Biyomedikal Mühendisliği için keratin bazlı nanofiber sentezi

Özet

Electrospun nanolifler oranı, mükemmel mekanik bütünlüğü ağırlığı ve hücre büyümesi ve çoğalması desteklemek için yüksek bir yüzey alanı vardır. Bu nanolifler biyomedikal uygulamalarda geniş bir yelpazesi var. Burada Elektrospinning tekniği kullanılarak, keratin / PCL nanolifler imal ve doku mühendisliğinde olası uygulamalar için lifleri karakterize.

Özet

çeşitli alanlarda uygulama için çok yönlülüğü ve potansiyel nedeniyle Elektrospinning, sık sık nanolifler imal etmek için kullanılmaktadır. Bu gözenekli nanolifler üretimi nedeniyle eşsiz fizikokimyasal özellikleri büyük ilgi olduğunu. Burada poli (ε-kaprolakton) içeren keratin (PCL) nanolifler (yani, PCL / keratin kompozit lif) imalatı üzerinde durmak. Suda çözünür, keratin, ilk insan saç elde edilir ve farklı oranlarda PCL ile karıştırıldı. PCL / keratin harmanlanmış çözüm kurmak laboratuvar tasarlanmış elektrospinning kullanarak nanofibröz membranların dönüştürüldü. Elyaf morfolojisi ve elde edilen nano mekanik özellikleri gözlenmiştir ve tarama elektron mikroskobu ve gerilme deney cihazı kullanılarak ölçülmüştür. Ayrıca, nanofiber ve nitelik kaybı ve kimyasal özellikleri FTIR ile incelenmiştir. SEM görüntüleri farklı bileşimlerin PCL / keratin lifleri için üniform yüzey morfolojisi gösterdi. Bu PCL / keratinositlerdenn, lifler, Young modülü ve kırılma noktası olarak mükemmel mekanik özellikler göstermiştir. Fibroblast hücreleri eklemek ve iyi hücre canlılığı kanıtlayan böylece çoğalmaya başardık. Yukarıda tartışılan özelliklere dayanarak, şiddetle doğal ve sentetik polimerlerin harmanlanmış nanolifler farklı biyomedikal uygulamalarda kullanılabilir kompozit malzemelerin mükemmel bir gelişmeyi temsil edebilir söylenebilir.

Giriş

Elektrospinning polimer nanolifler ulaşmanın bir yaygın yöntem olarak kabul edilmektedir. Lifler, bir nano üzerinde üretilebilir ve lif özellikleri ¹ özelleştirilebilir. Bu gelişmeler ve electrospun nanoliflerden özellikleri özellikle doku mühendisliği biyomedikal mühendisliği uygulamaları için özellikle ilginç olmuştur. Electrospun nanolifler ekstraselüler matriks benzerlikler sahip ve böylece hücre yapışmasını, göç ve çoğalmasını ² teşvik eder. Nedeniyle hücre dışı matrisin (ECM) Bu benzerlik, electrospun elyaf yara sargıları, ilaç uygulama yardımcı maddeler olarak kullanılabilir ve böyle karaciğer, kemik, kalp, kas ³ mühendislik dokularının.

Sentetik ve doğal kökenli çeşitli polimerler arasında çeşitli farklı biyomedikal mühendislik uygulamaları ⁴ electrospun lifleri oluşturmak için kullanılmıştır. Son zamanlarda orada artmaktadırsentetik ve doğal polimerleri ⁴ harmanlayarak kompozit nano geliştirilmesinde menfaati arasında fark. Bu kompozisyonlarda nihai ürünler genellikle doğal polimerden biyolojik işaretler ve özellikleri benimseyerek sentetik polimer ile ilişkili mekanik mukavemet devralır.

sentetik ve doğal polimerler, karma bir nano sentezi için kullanılmak üzere, bu deneyde, PCL keratin sunulmaktadır. Saç, yün ve çivi bulunan doğal bir polimerdir. Birçok amino asit kalıntıları içerir, önemli ilgi sistein ^4,5 olduğunu. İdeal olarak, doğal olarak oluşan bir polimer, biorenewable bir biyouyumlu ve biyobozunur olacaktır. Ayrıca ^6'da dahil edilmiştir Biyomalzemelere hücre çoğalmasını ve eki geliştirirken Keratin bu özellikleri her üç sahiptir.

