ヒト間葉系幹細胞（MSC）の免疫調節特性の評価

要約

ヒト間葉系幹細胞（MSC）の免疫調節特性は、臨床応用のため、ますます関連現れます。蛍光色素カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）で前染色MSCおよび末梢血白血球の共培養系を用いて、我々は、エフェクター白血球の増殖および特定の亜集団におけるMSCの免疫調節のインビトロ評価を記載します。

要約

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

概要

ヒト間葉系幹細胞（MSC）は、いくつかのextramesodermal系統⁵と同様に、骨、軟骨、および脂肪組織^1-4の近軸中胚葉系統に分化することができる体細胞前駆細胞です。まず成人の骨髄から分離され、これらの多前駆細胞は現在臨床応用^9-12に非常に適して表示され、強力な免疫調節特性を有することが示され、予想外に、多くの組織^6-8で発見されています。免疫調節作用に関与する詳細なメカニズムは、積極的に特定の疾患実体の効果的なアプリケーションのために検討されています。免疫調節を評価するための最も簡単な方法の一つは、エフェクター白血球増殖¹³の抑制のための評価によるものです。刺激または活性化されると、このようなTリンパ球や単球などのほとんどのエフェクター白血球がprodigiously増殖します。免疫調節機能を評価することができるときの抑制増殖が明らかです。

伝統的に、エフェクター白血球の増殖は、DNAへの^[3 H]チミジンの取り込みを検出することにより評価しました。しかしながら、この方法は、放射線及び使用後の廃棄の問題、ならびに必要に応じて複雑な装置に起因する重大な欠点を有します。細胞増殖を評価するための非放射性アッセイがあるが、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）アッセイは、複数の細胞型を含む共培養実験に特に有用である特定の細胞集団の同定を可能にするような他の利点を有します。 CFSEは、フローサイトメトリー分析によって評価することができる蛍光細胞の色素です。細胞が分裂するように、この細胞の標識の強度が比例し減少します。これは、全体的な細胞増殖の決意を可能にするだけでなく、蛍光がDETに困難になる前に8分割までの細胞分裂の数を評価するためにできるだけでなく電気ショック療法背景信号に対して。また、蛍光CFSEの安定性は、細胞が何ヶ月¹⁴までの視覚化することができるように標識された細胞のin vivoでの追跡が可能になります。

このアッセイはまた、磁性ビーズの表面マーカーの選択を行うことにより、CD14 ^{+単球 15を生成する} （IL-10）エフェクター白血球またはMSCによって誘導される免疫白血球、インターロイキン10などの特定の集団の免疫調節機能の特定のタイプを評価するために変えることができます前または適切な共培養後に目的の細胞集団。我々のプロトコルは、エフェクター白血球上のMSCの免疫調節効果を評価する基本的なアッセイ（フロー・チャートを図1に示す）と同種CD4 ^{+エフェクター} Tリンパ球上のMSCによって誘導される白血球の免疫調節の評価のためのこの基本的なアッセイの変形（図示フローチャートを説明します図4で）。

