인간 중간 엽 줄기 세포의 면역 속성 (MSCS)의 평가

요약

인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 면역 특성은 임상 응용 프로그램에 대해 점점 더 관련이 나타납니다. 형광 염료 카르복시 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE)로 미리 염색 엽 줄기 세포 및 말초 혈 백혈구의 공존 배양 시스템을 사용하여, 우리는 이펙터 백혈구 증식 및 특정 부분 집단에 MSC의 면역의 시험 관내 평가를 설명한다.

초록

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

서문

인간 중간 엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 몇 extramesodermal 계통 ^5뿐만 아니라, 뼈, 연골 및 지방 조직 ^1-4의 근축 중배엽 계통으로 분화 할 수 체세포 조상이다. 먼저 성인의 골수에서 분리,이 multilineage 조상은 지금 임상 응용 프로그램 ^9-12에 매우 의무 표시 강한 면역 특성을 보여, 예기치 않게, 많은 조직 ^6-8에서 발견되었다. 면역 효과에 관련된 자세한 메커니즘은 적극적으로 특정 질병의 실체에 효과적인 적용을 위해 연구되고있다. 면역을 평가하는 가장 간단한 방법 중 하나는 이펙터 백혈구 증식 ^(13)의 억제에 대해 평가하는 것이다. 자극 또는 활성화되면 이러한 T 림프구 및 단핵구와 같은 대부분의 이펙터 백혈구는 비범 증식. 면역 기능이 평가 될 수있는 경우의 진압확산은 입증된다.

전통적으로, 이펙터 백혈구 증식 DNA에 ^[3 H] 티미 딘의 결합 검출에 의해 평가되었다. 그러나,이 방법은 복사 현상 및 후 처리의 이용에 상당한 관심 단점뿐만 아니라, 필요한 복잡한 장비를 갖는다. 세포 증식을 평가하기위한 비 방사능 분석이 있지만, 카르복시 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE) 분석은 여러 유형의 세포를 포함하는 공동 배양 실험에 특히 유용하다 특정 세포 개체수의 식별을 허용하는 다른 이점을 갖는다. CFSE은 유세포 분석에 의해 평가 될 수 셀룰러 형광 염료이다. 세포 분열,이 휴대 라벨의 강도는 비례 적으로 감소된다; 이뿐만 아니라 전반적인 세​​포 증식의 판정을 가능하게 할뿐만 아니라 형광 DET 곤란해진다 전에 8 분할 최대 세포 분열 횟수에 평가를 허용요법 배경 신호에 대하여. 또한, 형광 CFSE의 안정성은 많은 세포가 ¹⁴ 개월까지 가시화 될 수있는 표지 된 세포를 생체 내 추적을 허용한다.

이 분석은 또한 이펙터 백혈구 또는 특정 집단의 면역 기능의 특정 유형을 평가하기 위해 변화 될 수의 자성 비드 표면 마커의 선택을 행함으로써 면역 백혈구 - 인터루킨 10 (IL-10)의 제조 CD14 ⁺ 단핵구 ^15를 MSC를 유발 이전에 또는 적절한 공동 배양 한 후 관심의 세포 집단. 우리 프로토콜 (흐름도가 도시는 (플로우 차트는도 1에 도시) 이펙터 백혈구에서 중간 엽 줄기 세포의 면역 조절 효과를 평가의 기본적인 분석 및 동종 CD4 ⁺ 이펙터 T 림프구에 MSC 유도 백혈구 면역 평가를위한 기본적인 분석의 변형을 설명 그림 4).

프로토콜

기관 심사위원회가 승인 한 환자 동의서는 인간 세포의 사용을 취득해야합니다.

사람 말초 혈액 단핵 세포의 1. 밀도 구배 분리 (PBMC를)

