人骨髓间充质干细胞（干细胞）的免疫调节性能评估

摘要

人类骨髓间充质干细胞（MSC）的免疫调节属性显示越来越重要的临床应用。用MSC和外周血白细胞的共同培养系统的预染色的荧光染料羧基琥珀酰亚胺酯（CFSE），我们描述对效应白细胞增殖和特定亚群的体外评估的MSC免疫调节的。

摘要

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

引言

人间充质干细胞（MSCs）是体祖细胞可以分化成骨，软骨和脂肪组织^1-4的近轴中胚层谱系，以及几extramesodermal谱系^5。首先从成人骨髓中分离，这些多谱系祖细胞现已发现在多种组织和^6-8，出乎意料的是，显示出具有出现高度适合于临床应用^9-12强免疫调节性能。参与免疫调节作用的详细机制正在积极研究对特定病种有效的应用。其中一个最简单的方式来评估免疫调节是通过评估的效应白细胞增殖¹³的抑制。大多数效应白细胞，如T淋巴细胞和单核细胞增生不歇刺激或激活时。免疫调节功能，可以评估时抑制增殖证明。

传统上，效应白细胞增殖进行了评价通过检测^的 [3 H]胸苷掺入DNA中。然而，这种方法具有缺点显著由于辐射和后期使用处置的关注，以及所需要的复杂的设备。虽然有非放射性测定法来评估细胞增殖，所述羧基琥珀酰亚胺酯（CFSE）测定具有其它优点，如允许识别特定细胞群，这是在涉及多种细胞类型的共培养实验中特别有用的。 CFSE是荧光染料的细胞可以通过流式细胞术分析来评估。作为细胞分裂时，这种细胞标记的强度成比例地降低;这不仅使得能够确定的总的细胞增殖，但也允许对细胞分裂的高达8分割的数目评估前的荧光变得难以DET等针对背景信号。此外，该荧光CFSE的稳定性允许在体内跟踪，使得细胞可以可视化长达很多个月¹⁴标记的细胞。

该测定也可以改变，以评估特定类型的效应子白细胞或特定人群的免疫调节功能的MSC诱导的免疫调节白细胞，如白介素-10（IL-10）产生的CD14 ^{+单核细胞 15}通过执行的磁珠表面标记选择之前或共培养适当的利息后的细胞群。我们的协议描述评估对效应白细胞MSCs的免疫调节作用（ 图 1中所示的流程图）的基本测定，并在此基础测定法对异源CD4 ^+效应 T淋巴细胞的MSC诱导的白细胞免疫调节评价的变型（图中所示的流程图在图4中）。

研究方案

必须使用人体细胞获得批准的机构审查委员会患者的知情同意书。

人外周血单个核细胞1.密度梯度分离（外周血单个核细胞）

1. 加25 ml的肝素化全血到50ml管由25毫升吸管。
   1. 稀释细胞用25ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）的。
2. 新增15 ml的菲可 - 帕克密度梯度到一个新的50ml管中，并在倾斜的管，非常缓慢并小心地在25毫升的稀释的细胞悬浮液在密度梯度的添加使得存在没有混合的全血与密度梯度， 即 ，无干扰的血液密度梯度的接口。
3. 离心从步骤1.2以400×g的30至40分钟，在温度控制的吊桶式转子无制动器在20℃的悬浮液中。
   注意:在离心后三个不同的层应当是显而易见:第Ë上层存在等离子体;底部的透明层作为菲可 - 帕克密度梯度;和薄的，中间层的细胞作为PBMC中
4. 吸液和丢弃通过抽吸上层用巴氏吸管，小心不要打扰单核细胞（ 即，淋巴细胞，单核细胞和血小板）的相间层。
5. 仔细收集这种单核细胞层用10毫升吸管到一个新的50ml离心管中。
6. 填充用20毫升的PBS管，混的不好，离心300×g的10分钟，在20°C。离心后完全除去上清液。
7. 重悬细胞沉淀在20ml的PBS中并在离心机200×g下在20℃下10-15分钟。离心后完全除去上清液。
   注:此步骤除去血小板，这是不必要的，内部的外周血单个核细胞;这个步骤可以重复，以确保完全除去血小板。
8. 如果没有选择特定的人群是需要的话，在白细胞完全培养基重悬细胞沉淀（10％胎牛血清（FBS），1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基）用于培养进行细胞计数¹⁶后，暂停1毫升每¹⁰ 7 PBMC的介质在进行下一步骤之前。

