סינתזה של nanofiber קראטין מבוסס על הנדסה ביו רפואית

Summary

nanofibers electrospun יש שטח פנים גבוה יחס משקל, שלמות מכנים מעולה, ולתמוך גדילת תא תפוצה. יש nanofibers אלה מגוון רחב של יישומים ביו. כאן אנו לפברק nanofibers קרטין / PCL, באמצעות טכניקה electrospinning, ולאפיין את סיבי עבור יישומים אפשריים בהנדסת רקמות.

Abstract

Electrospinning, בגלל הרבגוניות ואת הפוטנציאל שלה עבור יישומים בתחומים שונים, נמצא בשימוש לעתים קרובות כדי לפברק nanofibers. הפקה של nanofibers הנקבובי אלה היא עניין רב בשל מאפיינים הייחודיים שלהם physiochemical. כאן נפרט על ייצור של קרטין המכיל פולי (ε-caprolactone) (PCL) nanofibers (כלומר, PCL / סיבים מרוכבים קרטין). קרטין נמס במים הופק הראשון שיער אדם מהול PCL ביחסים שונים. הפתרון מעורבב של PCL / קרטין הפך ממברנות nanofibrous באמצעות electrospinning תוכנן מעבדה להגדיר. מורפולוגיה סיבים תכונות מכניות של nanofiber השיג נצפו ונמדדו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בודק מתיחה. יתר על כן, נכסים פריקים והכימיים של nanofiber נחקרו על ידי FTIR. תמונות SEM הראו מורפולוגיה משטח אחידה עבור סיבי PCL / קרטין של קומפוזיציות שונות. אלה PCL / keratiסיבי n גם הראו תכונות מצוינות מכנות כגון נקודת מודולוס וכישלון של יאנג. תאים פיברובלסטים הצליחו לצרף מתרבים ובכך להוכיח כדאיות התא טוב. בהתבסס על מאפייני שנדונו לעיל, אנו יכולים לטעון בתוקף כי nanofibers מעורבב של פולימרים טבעיים וסינתטיים יכול לייצג פיתוח מעולה של חומרים מרוכבים, שניתן להשתמש בהם עבור יישומים ביו שונים.

Introduction

Electrospinning מוכרת כשיטה נפוצה להשגת nanofibers פולימר. הסיבים יכולים להיות מיוצרים על ננו ואת מאפייני הסיבים ניתנים להתאמה אישי ^1. התפתחויות אלה ואת המאפיינים של nanofibers electrospun יכולים להיות מעניינות במיוחד עבור יישומים שלהם בהנדסה ביו-רפואי במיוחד בהנדסת רקמות. Nanofibers electrospun להחזיק דמיון לחומר הבין-תאי ובכך לקדם את הידבקות תאים, נדידה ושגשוגם ^2. בשל הדמיון הזה לחומר הבין-תאי (ECM), ניתן להשתמש סיבי electrospun כחומריים לסייע הלבשת פצע, אספקת סמים, ועל רקמות הנדסה כגון כבד, עצם, לב, שריר ^3.

מגוון של פולימרים שונים ממוצא הסינטטי וטבעי שמש ליצירת סיבי electrospun עבור יישומי הנדסה ביו שונה ^4. לאחרונה יש כבר גדל בterest בפיתוח nanofibers מרוכבים על ידי ערבוב סינתטי ⁴ פולימרים טבעיים. בקומפוזיציות אלה המוצרים הסופיים בדרך כלל לרשת את חוזק המכנים הקשורים הפולימר הסינטטי תוך אימוץ רמזים ביולוגיים ומאפיינים מן הפולימר הטבעי.

בניסוי זה, PCL ו קרטין מוצגים כמו פולימרים סינתטיים וטבעיים לשמש לסינתזה של nanofiber מרוכבים. קראטין הוא פולימר טבעי שנמצא שיער, צמר ומסמרים. יש בו הרבה שאריות חומצת אמינו; עניין ראוי לציון הוא ציסטאין ^4,5. באופן אידיאלי פולימר טבעי יהיה biorenewable, ביולוגי מתכלה. קראטין הוא בעל כל שלושת המאפיינים הללו תוך שיפור תא התפשטות מצורף אל biomaterials זה כבר שולבו ב ^6.

