Synthèse de nanofibres à base de kératine de génie biomédical

Résumé

nanofibres de électrofilées ont une grande surface au rapport de poids, une excellente intégrité mécanique, et de soutenir la croissance et la prolifération cellulaire. Ces nanofibres ont un large éventail d'applications biomédicales. Ici, nous fabriquons kératiniques / nanofibres PCL, en utilisant la technique d'électrofilage, et de caractériser les fibres pour des applications possibles dans l'ingénierie tissulaire.

Résumé

Électrofilage, du fait de sa polyvalence et le potentiel pour des applications dans divers domaines, est souvent utilisé pour fabriquer des nanofibres. La production de ces nanofibres poreux est d'un grand intérêt en raison de leurs propriétés physico-chimiques uniques. Ici, nous élaborons sur la fabrication de la kératine contenant poly (ε-caprolactone) (PCL) nanofibres (c.-à-PCL / fibre composite kératine). Eau kératine soluble a été extrait à partir de cheveux humains et mélangé avec PCL dans différents rapports. La solution mélangée de PCL / kératine a été transformé en membranes nanofibrous l'aide d'un laboratoire conçu électrofilage mis en place. la morphologie des fibres et les propriétés mécaniques de la nanofibre obtenue ont été observés et évalués en utilisant la microscopie électronique à balayage et d'essai à la traction. En outre, dégradabilité et chimiques propriétés du nanofibres ont été étudiées par FTIR. images MEB ont montré la morphologie de surface uniforme pour les fibres PCL / kératine de compositions différentes. Ceux-PCL / Keratin fibres ont également montré d'excellentes propriétés mécaniques telles que le module et l'échec du point de Young. cellules fibroblastes étaient capables de se fixer et proliférer prouvant ainsi une bonne viabilité cellulaire. Sur la base des caractéristiques décrites ci-dessus, on peut affirmer que les fortement nanofibres mélanges de polymères naturels et synthétiques peuvent représenter un excellent développement des matériaux composites qui peuvent être utilisés pour diverses applications biomédicales.

Introduction

Électrofilage est reconnue comme étant une méthode courante de réaliser des nanofibres de polymère. Les fibres peuvent être produites à l'échelle nanométrique et les propriétés des fibres sont personnalisables ^1. Ces évolutions et les caractéristiques des nanofibres électrofilées ont été particulièrement intéressant pour leurs applications en génie biomédical en particulier dans l'ingénierie tissulaire. Les nanofibres électrofilées possèdent des similitudes avec la matrice extracellulaire et de favoriser ainsi l'adhérence cellulaire, la migration et la prolifération ^2. En raison de cette ressemblance avec la matrice extracellulaire (ECM), les fibres électrofilées peuvent être utilisés comme matériaux pour aider à pansement, l'administration de médicaments, et pour les tissus d'ingénierie tels que le foie, les os, le cœur et les muscles ^3.

Une variété de différents polymères d'origine synthétique et naturel ont été utilisés pour créer des fibres électrofilées pour différentes applications en génie biomédical ^4. Récemment, il a été de plus en plus dansintérêt dans le développement de nanofibres composites par mélange des polymères synthétiques et naturels ^4. Dans ces compositions, le produit final héritent typiquement la résistance mécanique associé au polymère synthétique, tout en adoptant des signaux biologiques et les propriétés du polymère naturel.

Dans cette expérience, PCL et de la kératine sont présentés comme des polymères synthétiques et naturels à utiliser pour la synthèse d'un composite de nanofibres. La kératine est un polymère naturel que l'on trouve dans les cheveux, la laine et les ongles. Il contient de nombreux résidus d'acide aminé; d'intérêt notable est la cystéine ^4,5. Idéalement, un polymère naturel serait biorenouvelable, biocompatible et biodégradable. Kératine possède ces trois caractéristiques, tout en améliorant la prolifération cellulaire et l'attachement aux biomatériaux, il a été incorporé dans ^6.

