医工学のためのケラチンベースのナノファイバーの合成

要約

電界紡糸ナノ繊維は、重量比は、優れた機械的完全性に大きな表面積を有し、細胞の成長と増殖を支えます。これらのナノファイバーは、生物医学的用途の広い範囲を持っています。ここでは、エレクトロスピニング法を用いて、ケラチン/ PCLナノ繊維を製造し、組織工学の可能な用途のために繊維を特徴付けます。

要約

様々な分野における用途のための汎用性と電位による電気紡糸は、しばしばナノファイバーを製造するために使用されています。これらの多孔質ナノファイバーの製造は、その独特の物理化学的特性に非常に興味深いです。ここでは、ポリ（εカプロラクトン）（PCL）ナノファイバー（ すなわち 、PCL /ケラチン複合繊維）を含むケラチンの製造について詳しく説明。水溶性ケラチンは、まず人間の毛髪から抽出され、異なる比率でPCLと混合しました。 PCL /ケラチンのブレンドされた解決策は、設定ラボ設計エレクトロスピニングを使用してナノファイバー膜に転換しました。得られたナノファイバーの繊維の形態および機械的特性は、走査電子顕微鏡、引張試験機を用いて観察し、測定しました。また、ナノ繊維の分解および化学的特性は、FTIRによって調査しました。 SEM画像は、異なる組成のPCL /ケラチン繊維のための均一な表面形態を示しました。これらのPCL / keratinは繊維はまた、ヤング率及び障害点として優れた機械的性質を示しました。線維芽細胞が付着し、良好な細胞生存性を証明し、従って、増殖することができました。上述の特性に基づいて、我々は強く、天然および合成ポリマーのブレンドナノファイバーは異なる生物医学的用途に用いることができる複合材料の優れた発展を表すことができると主張することができます。

概要

エレクトロスピニングは、ポリマーナノファイバーを達成する普及した方法として認識されています。繊維は、ナノスケールで製造することができ、繊維特性は^、1カスタマイズ可能です。これらの開発および電気紡績ナノファイバーの特性は、特に組織工学で生物医学工学におけるその用途に特に興味深いされています。エレクトロスピニングされたナノファイバーは、細胞外マトリックスとの類似性を有し、したがって、細胞の接着、遊走および増殖^{2を促進します。}細胞外マトリックス（ECM）へのこの類似性、静電繊維は、創傷包帯、薬物送達を補助するための材料として使用することができ、例えば、肝臓、骨、心臓、および筋肉³などのエンジニアリング組織について。

合成および天然起源の異なるポリマーの様々な異なる生物医学工学応用⁴静電繊維を作成するために使用されています。最近、そこに成長しています合成および天然ポリマー^4をブレンドすることにより、複合ナノファイバーの開発にterest。これらの組成物において、最終製品は、典型的には、また、天然ポリマーからの生物学的手がかりとプロパティを採用しながら合成ポリマーに関連した機械的強度を継承します。

この実験では、PCLおよびケラチン複合ナノファイバーの合成に使用される合成および天然ポリマーとして提示されます。ケラチンは、毛髪、羊毛や爪で発見された天然高分子です。これは、多くのアミノ酸残基を含みます。注目すべき関心のシステイン^4,5です。理想的には、天然に存在するポリマーは、生物学的再生可能、生体適合性および生分解性であろう。また、それが⁶に組み込まれている生体材料に細胞増殖および添付ファイルを向上させながら、ケラチンは、これらの特性のすべての3つを持っています。

ポリカプロラクトン（PCL）はで重要である再吸収性、合成ポリマーであります組織工学^4。このポリマーは、以前にその構造および機械的安定性のために評価されている、しかし、それは、細胞親和性を欠いていると長い分解速度を示します。 PCLの疎水性の性質は、細胞親和性⁷の欠如のために可能性が高い責任があります。しかし、PCLは、他のポリマーとの混和性の高いであることによって、その限界を補います。 PCL /ケラチン複合体は、PCLの機械的特性を実証して様々な生物医学的用途のための理想的な選択肢となって、ケラチンの生物学的特性を組み込む必要があります。