Polycaprolactone (PCL) הוא פולימר resorbable, סינתטי שהיא משמעותיתהנדסת ⁴ רקמות. פולימר זה כבר שבח בעבר את היציבות מבנית המכאנית שלה, לעומת זאת, היא חסרה זיקת תא מניבה שיעור שפלה ממושכת. האופי ההידרופובי של PCL אחראי סביר על חוסר תא זיקה ^7. עם זאת, PCL מפצה על מגבלותיו ידי להיות בליל מאוד עם פולימרים אחרים. צירוף PCL / קרטין צריך להדגים את התכונות המכאניות של PCL ולשלב את התכונות הביולוגיות של קרטין, מה שהופך אותו לבחירה אידיאלית עבור יישומים ביו שונים.

Protocol

כל הפרוטוקול אחרי קווים מנחים של A צפון קרוליינה & T סטייט משרד מחקר התאימות והאתיקה.

1. הכנת מזון לחומרי קראטין הפקת ⁴

1. כדי להכין 1,000 מ"ל של 2% wt / כרך פתרון חומצה peracetic (PAS), תחת במנדף להוסיף 20 מ"ל של חומצה peracetic כדי 980 מ"ל של Deionized (DI) מים.
2. כדי להכין 1,000 מ"ל של 100 פתרון בסיס מ"מ טריס (TBS), להוסיף 12.2 גרם של טריס בסיס 1,000 מ"ל מים DI ומערבבים עד שהיא נמסה לחלוטין.
3. כן פתרון חומצה הידרוכלורית מדולל (DHAS) במנדף ידי שפיכת 4 מיליליטר של חומצה הידרוכלורית מרוכזת לתוך 30 מ"ל מי DI.
4. לרכוש כ 20 גרם של קטעי שיער אדם שלא טופלו או שינו כימיים. שיער יכול להיות בכל אורך.
5. שטפו את השיער ביסודיות, ביד, עם מים חמים וסבון. השתמש ללא יונים (DI) מים עבור השטיפה הסופית.
6. שים את השיער לשני 600 מ"ל כוסות ומכניסים o 80 ºCven עבור שעה 1.
7. מסננים את הנוזל מתחתית הכוס ומניחים ומחזירים לתנור עד שיער יבש לחלוטין.
8. פרד יבשי שיער באופן שווה בין 600 מיליליטר הכוסות, הצבת 10 גרם של השיער לתוך כל כוס. אל תאפשר את השיער כדי למלא יותר מ -500 מ"ל.
9. יוצקים 500 מ"ל של PAS לתוך כל כוס והקפד לכסות את כל השיער. מכסה את הכוסות עם parafilm ולאחסן למשך 12 שעות.

2. הכנת פתרון חלץ קראטין

1. הפרד את השיער מן PAS באמצעות מסננת 500 מיקרומטר. אסוף את PAS פסולת במיכל נפרד. יש לשטוף את השיער היטב במים DI להסיר כל PAS שאריות.
2. מניחים את השיער שטפה בבקבוק 500 מ"ל. יוצקים 400 מ"ל של TBS לתוך הבקבוק, ולוודא כי השיער מכוסה. בקבוק מקום באמבט רועד המוגדר 38 ºC, 65 סל"ד במשך שעה 1.
3. אחרי שעה 1, להסיר מן רעד אמבטיה ויוצקים את הנוזל, כ 400 מ"ל של תמיסת מיצוי קרטין (KES), אניn כדי מבחנה 1,000 מ"ל.
4. יוצקים 400 מ"ל מים DI לתוך הבקבוק המכיל את השיער על מנת להבטיח כי השיער מכוסה ומניחים לאחור באמבטיה רעד במשך שעה 1. הסר את הבקבוק מהאמבטיה הרועדת ויוצק את 400 מיליליטר הנותר של KES לתוך כוס 1,000 מיליליטר עם KES גבה. השיער אינו נחוץ עוד וניתן זרקה מתוך הבקבוק וזנוח ב למיכל האשפה הקרוב.