Polikaprolakton (PCL) önemli olan bir emilebilir sentetik bir polimerdirdoku mühendisliği ^4.. Bu polimer daha önce yapısal ve mekanik stabilite için takdir edilmiştir, ancak, bu, hücre afinitesine sahip değildir ve uzun bir bozulma oranı gösterir. PCL hidrofobik yapısı hücresi afinite ⁷ olmaması için olası sorumludur. Ancak, PCL diğer polimerler ile son derece karışabilir kalarak kendi sınırlamaları için yapar. Bir PCL / keratin kompozit PCL mekanik özelliklerini göstermek ve çeşitli biyomedikal uygulamalar için ideal bir seçim yapma, keratin biyolojik özelliklerini içermelidir.

Protokol

Tüm protokol Araştırma Uyum ve Etik North Carolina A & T State University Ofisi yönergeleri takip eder.

Keratin Ekstraksiyon ^{4 için} 1. Kimyasal Hazırlama

1. davlumbaz altında,% 2 ağırlık / hacim olarak perasetik asit çözeltisi (PAS) 1000 ml hazırlamak için iyonu giderilmiş (Di) su, 980 ml perasetik asit 20 ml ekleyin.
2. 100 mM Tris baz çözeltisi (TBS) 1000 ml hazırlamak için, Dİ su 1000 ml Tris bazı 12.2 g ekleyin ve tümüyle çözülene kadar karıştırın.
3. DI suyun 30 ml konsantre edilmiş hidroklorik asit 4 ml dökülerek bir çeker ocak içinde, seyreltik hidroklorik asit çözeltisi (DHAS) hazırlayın.
4. kimyasal tedavi veya değiştirilmediğini insan saçı kupürleri yaklaşık 20 g tedarik. Saç herhangi bir uzunlukta olabilir.
5. ılık su ve sabun ile, elle iyice saçları yıkayın. son durulama için deiyonize (DI) su kullanın.
6. 80 ºC o iki 600 ml bardak içine saç ve yerine koymak1 saat süre ile ven.
7. beher altındaki sıvıyı boşaltın ve saç tamamen kuruyana kadar fırında geri yerleştirin.
8. Bölme, her behere saç 10 g yerleştirilmesi, 600 ml'lik çanaklar arasında eşit bir şekilde saç kurutuldu. 500 ml'den fazla doldurmak için saç izin vermeyin.
9. tüm saç kapsayacak şekilde emin her behere PAS 500 ml dökün. 12 saat parafilm ve mağaza ile beher örtün.

Keratin Özü Çözüm 2. Hazırlık

1. 500 um elek kullanılarak PAS saç ayırın. Ayrı bir kapta atık PAS toplayın. herhangi bir artık PAS kaldırmak için DI su ile iyice saçlarınızı durulayın.
2. 500 ml'lik bir şişe içinde durulanmıştır saç yerleştirin. saç kaplıdır emin, balona TBS 400 ml dökün. 38 ° C, 1 saat boyunca 65 rpm'de ayarlanmış bir çalkalama banyosu üzerinde yer şişe.
3. 1 saat sonra, keratin ekstraksiyon çözeltisi yaklaşık 400 ml (KS), sıvı banyonun çalkalama kaldırmak ve dökmek I1000 ml'lik bir cam nBu.
4. Saç kaplı ve 1 saat boyunca çalkalama banyosu Lütfen yer olduğunu garanti saç ihtiva eden şişe içine DI suyun 400 ml dökün. çalkalama banyosundan balon çıkarın ve daha önce toplanan KES 1000 ml'lik bir cam kaba KES kalan 400 ml dökün. saç artık gerekli ve en yakın çöp kutusuna balonun dışına atılmış ve atılabilir.

Keratin Özü Çözüm 3. Konsantrasyon

1. damıtılmış suyla üst çizgiye rotodistiller banyo doldurmak ve 90 ºC ye ayarlayın. 200 rpm olarak ayarlayın dönme hızı. Soğutucu soğutucu-pompa açın ve -10 ºC ayarlanır.
2. pH metre kullanılarak, KES pH izlemek yavaş yavaş pH 7.0 ulaşana kadar KES 1 mM DHAS eklemek için bir pipet kullanın. çözeltisi ilave edilir yavaş ilave edin.
3. Tam yaklaşık çeyreğine kadar yuvarlak tabanlı bir şişeye 500 ml nötralize KES dökün. üreticinin göre distile çalıştırın1.25 saat için protokol.
   1. KES tüm kadar adımı yineleyin 3.3 distile edilmiştir. Şişe sıkıca bağlı olduğundan emin olun.