プロトコル

すべてのプロトコルは、研究コンプライアンスと倫理のノースカロライナA＆T州立大学のOfficeのガイドラインに従います。

ケラチン抽出⁴ 1.化学準備

1. 2％重量/容量過酢酸溶液（PAS）の千ミリリットルを準備するには、ヒュームフードの下で脱イオン（DI）水980ミリリットルに過酢酸の20ミリリットルを追加します。
2. 100mMトリス塩基溶液（TBS）1000mlのを準備するために、脱イオン水1000mlにトリス塩基12.2gのを追加し、完全に溶解するまで撹拌します。
3. DI水の30ミリリットルに濃塩酸の4ミリリットルを注ぐことにより、ドラフト内で希塩酸溶液（DHAS）を準備します。
4. 化学的に処理されたか変更されていない人間の髪の毛の切り抜きの約20グラムを調達。髪の長さは任意です。
5. 暖かい水と石鹸で、手で、徹底的に髪を洗ってください。最終すすぎ脱イオン（DI）水を使用してください。
6. 80ºCのOで2 600ミリリットルビーカー、所定の位置に髪を置きます1時間VEN。
7. ビーカーの底から液体を排出し、髪が完全に乾燥するまでオーブンに戻って置きます。
8. 各ビーカーに毛の10グラムを配置し、600ミリリットルのビーカーの間で均等に乾燥した髪を分割します。以上の500ミリリットルを埋めるために髪を許可しないでください。
9. 髪のすべてをカバーすることを確認して、各ビーカーにPASの500ミリリットルを注ぎます。 12時間パラフィルムや店舗でビーカーをカバーしています。

ケラチン抽出液の調製

1. 500ミクロンのふるいを使用して、PASから髪を区切ります。別の容器内の廃PASを収集します。残ったPASを除去するために、DI水で徹底的に髪をすすいでください。
2. 500mlフラスコ中ですすぎ、髪を置きます。毛が覆われていることを確認して、フラスコ内にTBSの400ミリリットルを注ぎます。 38ºC、1時間65回転に設定した振盪浴中に置き、フラスコ。
3. 1時間後、バスを振ってから削除して、液体を注ぐ、ケラチン抽出溶液（KES）の約400ミリリットル、私千ミリリットルのビーカーNtoを。
4. 髪をカバーし、1時間振とう浴中に戻って配置されることを保証する毛を含むフラスコに脱イオン水400mlを注ぎます。振とう浴からフラスコを外し、以前に収集KESと千ミリリットルビーカーにKESの残りの400ミリリットルを注ぎます。髪はもはや必要ありませんし、フラスコからダンプされ、最寄りのごみ容器に廃棄することができます。

ケラチン抽出液の3濃度

1. 蒸留水で一番上の行にrotodistiller風呂を記入し、90ºCに設定。 200回転まで回転数を設定します。クーラントチラーポンプの電源を入れ、-10ºCに設定。
2. pH計を使用して、KESのpHを監視し、ゆっくりとpHが7.0に達するまでKESに1mMのDHASを追加するためにピペットを使用します。溶液が添加されるようにゆっくりとかき混ぜます。
3. フル程度四半期までの丸底フラスコ500ml中に中和KESを注ぎます。メーカーのに従って蒸留器を実行します1.25時間のためのプロトコル。
   1. KESのすべてが蒸留されるまで、ステップ3.3を繰り返します。フラスコがしっかりと接続されていることを確認してください。

4.透析ケラチンの抽出液

1. 12独立した14ミリリットルコニカルチューブに均等にKES液を注ぎます。 10分間、1050×gでチューブを遠心。
2. 収集した破片から離れて注ぎ確認して、清浄なビーカーに遠心分離KESを注ぎます。 KESのすべてが遠心分離されるまで繰り返します。
3. 2000ミリリットルのDI水でメスシリンダーを埋めます。
4. 24インチに透析チューブセルロース膜を切断し、それをシャット保持するチューブの一端をクリップ。
5. それはより柔軟で開きやすくするためのDI水シリンダー内にチューブの長さを浸し。
6. 透析チューブのセルロース膜の非クリップされた端を開き、ゆっくりとチューブに遠心分離KES液の60ミリリットルを注ぎます。チューブのこの端を閉鎖するために別のクリップを使用してください。
7. ディを入れてDI水の2000ミリリットルシリンダ内alysisチューブ、24時間放置することができます。シリンダー内のすべての3〜4時間をDI水を変更します。
8. 24時間の期間の後、24時間、-20℃の冷凍庫に上部の空間と場所を残すようにしてくださいされ、キャップされたジャーに透析KES液を空にします。

5.凍結乾燥ケラチン抽出液の

1. -86ºCに凍結乾燥機を設定します。
2. 、冷凍庫から冷凍KESを含むjarファイルを削除ジャーのオフにキャップを取り、凍結乾燥機のアンプルに入れます。アンプルにシールを置き、0.133ミリバールの真空圧力を作成するために、ノブを回します。水分のすべてがなくなるまで、約48時間のサンプルを凍結乾燥。