3. ריכוז של פתרון חלץ קראטין

1. מלאו אמבטיה rotodistiller לשורה העליונה עם מים מזוקקים ולהגדיר עד 90 ºC. סיבוב גדר מהיר 200 סל"ד. הפעל ילר-משאבת קירור ומוגדר -10 ºC.
2. באמצעות מד pH לפקח על pH של KES, להשתמש פיפטה להוסיף באיטיות 1 מ"מ DHAS אל KES עד להגעה pH 7.0. מערבבים לאט כפתרון מתווסף.
3. יוצקים את KES לנטרל לתוך הבקבוק 500 מ"ל מסביב לתחתית עד כרבע מלא. הפעל את המזקק פי יצרןפרוטוקול עבור 1.25 שעות.
   1. חזור על שלב 3.3 עד שכל KES כבר מזוקק. ודא כי את הבקבוק מחובר בחוזקה.

4. דיאליזה של פתרון חלץ קראטין

1. יוצקים פתרון KES שווה ל -12 צינורות חרוטי 14 מ"ל נפרד. צנטריפוגה צינורות ב 1,050 XG במשך 10 דקות.
2. יוצק את KES centrifuged לתוך מבחנה נקיה, מוודא לשפוך מן הפסולת שנאספה. חזור על הפעולה עד כל KES כבר centrifuged.
3. ממלאי 2,000 מיליליטר סיים גליל עם מים די.
4. חותכי קרום תאי צינורות דיאליזה עד 24 אינץ ', קליפ קצה אחד של צינור להחזיק אותו בחוזקה.
5. טובל את האורך של צינור בצילינדר של מים די כדי להפוך אותו ליותר גמיש קל יותר לפתוח.
6. פתח את הקצה שאינו גזומה של קרום התאי צינורות דיאליזה ולאט לאט לשפוך 60 מיליליטר של תמיסת KES centrifuged לתוך צינורות. השתמש קליפ אחר להיסגר בסוף זה של הצינור.
7. שים את diצינור alysis בצילינדר 2,000 מ"ל מים DI ולאפשר לשבת במשך 24 שעות. להחליף את המים DI בצילינדר בכל שעה 3 עד 4.
8. לאחר תקופה של 24 שעות, רוקן את הפתרון KES dialyzed לצנצנות כתרים, להיות בטוח להשאיר מקום בחלק העליון ומניחים במקפיא ב -20 ° C למשך 24 שעות.

5. Lyophilization של פתרון חלץ קראטין

1. הגדר את lyophilizer כדי -86 ºC.
2. הסר את צנצנות ובהן קפוא KES מהמקפיא, לקחת את הפקקים של צנצנות, ולהכניס אותם לתוך אמפולות מייבש ההקפאה. מניחים את החותמות על אמפולות סובבו את הכפתור יוצר לחץ ואקום של 0.133 mbar. Lyophilize דגימות במשך כ -48 שעות, עד שכל הלחות נעלם.

6. הכנת פתרונות Electrospinning (10% WT פתרון קראטין)

1. הסר את אבקת קראטין מן lyophilizer ולשקול אותו.
2. מוסיפים מים DI אל אבקת קראטין ליצור משקל 10% משקל /פתרון קראטין.

7. הכנת פתרון 10% wt PCL

1. השג PCL (פולימר ε-caprolactone, Mn 70 - 90 KDA), ו trifluoroethanol (TFE). כן 10% לפי משקל PCL ב TFE ידי ערבוב O / N ולקבל תערובת הומוגנית.

הכנת 8. פתרון קראטין / PCL

1. השג את הפתרון PCL 10% WT הכין בעבר ו -10% WT פתרון קרטין. להוסיף קרטין לתוך ירידת פתרון PCL חכם על מנת ליצור 10 מיליליטר PCL / פתרונות קרטין של 90:10, 80:20, 70:30, ו 60:40 יחסים.
2. השתמש vortexer כדי לקבל תערובת הומוגנית של פתרון PCL / קראטין לפני electrospinning.

הפקת 9. electrospun PCL / סיבי קרטין

1. מניח כ -8 מיליליטר של פתרון PCL / קראטין מזרק 10 מיליליטר פנוי מצויד עם צינור פלסטיק בקוטר 0.5 מ"מ. יש להכניס את המזרק ב משאבת מזרק שבו קצב הזרימה מוגדר להיות 2.5 מ"ל / שעה.
2. עוטפים את תוף אספן ברדיד אלומיניום לפני הפעלת המדגם. ודא כי רדיד האלומיניום הוא יציב על ידי יישום סרט התיוג על קצוות.
   הערה: הסיבים יהוו על נייר האלומיניום (ראה איור 2), לאחסן את הרדיד מכוסה סיבים ב RT.