Keratin Özü Çözüm 4. Diyaliz

1. 12 ayrı 14 ml konik tüpler içine eşit KES çözüm dökün. 10 dakika boyunca 1050 x g'de santrifüjleyin tüpler.
2. Toplanan enkaz uzak dökmek için emin olun, temiz bir behere santrifüj KES dökün. KES her santrifüj kadar yineleyin.
3. Dolgu 2.000 ml DI su ile dereceli silindir.
4. 24 inç diyaliz tüp selüloz zarı kes ve kapamak tutmak için hortumun bir ucunu klibi.
5. daha esnek ve açık kolaylaştırmak için DI suyun silindir tüp uzunluğunu batırın.
6. Diyaliz tübü selüloz membranı olmayan kesilmiş uç açık yavaş yavaş boru halinde santrifüj KES çözeltisi 60 ml dökün. Hortumun bu ucunu kapatmak için başka bir klibi kullanın.
7. di koymakDİ su 2,000 mi silindirde alysis boru ve 24 saat boyunca bekletin. silindir içinde her 3 ila 4 saat distile su değiştirin.
8. 24 saatlik bir süre sonra, 24 saat boyunca -20 ° C'de derin dondurucuda üstündeki alan ve yeri terk emin olmak kapaklı kavanoz içine diyaliz KES çözüm boşaltın.

5. Liyofilizasyon Keratin Özü Çözüm

1. -86 ºC dondurarak kurutucunun ayarlayın.
2. , Dondurucu dondurulmuş KES içeren kavanoz Kaldır kavanoz kapalı kapaklarını almak ve donma kurutma ampullere koyun. ampuller üzerindeki mühürler yerleştirin ve 0.133 mBar'lık bir vakum basınç oluşturmak için düğmeyi çevirin. nem, tüm bitene kadar yaklaşık 48 saat boyunca örnekleri liyofilize edin.

Elektrospinning Çözümleri 6. Hazırlama (ağırlıkça% 10 Keratin Çözümü)

1. lyophilizer gelen Keratin Tozu çıkarın ve tartın.
2. % 10 ağırlık / ağırlık oluşturmak için Keratin toz DI su ekleyinKeratin çözüm.

% 10 ağırlık PCL Çözüm 7. Hazırlık

1. Ve trifloroetanol (TFE) - PCL (90 kDa ε-kaprolakton polimer, Mn 70) edinin. karıştırma O / N TFE ağırlık PCL tarafından% 10 hazırlayın ve homojen bir karışım elde.

Keratin / PCL Çözüm 8. hazırlanması

1. Ağırlıkça% 10 PCL çözelti, önceden hazırlanmış ve ağırlık olarak% 10, keratin çözelti elde edilir. 90:10, 80:20, 70:30 10 ml PCL / keratin çözümler ve 60:40 oranları yaratmak için akıllıca PCL çözüm damla içine keratin ekleyin.
2. Elektrospinning önce PCL / keratin çözeltisi homojen bir karışım elde etmek için bir vorteks kullanın.

Electrospun PCL 9. Üretim / keratin Fiber

1. 0.5 mm çaplı bir plastik tüp ile donatılmış bir 10 ml tek kullanımlık şırınga PCL / keratin çözeltisi, yaklaşık olarak 8 ml yerleştirin. Akış hızı 2.5 ml / saat olarak ayarlanır, bir şırınga pompası şırınga yerleştirin.
2. Tüpe bağlı iğne ucu kadar gerilim uygulayın (~ yatay 30 derecede davul toplama elyaftan ~ 23 cm konumlandırılmış ve). tüp 22 kV voltaj ve yaklaşık 200 rpm'de kolektör tamburu döndürmek - 19 uygulayın.
   1. örnek çalıştırmadan önce alüminyum folyo ile kolektör davul sarın. alüminyum folyo her iki uçta da etiketleme bant uygulayarak istikrarlı olduğundan emin olun.
      Not: elyaflar alüminyum folyo oluşturacak (Şekil 2), oda sıcaklığında, elyaf kapalı folyo saklayın.