1. 25 mL를 피펫으로 50 ㎖ 튜브에 전체 혈액을 헤파린 25 ML을 추가합니다.
   1. 인산 완충 식염수 (PBS) 25 ㎖로 희석하여 세포.
2. 새로운 50 ㎖ 튜브에 피콜 - 페이크 밀도 구배의 15 mL를 넣고 튜브 틸팅 동안 전혈의 믹싱으로 존재하지 않도록 매우 조심스럽게 천천히는 밀도 구배 위에 희석 세포 현탁액 25 ㎖에 추가 밀도 구배, 즉., 혈액 - 밀도 구배 인터페이스의 방해없이.
3. 원심 분리기 20 ° C에서 브레이크없이 30 온도 조절 스윙 버킷 로터에서 분 40 400 × g에서 1.2 단계에서 정지.
   참고 : 세 가지 층은 원심 분리 후 명백하다 : 일즉 상층 존재 플라즈마; 바닥 클리어 층은 피콜 - 페이크 밀도 구배되며; 및 얇은 층은 중간 셀룰러 PBMC를 되
4. 기음과는 단핵 세포 (즉, 림프구, 단핵구, 혈소판)의 계면 층을 방해하지 않도록주의로, 파스퇴르 피펫으로 흡입하여 상층을 버린다.
5. 조심스럽게 새로운 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 10 ㎖ 피펫이 단핵 세포층을 수집한다.
6. , PBS의 20 ㎖와 튜브를 채우 잘 혼합하고, 20 ℃에서 10 분 동안 300 × g에서 원심 분리기. 원심 분리 후 완전히 뜨는을 제거합니다.
7. 20 ℃에서 10 ~ 15 분 동안 200 × g에서 세포 PBS 20ml에 펠렛을 재현 탁하고 원심 분리기. 원심 분리 후 완전히 뜨는을 제거합니다.
   참고 :이 단계는 혈소판 - 원치 않는-내에서 PBMC를하다을 제거; 이 단계는 혈소판의 완전한 제거를 보장하기 위해 반복 될 수있다.
8. 특정 집단의 선택 범위가 없으면세포 수 ^(16)를 수행 한 후, 배양을 위해 바람직한, 백혈구 완전 배지에 재현 탁 된 세포 펠릿 (10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % L- 글루타민, 1 % 페니실린 / RPMI-1640 배지에서 스트렙토 마이신)을 1 ml의 중단을 다음 단계로 진행하기 전에 10 ⁷ PBMC를 당 매체.

백혈구 인구 2. 자기 라벨링 (특정 집단의 어떤 선택이 필요없는 경우 4 단계로 건너 뜁니다)

1. 완전히 10 분, 흡인 상층 액 300 × g에서 원심 분리기 PBMC 서스펜션.
2. 10 ⁷ 총 세포 당 PBS의 80 μL에 재현 탁 세포 펠렛.
3. 10 ⁷ 총 세포 당 (T 림프구의 분리를위한 단핵 세포, CD4 자석 구슬의 격리를 위해 즉, CD14 자석 구슬) 지정된 자석 구슬의 20 μl를 추가합니다.
4. 잘 섞어 냉장고에 8 ° C에 2에서 15 분 동안 품어.
5. 씻어 10 ⁷ 세포 당 PBS의 1-2 ML을 추가하고, 원심 분리기10 분 동안 300 × g에서.
6. 대기음 상층 액을 완전히 PBS 500 μL에 10 ⁸ 셀을 재현 탁.

백혈구의 부분 집단 3. 자기 선택

참고 : 자기 비드 구분과 열의 다양한 제조 업체의 수와 세포 표면 마커에 의한 백혈구의 특정 인구의 분리에 사용할 수 있습니다. 격리 하나 또는 몇 가지 긍정적 인 마커 또는 원치 않는 인구의 고갈 후 음의 선택에 기반한 선택에 의해 할 수있다. (즉, 단핵구에 대한 CD4 T 헬퍼 림프구에 대한, 또는 CD14) 한 마커를 사용하여 긍정적 인 선택을 수행하는 일반적인 방법은 아래에 설명되어 있습니다.

1. 준비 및 주요 마그네틱 분리기는 제조업체의 지침에 따라 분리 컬럼을 포함.
2. 표시 PBMC를의 샘플이 포함 튜브를 적용합니다. 긍정적으로 표지 및 unlabel의 수집이 15 ml의 원심 분리기 튜브를 제공합니다제조업체의 지침에 따라 에드 셀 분수,.
3. ¹⁰⁷ 세포 당 1 ml의 배지를 이용하여 세포 ^수를 카운트하고 ¹⁵ 백혈구 완전 배지에서 긍정적으로 선택된 백혈구 (예, CD4 ⁺ T 림프구 또는 CD14 ⁺ 세포)를 재현 탁.

대량 살상 무기 확산의 평가를위한 백혈구 4. CFSE 얼룩

주 : CFSE 널리 생체 내 및 시험 관내 연구에서 모두, 면역 학적 조사에 사용되었다. 우리의 프로토콜은 MSC / PBMC (또는 다른 백혈구)의 상호 작용의 체외 연구를 위해 최적화되었습니다. CFSE 체외 라벨을 수행에 관련된 일반적인 단계는 유사하지만, 프로토콜 ^(14)의 특정 용량과 타이밍의 차이가있을 수 있습니다. 이 때문에 다수의 인자, 즉, 사용 된 특정 세포 유형, 세포 수로 사용할 수 있고-있는 가능성 CFSE 형광 신호의 강도에 영향을 미칠 수있다.