10. ניתוח מכני של PCL / nanofibers קראטין

1. חותכים את מדגם לתוך 60 מ"מ 8 מ"מ. הקפד לרשום את העובי באמצעות מיקרומטר דיגיטלי. עבור כל רכב המוכן, השתמש חמש דגימות.
2. צרף את 60 x 8 מ"מ מדגם הבוחן המתיח. השתמש בעל דגימה אישי מעוצב לצרף המדגם. סנדוויץ מדגם בין מחזיקי דגימה אשר עשוי כרטיס אינדקס באמצעות לחיצה כפולהקלטת צדדית. החל התא 10 N עומס עם שיעור עקירה של 10 מ"מ / דקה.
   הערה: בעל הדגימה נועד להיות 62 מ"מ על 40 מ"מ עם חלון פנימי של 50 מ"מ על 38 מ"מ.
3. רחבת שיא וערכים טעינה באמצעות תוכנה על פי פרוטוקול תוכנה.
4. חישוב מתח על ידי חלוקת הכח לפי תחומי מדגם הבדיקה. לאחר מכן, לחשב זן ידי חלוקת השינוי באורך ידי אורך ראשוני.
5. צור את עקומת המתח מתח ידי התוויית מתח ציר y עבור מקביל ערך מתח ציר x.
6. חשב את מודול יאנג מאזור ליניארי שבו שיפוע שווה ל מודולוס האלסטיות. לקבוע חוזק מתיחת מהחלקה המתח מתח על ידי לקיחת 0.2% לקזז לכאביה ציור קו מקביל בעקום באזור ליניארי.
7. בצע ניתוח הסטטיסטי של הנתונים המכאניים שהושגו בשלושה עותקים באמצעות בעבר ניתוח חד סטרי שונה באמצעות ניתוח תוכנה ^8. ערכי p <0.05 לנומחדש נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית.

11. משטח אפיון המורפולוגיה מבני

1. השתמשו במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) עם הפרמטרים של מאיץ מתח של 15 קילו וולט וזרם של 5 מיקרו-אמפר כדי לבחון את המורפולוגיה של סיבים electrospun.
   1. לפני הדמיה עם SEM, לחתוך קטע ² 2 ס"מ של סיבים וצרף אותו שלב SEM באמצעות קלטת נחושת. מניחים את הבמה בתוך coater גמגום ואת המעיל עם זהב ב 15 mA דקות 1 ו -30 שניות כדי ליצור שכבת זהב כ 11 ננומטר עבה. טענת מדגם לתוך התא של SEM. שימו לב דגימות סיבים.
2. השתמש ספקטרוסקופיית פורייה (FTIR) לאפיין את הקשר הכימי בין PCL ו קרטין. מניחים את סעיף 2 ס"מ ² של קרום nanofiber electrospun בבעל מגנטי ולטהר את המערכת עם אוויר יבש לפני הבדיקה. השג ספקטרום עבור 200 סריקות ולנתח את הספקטרום באמצעות STAתוכנת ndard פי פרוטוקול תוכנה.
3. ביצוע ניתוח ספקטרום באמצעות תוכנה סטנדרטית ולהשתמש triplicates של כל יחס של nanofiber פי פרוטוקול של היצרן.

לימוד 12. של אינטראקציה תא-סיבים

1. חותכים סיביים לתוך 16 מ"מ ^{2 דוגמאות.} השתמש דבק ביולוגי, סיליקון מבוסס לתקן כל דגימה כדי coverslips בקוטר 12 מ"מ.
2. מדביקי קצה אחד של מדגם הסיבים לחלק אחורי של להחליק את המכסה, לעטוף את המדגם ברחבי coverslip, ואז מדביק את הקצה החופשי של מדגם לחלק אחורי של להחליק את המכסה, כמו גם, ומשאיר את העליונים של פליטת מכוסה רק מדגם סיבים.
3. מניחים את דגימות סיבים בצלחת 24 גם. לעקר את הדגימות על ידי טבילה באתנול 80% במשך שעה 1.
4. שוטפים את אתנול מן דגימות באמצעות מים די. ואז, פיפטה 2 מ"ל של מדיום הבסיס על דגימות, והקפד לכסות המדגם. הסר בינוני לאחר 5 דקות.
5. השתמש פיברובלסטים 3תאי T3 לזרוע את דגימות סיבים. להשעות את התאים במדיום של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) השלימו עם אנטיביוטיקה ו -10% בסרום שור העובר (FBS), כך ישנם כ 62,000 ^תאים / 2 ס"מ לכל 1 מ"ל של DMEM.
6. זרוק 1 מ"ל של הפתרון 3T3 התא המכיל DMEM לתוך כל צלחת היטב להבטיח כי כל דגימה סיבים מכוסה כ 62,000 ^תאים / 2 ס"מ. דגירה היטב צלחות עבור 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. הערה: השתמש 5% CO ₂ כי רמת שבדרך כלל יכול לשמור על pH של התקשורת תא בטווח הפיזיולוגי במשך ימים.