Polycaprolactone (PCL) est un polymère résorbable, synthétique qui est important dansingénierie tissulaire ^4. Ce polymère a déjà été salué pour sa stabilité structurelle et mécanique, cependant, il n'a pas d'affinité cellulaire et présente un taux de dégradation de longue haleine. La nature hydrophobe de PCL est probablement responsable de l'absence d'affinité de la cellule ^7. Cependant, PCL compense ses limites en étant hautement miscible avec d'autres polymères. A PCL / composite kératine devrait démontrer les propriétés mécaniques du PCL et d'incorporer les propriétés biologiques de la kératine, ce qui en fait un choix idéal pour diverses applications biomédicales.

Protocole

Tout protocole suit les lignes directrices de l'Université d'Etat Bureau de la conformité et de l'éthique de la recherche North Carolina A & T.

1. Préparation des produits chimiques pour la kératine Extraction ⁴

1. Pour préparer 1000 ml de 2% en poids / volume solution d'acide peracétique (PAS), sous une hotte ajouter 20 ml d'acide peracétique à 980 ml d'eau désionisée (DI).
2. Pour préparer 1000 ml de solution de base Tris 100 mM (SCT), ajouter 12,2 g de Tris base à 1000 ml d'eau DI et remuer jusqu'à dissolution complète.
3. Préparer une solution diluée d'acide chlorhydrique (ASD) dans une hotte en versant 4 ml d'acide chlorhydrique concentré dans 30 ml d'eau DI.
4. Procurer environ 20 g de coupures de cheveux humains qui ne sont pas traités chimiquement ou modifiées. Les cheveux peuvent être de toute longueur.
5. Laver soigneusement les cheveux, à la main, avec de l'eau chaude et du savon. Utilisez (DI) de l'eau déminéralisée pour le rinçage final.
6. Mettre les cheveux en deux 600 ml béchers et placer dans un 80 ºC oême pendant 1 heure.
7. Égoutter le liquide du fond du récipient et le placer dans le four jusqu'à ce que les cheveux sont complètement secs.
8. Diviser séché les cheveux de façon égale entre les béchers de 600 ml, placer 10 g de cheveux dans chaque bécher. Ne pas laisser les cheveux pour remplir plus de 500 ml.
9. Verser 500 ml de PAS dans chaque bêcher en veillant à couvrir tous les cheveux. Couvrir les verres avec du parafilm et stocker pendant 12 heures.

2. Préparation de kératine Extrait Solution

1. Séparer les cheveux du PAS à l'aide d'un tamis de 500 um. Recueillir les PAS de déchets dans un récipient séparé. Rincer les cheveux avec de l'eau déminéralisée pour éliminer toute PAS restes.
2. Placer les cheveux rincés dans une fiole de 500 ml. Verser 400 ml de TBS dans le ballon, en prenant soin que les cheveux est couverte. Lieu ballon dans un bain secouant réglé à 38 ° C, 65 min pendant 1 heure.
3. Après 1 heure, retirer les tremblements de bain et verser le liquide, environ 400 ml de solution d'extraction de la kératine (KES), iNto un 1000 ml bécher.
4. Verser 400 ml d'eau désionisée dans le flacon contenant les cheveux veillant à ce que les cheveux sont couverts et le placer en arrière dans le bain sous agitation pendant une heure. Enlever le ballon du bain secouer et verser les 400 ml restants de l'KES dans le bécher de 1000 ml avec le KES déjà recueillis. Les cheveux ne sont plus nécessaires et peuvent être déversés sur le ballon et jeté dans la poubelle la plus proche.

3. Concentration de l'extrait de la solution de kératine

1. Remplir bain rotodistiller à la ligne supérieure avec de l'eau distillée et mis à 90 ºC. Réglez la vitesse de rotation de 200 tours par minute. Allumez le liquide de refroidissement refroidisseur-pompe et réglez à -10 ºC.
2. En utilisant un pH-mètre pour surveiller le pH de la KES, utiliser une pipette pour ajouter lentement 1 mM DHAS au KES jusqu'à atteindre un pH de 7,0. Incorporer lentement que la solution est ajoutée.
3. Verser le KES neutralisé dans les 500 ml de ballon à fond rond jusqu'à environ trimestre complet. Exécutez le distillateur selon fabricantprotocole de 1,25 h.
   1. Répétez l'étape 3.3 jusqu'à ce que le KES a été distillée. Assurez-vous que le ballon est fermement.