1. 10 μm의 (CFSE - 작업 솔루션)의 원하는 작업 농도로 PBS에서 CFSE 주식 솔루션 (10 mm)를 희석. CFSE-작동 용액으로 라벨링 10 ⁷ 세포 (즉, PBMC를 또는 T 세포)를 준비한다.
2. 10 분 동안 300 × g에서 원심 분리기는 세포 펠렛을 얻고 뜨는을 대기음합니다.
3. 부드럽게 예열 (37 ° C) CFSE-작동 용액 1 ㎖로 세포를 재현 탁하고, 37 ℃에서 10 분 동안 세포를 배양한다.
4. 과량 CFSE을 씻어, 예비 냉각 (4 ℃) RPMI 배지를 10 % FBS를 함유하는 (부피 기준)으로 10 배의 세포 현탁액을 희석. 5 분 300 XG에서 원심 분리하여 세포 침전물과 상층 액을 버린다. 두 번 더 이런 방식으로 세포 펠렛을 씻으십시오.
5. 원심 분리하여 세포를 다시 펠렛 세포 수 ^(15)를 계산. 1 ㎖의 백혈구 데워진 신선한 완전 배지에서 10 ⁷ 세포 (PBMC를 또는 T 세포를) 재현 탁.

M 5. 공동 문화백혈구 및 백혈구의 활성화와 희주

1. 이하에서 30 분 동안 37 ° C까지 미리 따뜻한 MSC 완전 배지 (최적 MSC 성장을위한 테스트 된 10 % FBS (), 1 % L- 글루타민, 1 % 페니실린 / DMEM 낮은 포도당 배지에서 스트렙토 마이신).
2. 24 웰 플레이트에서 MSC 완전 배지 1 ㎖에 50,000 세포 (MSC 밀도 : 25,000 세포 ^/ ㎠)에서 시드 엽 줄기 37 ° C의 배양기에 부착 O / N에 대한, 줄기 세포 수는 80 % 합류에 도달한다.
3. 시드 MSC 번호를 기반으로 대기음 매체와는 CFSE 표지 PBMC를 추가 (이전에 표시된 제발 위의 프로토콜 4 단계 참조)에 백혈구 완전 배지 1 ㎖에 (24 웰 플레이트에 전날 시드) 배양 된 중간 엽 줄기 세포에 1시 10분 (셀 비율)로 PBMC를 엽 줄기 세포의 공동 배양 비율.
4. 1 ㎖의 백혈구 완전 배지의 총 부피에서 10 μg의 / ml의 최종 농도로, 미토 겐의 피토 헤 마글 루티 닌 (PHA), 비특이적 백혈구 활성화 제를 추가 웰당.
   1. Alternativ엘리는, 구체적으로 T 림프구의 활성화를 자극하기 위해 : α-CD3 / 28 마이크로 비드를 사용하여 (1)의 비드 간 T 림프구의 비율을 얻기 위해 두 세포 공동 배양에 추가 1.
5. 50 PBMC를 / 웰 음성 대조군, 플레이트 (; 세포 밀도 또는 특정 이펙터 백혈구 인구 : 25 만 백혈구 ^/ ㎠)의 경우 만 1 ㎖의 백혈구 완전 배지와 24 웰 플레이트에; 양성 대조군을 위해, 추가로, PBMC를 웰 / 동일한 수의 도금을 10 μg / ML의 최종 농도로 PHA를 추가한다.
6. 3와 공동 배양 실험 5 일에, 형광에 적합한 488 nm의 여기 및 방출 필터와 유세포 분석 ^(17)에 의해 CFSE 표지 백혈구의 증식 (둥근 바닥 튜브에 배치)을 평가한다.
   주 : 유세포 분석을 위해 세포 내 사이토 카인 염색은 또한 MO 같은 백혈구 사이토 카인 발현 양상의 변화를 평가하기 위해이 시점에서 이러한 CFSE로 표지 백혈구를 위해 수행 될 수있다중간 엽 줄기 세포에 의해 dulated. CFSE이 형광 용 필터에 적절한 평가되기 때문에, 항체는 각종 사이토 카인이 형광 또는 유사한 스펙트럼 이외의 형광 색소에 접합 될 필요가 평가하도록 선택 (즉, 피코 에리 트린, 엽록소 단백질 복합체 (를 PerCP) peridinin).