白细胞种群2.磁标记（跳至步骤4如果没有选择特定人群是必需的）

1. 离心机的PBMC悬浮液在300×g的10分钟，吸出上清液完全。
2. 悬浮细胞沉淀在80微升PBS每10 ⁷个细胞。
3. 加入20微升指定磁珠（即，CD14磁珠隔离单核细胞，CD4磁珠的T淋巴细胞隔离）每¹⁰ 7个细胞。
4. 拌匀，孵育15分钟，在2〜8℃的冰箱里。
5. 加1-2毫升的PBS每¹⁰ 7个细胞进行冲洗，并且离心分离机在300×g的10分钟。
6. 吸上清完全和悬浮高达¹⁰ 8个细胞在500微升PBS。

白细胞亚群的3磁选

注意:各种磁珠分离器和列可用于白细胞的特定人口的隔离通过细胞表面标记从许多制造商。隔离可以通过基于一个或几个正标记或由意外的种群耗尽后负选择阳性选择。进行正选择使用一个标记（ 即，CD4的T辅助淋巴细胞或CD14的单核细胞）的一般方法如下所述。

1. 制备和素磁性分离器包括根据制造商的说明分离柱。
2. 应用含有标记的PBMC的样品管中。提供两个15毫升离心管中收集的积极标记和unlabel的编细胞级分，按照生产商的说明。
3. 计数细胞数^15，重悬在白细胞完全培养基的阳性选择的白细胞（例如^，CD4 + T淋巴细胞或CD14 ^{+细胞），}使用1毫升培养基每¹⁰ 7个细胞。

白细胞4. CFSE染色增殖的评估

注意:CFSE已被广泛用于在免疫学调查，对于在体内和体外研究 。我们的协议已经优化，MSC / PBMC（或其他白细胞）相互作用的体外研究。而参与实施CFSE在体外标记的一般步骤是相似的，有可能是在协议^14的特定剂量和定时差异。这可能是由于多种因素，例如，所用的特定的细胞类型，细胞数目用后可容易影响CFSE荧光信号的强度。

1. 稀释CFSE库存溶液（10mM）的PBS，以10μM的（CFSE-工作溶液）所需的工作浓度。制备¹⁰ 7个细胞（即，外周血细胞或T细胞），用于与所述的CFSE工作溶液标记。
2. 离心机在300×g的10分钟以获得细胞沉淀并吸出上清液。
3. 悬浮细胞轻轻在1ml预热（37℃）的CFSE工作溶液，并在37℃下孵育细胞10分钟。
4. 洗去过量的CFSE，（体积）的预冷（4℃）的RPMI培养基含有10％FBS稀释的细胞悬浮液具有10。通过离心沉淀细胞，在300×g离心5分钟，丢弃上清液。洗以这种方式将细胞沉淀两次。
5. 通过离心重新沉淀细胞并计数细胞数目^15。悬浮¹⁰ 7个细胞（无论的PBMC或T细胞）在1ml新鲜预热的白细胞的完全培养基。

的M 5，共培养种姓与白细胞和白细胞的活化

1. 预暖的MSC完全培养基（10％FBS（预测试以获得最佳的MSC生长），1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的DMEM低葡萄糖培养基）至37℃不超过30分钟。
2. 种子的MSC以50,000细胞在1ml的MSC完全培养基中24孔板（MSC密度:25,000个细胞/ ^cm 2）的用于附着O / N在37℃培养箱，允许干细胞达到80％汇合。
3. 吸出培养基，并根据种子的MSC号，添加CFSE标记的外周血单个核细胞（先前标记-请参阅协议上述步骤4）到培养的MSC（接种前一天在24孔平板）的1ml白细胞完全培养基中的一1时10（气泡率）MSCs向的PBMC共培养比率。
4. 添加分裂素植物血凝素（PHA），非特异性白细胞活化剂，以10微克/ ml的终浓度在1毫升白细胞完全培养基的总体积每孔。
   1. 可选择性伊利，刺激对T淋巴细胞的激活具体有:使用α-CD3 / 28微珠，并加入到二细胞共培养，以获得1珠对T淋巴细胞:1的比例。
5. 为阴性对照，板500000的PBMC /孔（或特异性效应白细胞种群;细胞密度:250000白细胞/厘米^2）在一个24孔板用1ml白细胞完全只介质;对于阳性对照，在除了电镀的PBMC /相同数量均匀，加入的PHA到10微克/毫升的最终浓度。
6. 在第三和共培养实验的第5天，评估CFSE标记的白细胞的增殖（置于圆底管）通过流式细胞仪分析¹⁷具有适用于荧光素488纳米激发和发射滤光片。
   注:细胞内细胞因子染色的流式细胞术分析，也可进行对这些CFSE标记的白细胞在这一点上，以评估作为莫变化白细胞的细胞因子表达谱通过干细胞dulated。因为CFSE评价与过滤器适合于荧光素，选择的抗体，以评估各种细胞因子需要被缀合到荧光比荧光素或类似的频谱其他（即，藻红蛋白 ，多甲藻素叶绿素蛋白复合物（PerCP））。

