité de MSC: 25.000 cellules / cm ²⁾ pour la fixation O / N dans un incubateur à 37 °, ce qui permet aux cellules souches pour atteindre 80% de confluence.
3. Milieu de Aspirer, et sur la base des numéros de MSC graines, ajouter CMSP CFSE-marqués (préalablement marquée-s'il vous plaît se référer à protocole Étape 4 ci-dessus) à la CSM cultivées (ensemencées la veille dans des plaques à 24 puits) dans 1 ml de leucocytes milieu complet à un 01:10 (rapport des cellules) de rapport de co-culture de cellules souches mésenchymateuses à PBMC.
4. Ajouter la phytohémagglutinine mitogène (PHA), un activateur de leucocytes non spécifique, à une concentration finale de 10 pg / ml dans un volume total de 1 ml de milieu complet leucocytes par puits.
   1. Alternatively, afin de stimuler l'activation des lymphocytes T en particulier: utiliser des a-CD3 / 28 microbilles et ajouter à la co-culture de deux cellules pour obtenir un rapport de 1 à billes-T-lymphocyte: 1.
5. Pour le contrôle négatif, plaque 500.000 PBMC / puits (ou une population spécifique effecteur des leucocytes; densité cellulaire: 250.000 leucocytes / cm ²⁾ dans une plaque de 24 puits avec 1 ml de milieu complet de leucocytes seulement; pour le contrôle positif, en plus de placage le même nombre de cellules PBMC / puits, ajouter PHA à une concentration finale de 10 pg / ml.
6. Dans le troisième et cinquième jours de l'expérience de co-culture, d'évaluer la prolifération des leucocytes marqués par CFSE (placées dans des tubes à fond rond) par analyse de cytométrie en flux ¹⁷ avec 488 nm excitation et d'émission appropriés pour les filtres de fluorescéine.
   Note: coloration des cytokines intracellulaires pour l'analyse par cytométrie en flux peut également être effectuée à ces leucocytes CFSE marqué à ce point pour évaluer les changements de leucocytes cytokine profil d'expression comme modulated par les CSP. Depuis CFSE est évaluée avec un filtre approprié à la fluorescéine de, les anticorps choisis pour évaluer diverses cytokines ont besoin d'être conjugués à des fluorochromes autres que la fluorescéine ou spectre similaire (à savoir, la phycoérythrine, péridinine complexe protéique de la chlorophylle (PerCP)).

6. Variation: effecteur répression Assay Magnetic Bead-sélectionné, MSC-induite immunomodulateur leucocytes sur CFSE-étiquetés cellules ^T CD4 + effecteurs activés

1. MSC de semences à 250.000 cellules dans 3 ml de MSC du milieu complet dans des plaques 6 puits (densité MSC: 25.000 cellules / cm ²⁾ pour la fixation O / N dans un incubateur à 37 °, ce qui permet aux cellules souches pour atteindre 80% de confluence. Au moins 3 plaques de 6 puits sont nécessaires pour assurer suffisamment de PBMC MSC-cocultivés pour la sélection des sous-population.
2. Aspirer le milieu et ajouter CMSP séparés que par étape 1, mais dans des plaques 6 puits à 2,5 x 10 ⁶ cellules / puits (densité cellulaire: 250.000 leukocytes ^/ cm 2) avec 3 ml de milieu complet leucocytes. Co-culture pour les 48-72 heures dans un incubateur à 37 ° C.
3. Billes magnétiques sélectionner population spécifique de leucocytes immunomodulateurs MSC-induites ^{(c.-à-cellules} CD14 +), conformément aux articles 2-3.
   Notes: coloration des cytokines intracellulaires pour l'analyse par cytométrie en flux peuvent être effectuées à ce stade d'évaluer les changements de leucocytes cytokine profil d'expression, à savoir, l'expression de l'interleukine-10 comme modulés par MSC.
4. Ajout CFSE marqué ^cellules T CD4 + allogéniques générés par les sections 2-4 dans des plaques à 24 puits dans 1 ml de complète (densité de cellules T: 250.000 cellules / cm ²⁾ moyen leucocytes aux leucocytes MSC-induites perles sélectionnées selon divers rapports , à savoir, 1:10, 1: 5, 1: 2 et 1: 1 (cellule à cellule) ratios.
5. Pour stimuler les cellules ^T CD4 +, CD3 ajouter a- / 28 microbilles conjuguées à obtenir un rapport bille à cellule de 1: 1.
6. Pour un contrôle négatif, plaque 500.000 ^cellules T CD4 + / puits dans un (densité de cellules T: 250.000 cellules / cm ²⁾ plaque de 24 puits avec 1 ml de milieu complet de leucocytes seulement; pour le contrôle positif, en plus de placage le même nombre de ^cellules T CD4 + / puits, ajouter des a-CD3 / 28 microbilles conjuguées à obtenir un rapport bille à cellule de 1: 1.
7. Sur le ³ ème jour de co-culture, d'évaluer la prolifération des cellules ^T CD4 + CFSE-marqués (placées dans des tubes à fond rond) par l'écoulement analyse cytométrique ¹⁶ avec 488 nm excitation et d'émission des filtres appropriés pour la fluorescéine.

Résultats

La figure 1 représente le schéma d'ensemble de l'expérience, et la figure 2 illustre l'aspect des différentes conditions de culture cellulaire en tant que visualisées par contraste de phase inversé microscopie. MSC sont des cellules adhérentes avec un fibroblastique, la morphologie en forme de fuseau, tandis que les PBMC et les leucocytes sont de petites cellules non adhérentes rondes. Ces deux types de cellules morphologiquement différents peuvent être clairement vus dans la co-cultur...

Discussion

Increasingly, the immunomodulatory properties of MSCs are being translated into clinical use more rapidly than the multilineage capacity of these stem cells^18-20. Thus, co-culture techniques of MSCs with leukocytes and assays to evaluate immune function are important to further delineate the specific mechanisms involved in these properties for optimizing effective therapeutic application.

One of the most critical technical aspects for success in these assays is having adequate PBMC...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00 AG	Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE)	Life Technologies	V12883	Cellular label for detection of cell division
Phytoagglutinin (PHA)	Sigma	L8902	Activation of human PBMCs
Dynabeads Human T-Activator CD3/28	Life Technologies	111.32D	Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc.
autoMACS™ Separator	Miltenyi Biotec	autoMACS™ Separator	Magnetic based cell separator
autoMACS® Columns	Miltenyi Biotec	130-021-101	separation columns
CD14 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs
CD4 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-101	For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875	Human PBMC/leukocyte culture medium
DMEM, Low glucose, pyruvate	Life Technologies	11885	Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium
L-glutamine	Life Technologies	25030-081	Supplementation for MSC complete medium
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium
Fetal bovine serum (FBS)	1) Hyclone, for MSC culture                   2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations)	1) SH30070.03M 2) 10091-148	Pre-test lots for support of MSC in vitro culture
24-well cell culture plate	Corning	COR3524	Co-culture plate
50 ml centrifuge tube	Corning	430291	Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS
15 ml centrifuge tube	Corning	430766	Collection of the labeled and unlabeled cell fractions
Round-bottom tubes	BD Falcon	352008	Collection of cells for flow cytometric analysis