プロトコル

施設内倫理委員会によって承認された患者のインフォームドコンセントは、ヒト細胞の使用を取得する必要があります。

ヒト末梢血単核細胞（PBMC）の1の密度勾配分離

1. 25ミリリットルのピペットで50mlチューブに全血をヘパリン化25ミリリットルを追加します。
   1. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）25mlで細胞を希釈します。
2. 新しい50mlのチューブにフィコール - パック密度勾配の15ミリリットルを追加し、チューブを傾けながら、全血のない混合を伴うがないように、非常にゆっくりと慎重に、密度勾配の上に希釈した細胞懸濁液の25ミリリットルを追加密度勾配、 すなわち 、血液の密度勾配界面の乱れ。
3. 遠心分離（20℃）ブレーキなし温度制御スイングバケットローターで30〜40分間グラム×400で、ステップ1.2からサスペンション。
   注：3つの異なる層を遠心分離した後に明らかであるべきである：目プラズマであること電子上層;下部透明層は、フィコール - パーク密度勾配です。薄い、中間の細胞層はPBMCをさ
4. 吸引し、単核細胞 （すなわち、リンパ球、単球、および血小板）の間期層を乱さないように注意して、パスツールピペットで吸引することにより、上層を捨てます。
5. 慎重に新しい50mlの遠心管に10 mlピペットでこの単核細胞層を収集します。
6. 20mlのPBSでチューブを埋める、よく混ぜ、20℃で10分間、300×gで遠心します。遠心分離後、上清を完全に削除します。
7. 20℃で10〜15分間200×gで細胞をPBS 20ml中のペレットと遠心機を再懸濁します。遠心分離後、上清を完全に削除します。
   注：このステップは、血小板-不要内のPBMCですが削除されます。このステップは、血小板の完全な除去を確実にするために繰り返すことができます。
8. 特定の集団のない選択がされていない場合1mlのを停止するセル数^{16を実行した後}の培養のための所望の白血球完全培地中、再懸濁細胞ペレット（10％ウシ胎児血清（FBS）、1％L-グルタミン、およびRPMI-1640培地中に1％のペニシリン/ストレプトマイシン）次のステップに進む前に、10 ⁷のPBMCあたりの媒体。

白血球集団の2磁気標識（特定の集団の選択が必須でない場合は、ステップ4に進んでください）

1. 完全に10分と上清を除去し、300×gで遠心分離PBMC懸濁液。
2. 10 ⁷全細胞あたりのPBS80μlの再懸濁細胞ペレット。
3. 10 ⁷全細胞あたりの指定された磁気ビーズを20μl（単球を単離するための、すなわち、CD14磁気ビーズ、Tリンパ球の単離のためのCD4磁気ビーズ）を追加します。
4. よく混合し、冷蔵庫で2〜8℃で15分間インキュベートします。
5. 洗浄するために10 ⁷個の細胞あたりのPBS 1〜2 mlを加え、遠心10分間、300×gで。
6. 吸引し上清を完全にし、PBS500μlの10 ^8細胞まで再懸濁します。

白血球亜集団の3磁気選択

注意：磁気ビーズセパレータと列の様々なメーカーの数から細胞表面マーカーによって白血球の特定の集団を単離するために利用可能です。分離は、1つまたは少数の正のマーカーにするか、不要な集団の枯渇後にネガティブ選択により基づく正の選択によって行うことができます。 （ すなわち、単球のためのCD4 + Tヘルパーリンパ球のために、またはCD14）は、1つのマーカーを使用して、正の選択を実行する一般的なアプローチは、以下に概説します。

1. 準備し、製造元の指示に従って分離カラムを含むプライム磁気分離器。
2. ラベルされたPBMCのサンプルを含むチューブを適用します。積極標識し、ラベル付け解除の収集のための2つの15ml遠心チューブを提供製造業者の指示に従って、細胞画分を編
3. 10 ^7細胞あたり1mlの培地を用いて、細胞数^を15カウントおよび白血球完全培地中で正に選択白血球（ すなわち、CD4 ⁺ Tリンパ球またはCD14 ⁺細胞）を再懸濁します。

増殖の評価のための白血球の4 CFSE染色

注：CFSEは広くインビボおよびインビトロ 試験の両方のために、免疫学的研究において使用されています。私たちのプロトコルは、MSC / PBMC（または他の白血球）の相互作用のin vitroでの研究のために最適化されています。 CFSE in vitroでラベリングを行うに関わる一般的な手順は似ていますが、プロトコル¹⁴の具体的な用量およびタイミングの違いがあるかもしれません。これは、おそらくCFSE蛍光シグナルの強度に影響を与える可能性が使用される、多くの要因、 すなわち、使用される特定の細胞タイプ、細胞数とすることができます。