エレクトロ・ソリューションズの6準備（10重量％ケラチンソリューション）

1. 凍結乾燥機からケラチンパウダーを取り出し、重量を量ります。
2. 10％（重量/重量）を作成するためにケラチン粉末に脱イオン水を加えますケラチンソリューション。

PCLソリューション重量10％の7の準備

1. 、およびトリフルオロエタノール（TFE） - PCL（90kDaのεカプロラクトンポリマー、Mnは70）を取得します。 O / Nを攪拌することによりTFEで重量PCLによって10％を準備し、均質な混合物を得ます。

ケラチン/ PCLソリューションの8.準備

1. 10重量％のPCL溶液を先に調製し、10重量％ケラチン溶液を得ました。 90:10、80:20、70:30の10ミリリットルPCL /ケラチンソリューション、および60:40の比率を作成するために、賢明なPCL液滴にケラチンを追加します。
2. エレクトロスピニング前に、PCL /ケラチン液の均一な混合物を得るために、ボルテクサーを使用します。

9.エレクトロPCLの生産/ケラチン繊維

1. 0.5mmの直径のプラスチック管を備えた10ミリリットル使い捨て注射器にPCL /ケラチン溶液約8ミリリットルを置きます。流量は2.5ミリリットル/時間に設定されているシリンジポンプにシリンジを配置します。
2. チューブ（ドラムを収集ファイバから〜23センチメートルに位置し、水平から約30度）に接続された針の先端に電圧を適用します。チューブに22 kVの電圧と約200 rpmでコレクタードラムを回転させる - 19を適用します。
   1. サンプルを実行する前に、アルミホイルでコレクタードラムを包みます。アルミ箔は、どちらかの端にラベリングテープを適用することにより、安定していることを確認してください。
      注：繊維は、アルミ箔上に形成する（ 図2を参照）、RTで繊維覆われた箔を格納します。

PCL /ケラチンナノファイバーの10力学解析

1. 8ミリメートルによって60ミリメートルに試料をカットします。デジタルマイクロメーターを使用して厚さを記録することを確認します。調製した各組成物について、5つのサンプルを使用します。
2. 引張試験機で60×8ミリメートルのサンプルを取り付けます。サンプルを添付するためにカスタム設計された試料ホルダを使用します。二重使用してインデックスカードから作られた試料ホルダーとの間にサンプルを挟みます両面テープ。 10mm /分の変位速度で、10Nのロードセルを適用します。
   注意：試料ホルダーが38ミリメートル、50ミリメートル内側の窓と40ミリメートルによって62ミリメートルであるように設計されました。
3. レコードの拡張とソフトウェアのプロトコルに従ってソフトウェアを介して負荷値。
4. 試験される試料の面積で力を割ることによってストレスを計算します。次に、初期長さによって長さの変化を分割することにより歪みを計算します。
5. x軸の歪み値に対応するY軸の応力をプロットすることにより応力 - ひずみ曲線を生成します。
6. 傾きは弾性率に等しい線形領域からヤング率を計算します。株では0.2％オフセットを取り、線形領域の曲線に平行線を描画することにより、応力歪みプロットから引張強度を決定します。
7. 以前に解析ソフトウェア^{8を用いて}一元配置分散分析を用いて三連で得られた機械的データの統計分析を行う。p値 <0.05我々統計的に有意であると考え直します。

11.表面形態と構造特性

1. 電界紡糸繊維の形態を観察するために15キロボルトの電圧及び5μAの電流を促進するパラメータを持つ走査型電子顕微鏡（SEM）を使用します。
   1. SEMで撮影する前に、繊維の2 ^cm 2の部分をカットし、銅テープを使用して、SEMステージに取り付けます。約11 nmの厚さの金層を作成するために、1分30秒15ミリアンペアで金でスパッタコーター、コートの内側のステージを置きます。 SEMのチャンバ内にサンプルをロードします。繊維試料を観察します。
2. PCLとケラチンとの間に化学結合を特徴づけるために、赤外分光法（FTIR）をフーリエ変換を使用してください。磁気ホルダーにエレクトロナノファイバー膜の2 ^cm 2のセクションを配置し、試験前に乾燥空気を使用してシステムをパージします。 200スキャンのスペクトルを取得し、STAを使用してスペクトルを分析ソフトウェアプロトコルに従ってndardソフトウェア。
3. 標準的なソフトウェアを使用して、スペクトル分析を行い、製造業者のプロトコルに従ってナノファイバーの各比率の三連を使用します。