ביזוי 13. של מטריקס nanofiber

1. Cut יבשים PCL / ממברנות nanofiber קרטין לתוך הכיכר כ 30 מ"מ x 30 מ"מ.
2. לעקר את 900 מ"מ ^{2 דוגמאות} עם אלכוהול 80% עבור תקופת דגירה 10 דקות ולשטוף היטב במים DI. דגירה דגימות ב 15 מ"ל של PBS, pH 7.5, ב 37 ºC. החזר את bufFER כל 3 ימים.
3. קח את ממברנות מתוך הפתרון בפרקי זמן מוגדרים, 1 שבוע 7 שבועות, ולשטוף עם מים די.
4. מניחים את דגימות הממברנה לתוך אמפולות מייבש ההקפאה. מניחים את החותמות על אמפולות סובבו את הכפתור כדי ליצור ואקום. Lyophilize למשך 24 שעות, עד שהחומר מתייבש לגמרי.
5. צרף המדגם המיובש זה לשלב SEM באמצעות קלטת נחושת. מניחים את הבמה בתוך coater גמגום ואת המעיל עם זהב ב 15 mA דקות 1 ו -30 שניות.
6. טענת מדגם לתוך התא של SEM. שימו לב דגימות סיבים לעבר מתח מאיץ של 1.5 קילו וולט ו -5 הנוכחי מיקרו-אמפר.

תוצאות

מורפולוגיה סיבים
תמונות SEM של הסיבים התקבלו עבור כל קומפוזיציות הסיבים. ראה איור 3. תמונת סיבים מאשרת כי סיבים מכוונים באופן אקראי.

בדיקות מכאניות
סיבים ...

Discussion

הפקת קרטין מ שערת אדם הושגה בהצלחה. החומצה peracetic פעל כסוכן חמצון על שיער אדם, המאפשר קרטין להיעקר ידי טריס הבסיס. הפקת אבקת קראטין היה בקנה מידה קטן בשל העובדה שהדבר נעשה רק למטרות מחקר. הליך זה כבר הוקמה בשנת בתעשייה עבור ייצור בקנה מידה גדול. מטרת חילוץ קרטין בקנה המי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Hair			Obtained from Local Barber Shop in Greensboro
Peracetic acid	Sigma Aldrich
PCL (e-caprolactone polymer)	Sigma Aldrich	502-44-3	Mn 70-90 kDa
Trifluoroethanol (TFE)	Sigma Aldrich	75-89-8
Tris Base (TrizmaTM Base Powder)	Sigma Aldrich		>99.9% crystalline
Hydrochloric Acid	Fischer Scientific	A144C-212 Lot 093601	Waltham, MA
Kwik-Sil	World Precision Instruments		Sarasota, FL
Cellulose membrane	Sigma Aldrich		12 - 14 kDa molecular cut off
optical microscope	Olympus BX51M	BX51M	Japan
scanning electron microscope	Hitachi SU8000	SU8000	Japan
Table-Top Shimadzu machine	North America Analytical and Measuring Instruments AGS-X series	AGS-X Series	Columbia, MD
Fourier transform infrared spectroscopy	Bruker Tensor 2 Instrument		Billerica, MA
Microcal Origin software			Northampton, MA
X-ray diffraction (XRD)	Bruker AXS D8 Advance X-ray Diffractometer		Madison, WI
Fibroblast 3T3  cell	American Tissue Type Culture Collection		Manassas, VA
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM	Invitrogen		Grand Island, NY
Spectra max Gemini XPS microplate reader	Molecular Devices		Sunnyvale, CA
Student- Newman-Keuls post hoc test	SigmaPlot 12 software