4. Extrait de dialyse de la solution de kératine

1. Verser la solution KES également en 12 14 ml tubes coniques séparées. Centrifuger les tubes à 1050 g pendant 10 min.
2. Verser le KES centrifugé dans un bécher propre, en veillant à vider des débris collectés. Répétez jusqu'à ce que la totalité de la KES a été centrifugé.
3. Remplir un 2000 ml graduée avec de l'eau DI.
4. Couper la dialyse membrane de cellulose de tube à 24 pouces, et le clip de l'une des extrémités du tube pour la maintenir fermée.
5. Tremper la longueur du tube dans le cylindre de l'eau DI pour le rendre plus souple et plus facile à ouvrir.
6. Ouvrir l'extrémité non découpée de la membrane de cellulose de tube de dialyse et verser lentement 60 ml d'une solution KES centrifugé dans le tube. Utilisez un autre clip pour fermer cette extrémité de la tubulure.
7. Mettez le ditube de aly en 2000 ml bouteille d'eau DI et laisser reposer pendant 24 h. Changez l'eau DI dans le cylindre tous les 3 à 4 heures.
8. Après la période de 24 heures, vider la solution KES dialyse dans des bocaux plafonnés, en étant sûr de laisser un espace au sommet et le placer dans le congélateur à -20 ° C pendant 24 heures.

5. La lyophilisation de la solution de kératine Extrait

1. Réglez le lyophilisateur à -86 ºC.
2. Retirer les bocaux contenant KES congelés du congélateur, retirez les capuchons des pots, et les placer dans des ampoules de lyophilisateur. Placez les joints sur les ampoules et tourner le bouton pour créer une pression à vide de 0.133 mbar. Lyophiliser les échantillons pendant environ 48 heures, jusqu'à ce que toute l'humidité a disparu.

6. Préparation des solutions Électrofilage (10% en poids de kératine Solution)

1. Retirez la kératine poudre du lyophilisateur et le peser.
2. Ajouter de l'eau DI à la poudre de kératine pour créer un 10% en poids / poidssolution de kératine.

7. Préparation de la solution à 10% de PCL de poids

1. Obtenir PCL (polymère ε-caprolactone, Mn de 70 à 90 kDa), et le trifluoroéthanol (TFE). Préparer un 10% en poids de PCL TFE en agitant O / N et d'obtenir un mélange homogène.

8. Préparation de la solution de kératine / PCL

1. Obtenir la solution de PCL 10% en poids et une solution préparée au préalable de la kératine 10% en poids. Ajouter la kératine dans la goutte de solution PCL sage afin de créer 10 ml PCL / solutions de kératine de 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 et ratios.
2. Utilisez un vortex pour obtenir un mélange homogène de la solution PCL / kératine avant électrofilage.

9. Production d'électrofilage PCL / fibre kératinique

1. Placer environ 8 ml de / PCL solution de kératine dans une seringue jetable de 10 ml muni d'un tube en plastique de diamètre 0,5 mm. Placer la seringue dans une pompe à seringue, où le débit est réglé à 2,5 ml / h.
2. Appliquer une tension à la pointe de l'aiguille reliée au tube (~ positionnée 23 cm à partir de la collecte de fibres tambour, et ~ 30 degrés par rapport à l'horizontale). Appliquer un 19 - tension kV 22 au tube et faire tourner le tambour de collecteur à environ 200 tours par minute.
   1. Enveloppez le tambour collecteur de papier d'aluminium avant de lancer l'échantillon. Faire en sorte que la feuille d'aluminium est stable par l'application de la bande de marquage sur chaque extrémité.
      Remarque: Les fibres se forment sur ​​la feuille d'aluminium (voir la figure 2), stocker la feuille recouverte de fibres à température ambiante.