細胞 - 繊維相互作用の12研究

1. 16ミリメートル²サンプルに繊維をカット。 12ミリメートル径のカバースリップに、各試料を固定するために、生体適合性、シリコーン系接着剤を使用してください。
2. 、その後も同様にカバースリップの背面にサンプルの自由端を接着、カバーガラスの周りのサンプルを包むだけで覆われたスリップの上部を残してカバースリップの背面に繊維試料の一端を接着繊維試料。
3. 24ウェルプレートで繊維試料を置きます。 1時間80％エタノールに浸漬してサンプルを滅菌します。
4. DI水を使用して、サンプルからエタノールをすすぎます。次に、サンプルの上にピペット基礎培地の2ミリリットルを、サンプル全体をカバーすることを確認すること。 5分後に培地を除去します。
5. 使用線維芽細胞3T3細胞は、繊維試料をシードします。 DMEMを1ml当たり/ ^cm 2で約62,000細胞が存在するように、抗生物質および10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で細胞を懸濁。
6. 各繊維サンプルは/ ^cm 2で約62,000細胞で覆われていることを保証する各ウェルプレートに3T3細胞を含むDMEM溶液1mlをドロップ。 37℃で24時間、5％CO ₂のためにウェルプレートをインキュベート。注：使用し、5％CO _2をそのレベルは通常日間生理的範囲内の細胞培地のpHを維持することができるからです。

ナノファイバーマトリックスの13分解

1. カットは、正方形の約30ミリメートル×30ミリメートルにPCL /ケラチンナノファイバー膜を乾燥させました。
2. 10分間のインキュベーション時間を80％アルコール900 ^mm 2のサンプルを滅菌し、DI水で徹底的に洗浄します。 37ºCで、PBS、pHが7.5の15ミリリットルでサンプルをインキュベートします。 BUFを交換してください3日ごとにFER。
3. 指定された間隔、1週間および7週目に溶液から膜を取り、DI水ですすいでください。
4. 凍結乾燥機のアンプルに膜サンプルを置きます。アンプルにシールを置き、真空を作成するために、ノブを回します。完全に乾燥するまで、24時間凍結乾燥。
5. 銅テープを使用して、SEMステージに乾燥した試料を取り付けます。 1分30秒15ミリアンペアで、金でスパッタコーター、コートの内側にステージを配置します。
6. SEMのチャンバ内にサンプルをロードします。 1.5 kVのと5μAの電流の加速電圧で繊維試料を観察します。

結果

繊維形態
繊維のSEM画像は全て繊維組成物について得られました。 図 3を参照。ファイバイメージは繊維がランダムに配向していることを確認します。

機械的検査
機械的に強い繊維は一般に、種々の組織工学用途のために必要とされます。これらの繊維は一定のスト?...

ディスカッション

人間の髪の毛からケラチンの抽出に成功を達成しました。過酢酸は、ケラチンは、トリス塩基により抽出することができるように、人間の毛髪に酸化剤として作用しました。ケラチン粉末の製造は、それが唯一の研究目的のために行われたという事実による小規模でした。この手順は、すでに大規模生産のために業界で確立されています。小規模ケラチンを抽出する目的は、汚染、バッチ変?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Hair			Obtained from Local Barber Shop in Greensboro
Peracetic acid	Sigma Aldrich
PCL (e-caprolactone polymer)	Sigma Aldrich	502-44-3	Mn 70-90 kDa
Trifluoroethanol (TFE)	Sigma Aldrich	75-89-8
Tris Base (TrizmaTM Base Powder)	Sigma Aldrich		>99.9% crystalline
Hydrochloric Acid	Fischer Scientific	A144C-212 Lot 093601	Waltham, MA
Kwik-Sil	World Precision Instruments		Sarasota, FL
Cellulose membrane	Sigma Aldrich		12 - 14 kDa molecular cut off
optical microscope	Olympus BX51M	BX51M	Japan
scanning electron microscope	Hitachi SU8000	SU8000	Japan
Table-Top Shimadzu machine	North America Analytical and Measuring Instruments AGS-X series	AGS-X Series	Columbia, MD
Fourier transform infrared spectroscopy	Bruker Tensor 2 Instrument		Billerica, MA
Microcal Origin software			Northampton, MA
X-ray diffraction (XRD)	Bruker AXS D8 Advance X-ray Diffractometer		Madison, WI
Fibroblast 3T3  cell	American Tissue Type Culture Collection		Manassas, VA
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM	Invitrogen		Grand Island, NY
Spectra max Gemini XPS microplate reader	Molecular Devices		Sunnyvale, CA
Student- Newman-Keuls post hoc test	SigmaPlot 12 software