6.变异:效应抑制测定磁珠选择的，MSC诱导的免疫调节白细胞对活性CFSE标记的效应CD4 ^{+ T}细胞

1. 种子的MSCs在250,000个细胞在3ml的MSC完全培养基中6孔板（MSC密度:25,000个细胞/ ^cm 2）的用于附着O / N在37℃培养箱，允许干细胞达到80％汇合。至少3 6孔板是必要的，以确保足够的MSC-共培养的PBMC为亚群的选择。
2. 吸出培养基，并添加的PBMC分离按步骤1，但在6孔板以^2.5×10 6个细胞/孔（细胞密度:250,000勒ukocytes /厘米^2）用3ml白细胞完全培养基。共培养48-72小时在37℃培养箱。
3. 磁珠选择MSC诱导免疫调节白细胞（ 即 CD14 ⁺细胞）根据第2-3特定人群。
   注:细胞内细胞因子染色的流式细胞术分析可以在此时被执行以评估更改中白细胞的细胞因子表达谱， 即，表达白介素-10-如由干细胞调制。
4. 在添加CFSE标记在24孔板产生为每第2-4节异源CD4 ^{+ T细胞} 1 ml的白细胞完全培养基（T细胞密度:250000个细胞/厘米^2），以珠选择的MSC诱导的白细胞在各种比例即，1:10,1:5，1:2和1:1（细胞与细胞）的比例。
5. 刺激^CD4 + T细胞，加入α-CD3 / 28偶联的微珠，以获得1珠-细胞:1的比例。
6. 对于阴性对照，板500000 ^CD4 + T细胞/孔在24孔板（T细胞密度:250000个细胞/ ^cm 2）的用1毫升白细胞完全只介质;对于阳性对照，在除了电镀^CD4 + T细胞的数量相同/孔，加入α-CD3 / 28偶联的微珠，以获得1珠-细胞:1的比例。
7. 上共培养的^第 3天，通过流式细胞仪分析¹⁶具有适用于荧光素488纳米激发和发射滤光片评估CFSE标记的^CD4 + T细胞（置于圆底管）的增殖。

结果

图1表示了实验的总体架构，而图2展示了可视化作为用相差倒置显微镜的各种细胞培养条件的外观。的MSC是贴壁细胞与成纤维细胞，纺锤形的形态，而PBMC和白细胞小圆非贴壁细胞。这两个形态不同的细胞类型，可以清楚地看出，在共培养。在测定结束时，当PBMC中（或leuckotyes）吸出流式细胞仪分析，即使粘附的MSCs无意中包含（即，由于附接不良或移位通过剧烈抽吸），应?...

讨论

Increasingly, the immunomodulatory properties of MSCs are being translated into clinical use more rapidly than the multilineage capacity of these stem cells^18-20. Thus, co-culture techniques of MSCs with leukocytes and assays to evaluate immune function are important to further delineate the specific mechanisms involved in these properties for optimizing effective therapeutic application.

One of the most critical technical aspects for success in these assays is having adequate PBMC...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00 AG	Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE)	Life Technologies	V12883	Cellular label for detection of cell division
Phytoagglutinin (PHA)	Sigma	L8902	Activation of human PBMCs
Dynabeads Human T-Activator CD3/28	Life Technologies	111.32D	Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc.
autoMACS™ Separator	Miltenyi Biotec	autoMACS™ Separator	Magnetic based cell separator
autoMACS® Columns	Miltenyi Biotec	130-021-101	separation columns
CD14 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs
CD4 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-101	For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875	Human PBMC/leukocyte culture medium
DMEM, Low glucose, pyruvate	Life Technologies	11885	Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium
L-glutamine	Life Technologies	25030-081	Supplementation for MSC complete medium
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium
Fetal bovine serum (FBS)	1) Hyclone, for MSC culture                   2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations)	1) SH30070.03M 2) 10091-148	Pre-test lots for support of MSC in vitro culture
24-well cell culture plate	Corning	COR3524	Co-culture plate
50 ml centrifuge tube	Corning	430291	Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS
15 ml centrifuge tube	Corning	430766	Collection of the labeled and unlabeled cell fractions
Round-bottom tubes	BD Falcon	352008	Collection of cells for flow cytometric analysis