1. 10μM（CFSE-作業溶液）の所望の使用濃度になるようにPBSにCFSEストック溶液（10 mm）を希釈します。 CFSE-ワーキング溶液で標識するために10 ⁷ 細胞 （すなわち、PBMCを、またはT細胞）を準備します。
2. 10分間、300×gで遠心分離し、細胞ペレットを得、上清を吸引します。
3. 穏やかに予め温めた（37°C）CFSE加工液1mlで細胞を再懸濁し、37℃で10分間細胞をインキュベートします。
4. 過剰CFSEを洗浄するために、予め冷却（4℃）RPMI培地を10％FBSを含有する（体積で）10倍で細胞懸濁液を希釈します。 5分間300×gの遠心分離により細胞を沈殿物と上清を捨てます。二回以上このようにして細胞ペレットを洗浄します。
5. 遠心分離によって細胞を再ペレット化し、細胞数^{15を数えます} 。 1ミリリットル新鮮予め温め白血球完全培地中10 ⁷細胞（PBMCまたはT細胞のいずれか）を再懸濁します。

Mの5共培養白血球や白血球の活性化とのSC

1. せいぜい30分間37℃でプレ暖かいMSC完全培地（10％FBS（最適なMSCの成長のためにテスト済み）、1％L-グルタミン、およびDMEM低グルコース培地中で1％のペニシリン/ストレプトマイシン）。
2. 24ウェルプレート中のMSCの完全培地1ml中の50,000個の細胞（MSC密度：25,000細胞/ cm ^2）での種子のMSC 37℃のインキュベーター内の添付ファイルのO / Nのため、幹細胞を可能にするには、80％コンフルエンスに到達します。
3. シードされたMSCの番号に基づいて、培地を吸引し、、CFSE標識したPBMCを追加（以前に標識してください上のプロトコル手順4を参照）で白血球完全培地1ml中（24ウェルプレートに、前日に播種）培養したMSCへ午前1時10分（細胞比）のPBMCに対するMSCの共培養比率。
4. ウェルあたり1 mlの白血球完全培地の全容量中10μg/ mlの最終濃度まで、マイトジェンのフィトヘマグルチニン（PHA）、非特異的な白血球の活性化剤を加えます。
   1. Alternativエリーは、特にTリンパ球の活性化のために刺激するために、α-CD3 / 28マイクロビーズを使用して、1のビーズ対Tリンパ球の比率を得るために、2つの細胞の共培養に追加する：1。
5. ネガティブコントロールのために、プレート50万のPBMC /ウェル（または特定のエフェクター白血球の人口;細胞密度25万白血球/ ^cm 2）でのみ1ミリリットル白血球完全培地を含む24ウェルプレート中、陽性対照のために、加えて、よくのPBMC /同じ数のメッキを10μg/ mlの最終濃度にPHAを加えます。
6. 第3回と共培養実験の5日目に、フルオレセインに適した488 nmの励起および発光フィルターを備えたフローサイトメトリー分析によって^17（丸底チューブに入れ）CFSE標識白血球の増殖を評価。
   注：フローサイトメトリー分析のために細胞内サイトカイン染色はまた、Mo等の白血球のサイトカイン発現プロフィールの変化を評価するために、この時点でこれらのCFSE標識白血球に行うことができますMSCのことでdulated。 CFSEは、フルオレセインのフィルタ適切に評価されているので、様々なサイトカインを評価するために選択された抗体は、フルオレセインまたは類似のスペクトル（クロロフィルタンパク質複合体（PerCPを）ペリジニンすなわち、フィコエリトリン）以外の蛍光色素にコンジュゲートされる必要があります。