PCL / Keratin nanoliflerden 10. Mekanik Analizi

1. 8 mm, 60 mm olarak numune kesin. dijital mikrometre kullanılarak kalınlığı kaydetmek için emin olun. hazırlanan her bileşim için beş numune kullanın.
2. gerilme test 60 x 8 mm örneği takın. örnek takmak için özel olarak tasarlanmış örnek tutucu kullanın. çift ​​kullanarak bir dizin kartından yapılan numune sahipleri arasındaki örnek Sandwichtaraflı bant. 10 mm / dakika arasında bir yer değiştirme hızı ile 10 N yük hücresi uygulanır.
   Not: örnek tutucu 38 mm, 50 mm bir iç pencere ile 40 mm 62 mm olacak şekilde tasarlanmıştır.
3. Kayıt uzatma ve yazılım protokolüne göre yazılım aracılığıyla yük değerleri.
4. Test edilen örnek alam ile kuvvet bölünerek stres hesaplayın. Daha sonra, başlangıç ​​uzunluğuna göre uzunluğu değişimi bölünmesiyle suşu hesaplar.
5. x-ekseni gerilme değerinin karşılık gelen y-ekseninde stres çizerek gerilme-deformasyon eğrisi oluşturmak.
6. eğimi elastisite modülü eşittir lineer bölgeden Young modülüne hesaplayın. zorlanma ofset% 0,2 alarak ve doğrusal bölge eğrisine paralel bir çizgi çizerek gerilme deformasyon grafiğinden çekme dayanımı belirleyin.
7. Daha önce analiz yazılımı ⁸ kullanarak varyans tek yönlü analizi kullanılarak üç nüsha olarak elde edilen mekanik verilerin istatistiksel analizi yapın. P değerleri <0.05 bizistatistiksel olarak anlamlı kabul yeniden.

11. Yüzey Morfolojisi ve Yapısal Karakterizasyonu

1. electrospun elyaf morfolojisinin gözlemlemek için 15 kV voltaj ve 5 uA akım hızlandırma parametreleri ile tarama elektron mikroskobu (SEM) kullanın.
   1. SEM görüntü vermeden önce, ^lif, 2 cm2'lik bir bölüm kesilir ve bakır bant kullanarak SEM aşamasına ekleyin. yaklaşık 11 nm kalınlığında bir altın tabakası oluşturmak için 1 dakika ve 30 saniye süreyle 15 mA'da altın püskürtme kaplayıcı ve ceketin içine sahne yerleştirin. SEM odasına örnek yükleyin. lif örnekleri dikkate alın.
2. PCL ve keratin arasındaki kimyasal bağları karakterize etmek için kızılötesi spektroskopi (FTIR) dönüşümü Fourier kullanın. Manyetik tutucu electrospun nanofiber membranın 2 cm ² bölüm yerleştirin ve testten önce kuru hava ile sistemi temizlemek. 200 taramalar için spektrumları elde ve sta kullanarak spektrumları analizYazılım protokolüne göre ard yazılım.
3. Standart yazılımı kullanarak spektrum analizi yapın ve üreticinin protokolüne göre nano her oranının triplicates kullanın.

Hücre fiber Etkileşim 12. Çalışması

1. 16 ^mm2 örnekleri lifleri kesin. 12 mm çaplı lamelleri her bir örnek düzeltmek için bir biyolojik olarak uyumlu, silikon bazlı tutkal.
2. , Daha sonra da kapak kayma arkasına Numunenin serbest ucunu tutkal, lamel çevresinde örnek Sarma Yalnızca kaplı astar üst ayrılan kapak kayma arkasına elyaf numunesinin bir ucunu yapıştırmak elyaf numunesi.
3. 24 oyuklu bir plaka içerisinde elyaf örnekleri yer. 1 saat% 80 etanol içinde daldırarak örnekleri sterilize edin.
4. Distile su ile örnekleri etanol durulayın. Daha sonra, bir pipet, tüm numune kapsayacak şekilde emin numuneye bazal ortam 2 ml. 5 dakika sonra orta çıkarın.
5. Kullanım fibroblast 3T3 hücreleri lif örnekleri tohum. DMEM 1 ml başına ^/ cm2 yaklaşık 62,000 hücre olduğu antibiyotik ve bu,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde süspanse.
6. Her bir elyaf numunesi ^/ cm2 yaklaşık 62,000 hücre ile kaplıdır temin her bir plaka olarak işlenmiş 3T3 hücre içeren DMEM çözeltisi 1 ml bırakın. 37 ° C'de 24 saat% 5 _CO2 için iyi inkübe edin. Not: _{kullanımlar%} 5 CO2 bu seviyesi genellikle günde fizyolojik aralıkta hücre ortamının pH değeri korumak için.