6. 변화 : 이펙터 억제 분석 마그네틱 활성화 CFSE 표지 이펙터 CD4 ⁺ T 세포에 면역 백혈구를 MSC 유도, 비드 선택

1. 6 웰 플레이트에 MSC 전체 매체의 3 ㎖에 25 만 세포 (MSC 밀도 : 25,000 세포 ^/ ㎠)에서 종자 중간 엽 줄기 세포 37 ° C 배양기에 부착 O / N를 들어, 줄기 세포 수는 80 %의 합류에 도달합니다. 적어도 3 개의 6- 웰 플레이트 모집단 선택 충분한 MSC-PBMC를 공 배양을 보장하기 위해 필요하다.
2. 대기음 매체는, 및 1 단계에 따라하지만 / 웰 (세포 밀도 2.5 × 10 ⁶ 세포에서 6 웰 플레이트에서 분리 PBMC를 추가 : 250,000 르를백혈구 전체 매체의 3 ㎖와 ukocytes ^/ ㎠). 37 ° C 배양기에서 48 ~ 72 시간 동안 공동 문화.
3. 자기 섹션 2-3에 따라 MSC에 의한 면역 백혈구 (즉, CD14 ⁺ 세포)의 특정 인구 비드-선택합니다.
   주 : 유세포 분석을 위해 세포 내 사이토 카인 염색은 백혈구 사이토 카인의 발현 프로필, 즉, 발현의 변화를 평가하기 위해이 시점에서 수행 될 수있다 인터루킨 10와 같은 MSC들에 의해 변조.
4. 24 웰 플레이트 섹션 2-4에 따라 생성 된 동종 CD4 ⁺ T 세포를 CFSE 표지 된 추가 한 백혈구 완전 배지 (T 세포 밀도 250,000 세포 ^/ ㎠) ml의 다양한 비율로 비드 선택된 MSC 유도 백혈구에 즉, 1:10, 1 : 5, 1 : 2, 1 : 1 비율 (셀로 셀).
5. CD4 ⁺ T 세포를 자극하기 위해, (1)의 비드 대 세포 비율을 구하는 α-CD3은 / 28 공액 마이크로 비드를 추가 1.
6. 음성 대조군은 5 판00,000 CD4 ⁺ T 세포 / 웰로 24- 웰 플레이트 (T 세포 밀도 250,000 세포 ^/ ㎠)에 단 1 ㎖의 백혈구 완전 배지와; 양성 대조군을 위해, 추가로 (1)의 비드 대 세포 비율을 구하는 α-CD3은 / 공액 마이크로 비드 (28)를 추가 / 웰의 CD4 ⁺ T 세포의 수를 동일한 도금 : 1이다.
7. 공동 배양 3 ^일째에, 플루오 레세 적합한 488 nm의 여기 및 방사 필터를 사용하여 유세포 분석 ^(16)에 의해 (둥근 바닥 튜브에 배치) CFSE 표지 된 CD4 ⁺ T 세포의 증식을 평가.

결과

도 1은 실험의 전반적인 스키마를 나타내고,도 2는 위상차 도립 현미경으로 가시화로서 다양한 세포 배양 조건의 모양을 보여준다. PBMC를하고 백혈구가 작은 원형 비 부착 세포 반면 중간 엽 줄기 세포는 섬유 모세포, 스핀들 모양의 형태와 부착 세포이다. 이 두 형태 학적으로 상이한 세포 유형은 명확 공존 배양에서 볼 수있다. 시험의 끝에, PBMC를 (또는 leuckotyes)를 유세포위한 흡인 될 ?...

토론

Increasingly, the immunomodulatory properties of MSCs are being translated into clinical use more rapidly than the multilineage capacity of these stem cells^18-20. Thus, co-culture techniques of MSCs with leukocytes and assays to evaluate immune function are important to further delineate the specific mechanisms involved in these properties for optimizing effective therapeutic application.

One of the most critical technical aspects for success in these assays is having adequate PBMC...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00 AG	Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE)	Life Technologies	V12883	Cellular label for detection of cell division
Phytoagglutinin (PHA)	Sigma	L8902	Activation of human PBMCs
Dynabeads Human T-Activator CD3/28	Life Technologies	111.32D	Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc.
autoMACS™ Separator	Miltenyi Biotec	autoMACS™ Separator	Magnetic based cell separator
autoMACS® Columns	Miltenyi Biotec	130-021-101	separation columns
CD14 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs
CD4 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-101	For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875	Human PBMC/leukocyte culture medium
DMEM, Low glucose, pyruvate	Life Technologies	11885	Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium
L-glutamine	Life Technologies	25030-081	Supplementation for MSC complete medium
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium
Fetal bovine serum (FBS)	1) Hyclone, for MSC culture                   2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations)	1) SH30070.03M 2) 10091-148	Pre-test lots for support of MSC in vitro culture
24-well cell culture plate	Corning	COR3524	Co-culture plate
50 ml centrifuge tube	Corning	430291	Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS
15 ml centrifuge tube	Corning	430766	Collection of the labeled and unlabeled cell fractions
Round-bottom tubes	BD Falcon	352008	Collection of cells for flow cytometric analysis