6.バリエーション：エフェクター抑制アッセイ磁気ビーズ選択、MSCによって誘発される免疫調節白血球活性化CFSE標識エフェクター^CD4 + T細胞上の

1. 6ウェルプレート中のMSCの完全培地3ml中250,000細胞（MSC密度：25,000細胞/ cm ^2）での種子のMSC 37℃のインキュベーター内の添付ファイルのO / Nのため、幹細胞を可能にするには、80％コンフルエンスに到達します。少なくとも3つの6ウェルプレートは、亜集団の選択のための十分なMSC-共培養したPBMCを確保するために必要です。
2. 培地を吸引し、2.5×10 ⁶細胞/ウェル（細胞密度でステップ1の通りが、6ウェルプレートで分離されたPBMCを追加25万ルを白血球完全培地3mLでukocytes ^/ cm 2）でした。 37℃のインキュベーター中で48〜72時間のための共培養。
3. 磁気ビーズ選択セクション2-3のとおり、MSCによって誘発される免疫調節白血球（ すなわち、CD14 ^+細胞 ）の特定の集団を。
   注：フローサイトメトリー分析のために細胞内サイトカイン染色は、白血球のサイトカイン発現プロフィール、 すなわち、の発現の変化を評価するために、この時点で行うことができるインターロイキン10などのMSCによって変調されます。
4. 様々な比でビーズ選択MSC誘導性の白血球：白血球完全培地1ml中の24ウェルプレート内のセクション2-4に従って生成されたCFSE標識同種CD4 ⁺ T細胞（250,000細胞/ ^cm 2のT細胞の密度）が追加しますすなわち、1：10、1：5,1：2、及び1：1（セルのセルに）比。
5. 1：CD4 ⁺ T細胞を刺激するために、1のビーズ対細胞比を得るために、α-CD3 / 28共役マイクロビーズを加えます。
6. ネガティブコントロール、プレート5の場合24ウェルプレート中0万CD4 ⁺ T細胞/ウェル（T細胞密度250,000細胞/ ^cm 2）でのみ1 mlの白血球完全培地と。 1：ポジティブコントロールのために^、CD4 + Tの同じ数をメッキに加えて細胞/ウェルを、1のビーズ対細胞比を得るために、α-CD3 / 28共役マイクロビーズを追加します。
7. 共培養の3 ^日目に、フルオレセインに適した488 nmの励起および発光フィルターを備えたフローサイトメトリー分析により^、16（丸底チューブに入れ）CFSE標識CD4 ⁺ T細胞の増殖を評価します。

結果

図1は、実験の全体的なスキーマを示し、 図2は、位相差倒立顕微鏡によって可視化のような種々の細胞培養条件の外観を示しています。 PBMCおよび白血球が小さな丸い非付着細胞であるのに対し、MSCは、線維芽細胞、紡錘状形態を有する接着性の細胞です。これらの二つの形態学的に異なる細胞型が明らかに共培養に見ることができます。アッセイの終了時に、PBMCを（またはleuckoty...

ディスカッション

Increasingly, the immunomodulatory properties of MSCs are being translated into clinical use more rapidly than the multilineage capacity of these stem cells^18-20. Thus, co-culture techniques of MSCs with leukocytes and assays to evaluate immune function are important to further delineate the specific mechanisms involved in these properties for optimizing effective therapeutic application.

One of the most critical technical aspects for success in these assays is having adequate PBMC...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00 AG	Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE)	Life Technologies	V12883	Cellular label for detection of cell division
Phytoagglutinin (PHA)	Sigma	L8902	Activation of human PBMCs
Dynabeads Human T-Activator CD3/28	Life Technologies	111.32D	Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc.
autoMACS™ Separator	Miltenyi Biotec	autoMACS™ Separator	Magnetic based cell separator
autoMACS® Columns	Miltenyi Biotec	130-021-101	separation columns
CD14 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs
CD4 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-101	For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875	Human PBMC/leukocyte culture medium
DMEM, Low glucose, pyruvate	Life Technologies	11885	Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium
L-glutamine	Life Technologies	25030-081	Supplementation for MSC complete medium
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium
Fetal bovine serum (FBS)	1) Hyclone, for MSC culture                   2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations)	1) SH30070.03M 2) 10091-148	Pre-test lots for support of MSC in vitro culture
24-well cell culture plate	Corning	COR3524	Co-culture plate
50 ml centrifuge tube	Corning	430291	Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS
15 ml centrifuge tube	Corning	430766	Collection of the labeled and unlabeled cell fractions
Round-bottom tubes	BD Falcon	352008	Collection of cells for flow cytometric analysis