Nanolif Matrix 13. Parçalanma

1. Kesim kare yaklaşık 30 mm x 30 mm içine PCL / keratin nano membranlar kurutulmuştur.
2. 10 dakika inkübasyon dönemi için% 80 alkol ile 900 mm ² örnekleri sterilize ve DI su ile iyice yıkayın. 37 ° C'de, PBS, pH 7.5, 15 ml numune inkübe edin. buf değiştirinHer 3 günde bir fer.
3. , Belirtilen aralıklarla çözümün dışına zarlarını alın 1 hafta ve 7 hafta ve DI su ile durulayın.
4. Dondurma kurutucu ampullere membran örnekleri yer. ampuller üzerindeki mühürleri yerleştirin ve bir vakum yaratmak için düğmeyi çevirin. Tamamen kuruyana kadar, 24 saat boyunca liyofilize edin.
5. Bakır bant kullanarak SEM sahneye kurutulmuş numune onu takın. 1 dakika ve 30 saniye süreyle 15 mA'da altın püskürtme kaplayıcı ve ceketin içine sahne yerleştirin.
6. SEM odasına örnek yükleyin. 1.5 kV ve 5 uA akımının bir hızlandırma gerilimi lif örnekleri dikkate alın.

Sonuçlar

lif Morfolojisi
liflerin SEM görüntüleri tüm fiber bileşimler elde edilmiştir. Bakınız Şekil 3. Fiber görüntü fiberler rasgele olduğunu teyit etmektedir.

mekanik Test
Mekanik olarak güçlü lifler genellikle çeşitli doku mühendisliği uygulamaları için gereklidir. Bu lifler belli stres ve çevresel koşullara ⁹

Tartışmalar

insan saç keratin çıkarımı başarıyla gerçekleştirilmiştir. perasetik asit, keratin Tris bazı ile ekstre sağlayan, bir saç telinin bir oksitleyici madde olarak vermiştir. keratin tozu üretimi nedeniyle sadece araştırma amaçlı yapıldığını gerçeğine küçük ölçekli oldu. Bu prosedür, zaten büyük ölçekli üretim için endüstri kurulmuştur. küçük ölçekli keratin çıkarma amacı kirlenmesini, toplu değişkenliği ve maliyet etkinliğini kontrol etmek oldu.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Hair			Obtained from Local Barber Shop in Greensboro
Peracetic acid	Sigma Aldrich
PCL (e-caprolactone polymer)	Sigma Aldrich	502-44-3	Mn 70-90 kDa
Trifluoroethanol (TFE)	Sigma Aldrich	75-89-8
Tris Base (TrizmaTM Base Powder)	Sigma Aldrich		>99.9% crystalline
Hydrochloric Acid	Fischer Scientific	A144C-212 Lot 093601	Waltham, MA
Kwik-Sil	World Precision Instruments		Sarasota, FL
Cellulose membrane	Sigma Aldrich		12 - 14 kDa molecular cut off
optical microscope	Olympus BX51M	BX51M	Japan
scanning electron microscope	Hitachi SU8000	SU8000	Japan
Table-Top Shimadzu machine	North America Analytical and Measuring Instruments AGS-X series	AGS-X Series	Columbia, MD
Fourier transform infrared spectroscopy	Bruker Tensor 2 Instrument		Billerica, MA
Microcal Origin software			Northampton, MA
X-ray diffraction (XRD)	Bruker AXS D8 Advance X-ray Diffractometer		Madison, WI
Fibroblast 3T3  cell	American Tissue Type Culture Collection		Manassas, VA
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM	Invitrogen		Grand Island, NY
Spectra max Gemini XPS microplate reader	Molecular Devices		Sunnyvale, CA
Student- Newman-Keuls post hoc test	SigmaPlot 12 software