10. Mechanical Analysis de PCL / kératine nanofibres

1. Couper l'échantillon en 60 mm par 8 mm. Assurez-vous d'enregistrer l'épaisseur à l'aide d'un micromètre numérique. Pour chaque composition préparée, utilisez cinq échantillons.
2. Attacher l'échantillon 60 x 8 mm dans l'essai de traction. Utilisez un porte-échantillon personnalisé conçu pour se fixer l'échantillon. Sandwich l'échantillon entre porte-échantillons qui est fabriqué à partir d'une carte d'index en utilisant doubleverso bande. Appliquer la cellule de charge 10 N avec un débit de 10 mm / min de déplacement.
   Remarque: Le support d'échantillon est conçu pour être 62 mm sur 40 mm avec une fenêtre interne de 50 mm par 38 mm.
3. extension de registre et les valeurs de charge grâce à des logiciels selon le protocole du logiciel.
4. Calculer le stress en divisant la force par zone de l'échantillon testé. Ensuite, calculer souche en divisant la variation de longueur par longueur initiale.
5. Générer la courbe de traction en traçant le stress dans l'axe des ordonnées pour correspondre valeur de déformation dans l'axe des x.
6. Calculer le module d'Young de la région linéaire, où la pente est égale au module d'élasticité. Déterminer la résistance à la traction de la parcelle de souche de stress en prenant décalage dans la souche 0,2% et traçant une ligne parallèle à la courbe de la région linéaire.
7. Effectuer l'analyse statistique des données mécaniques obtenues en triple précédemment en utilisant une analyse de variance à l'aide du logiciel d'analyse ^8. Les valeurs de p <0,05, nousêtes considéré comme statistiquement significatif.

11. Surface Morphologie et structurel Caractérisation

1. En utilisant un microscope électronique à balayage (MEB) avec des paramètres de tension d'accélération de 15 kV et un courant de 5 uA d'observer la morphologie des fibres électrofilées.
   1. Avant l'imagerie avec SEM, couper une section de 2 cm ² de la fibre et l'attacher à un stade SEM en utilisant du ruban de cuivre. Placez la scène à l'intérieur du dispositif de revêtement par pulvérisation et le manteau d'or à 15 mA pendant 1 min et 30 sec pour créer une couche épaisse d'environ 11 nm d'or. Chargez l'échantillon dans la chambre de la SEM. Respecter les échantillons de fibres.
2. En utilisant la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) pour caractériser la liaison chimique entre la PCL et la kératine. Placez la section 2 cm ² de la membrane électrofilés de nanofibres dans un support magnétique et purger le système avec de l'air sec avant le test. Obtenir des spectres de 200 scans et d'analyser les spectres en utilisant standard logiciel conformément au protocole du logiciel.
3. Effectuer une analyse de spectre en utilisant un logiciel standard et utiliser trois exemplaires de chaque rapport de nanofibres selon le protocole du fabricant.

12. étude de l'interaction cellule-fibres

1. Couper fibres en 16 mm ² échantillons. Utilisez, une colle biocompatible à base de silicone pour fixer chaque échantillon à lamelles avec un diamètre de 12 mm.
2. Collez une extrémité de l'échantillon de fibres à l'arrière de la lamelle, envelopper l'échantillon autour de la lamelle, puis collez l'extrémité libre de l'échantillon à l'arrière de la lamelle ainsi, laissant le haut de la glissade couverte avec seulement le échantillon de fibres.
3. Placer les échantillons de fibres dans une plaque à 24 puits. Stériliser les échantillons par immersion dans 80% d'éthanol pendant 1 heure.
4. Rincer l'éthanol à partir des échantillons à l'aide de l'eau déminéralisée. Puis, une pipette 2 ml de milieu de base sur les échantillons, en veillant à couvrir l'ensemble de l'échantillon. Retirer le milieu après 5 min.
5. Utilisez fibroblastes 3cellules T3 à ensemencer les échantillons de fibres. Suspendre les cellules dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec des antibiotiques et 10% de sérum bovin fœtal (FBS), de sorte qu'il y a environ 62 000 cellules / cm ² par 1 ml de DMEM.
6. Laisser tomber 1 ml de la solution contenant des cellules 3T3-DMEM dans chaque plaque et faire en sorte que chaque échantillon de fibre est recouverte d'environ 62 000 ^{cellules / cm2.} Incuber les puits des plaques pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO _2. Remarque: Utilisez 5% de CO _{2, car} ce niveau peut généralement maintenir le pH du milieu cellulaire dans la gamme physiologique pendant des jours.

13. Dégradation de la matrice nanofibres

1. Cut séché PCL / kératine des membranes de nanofibres en place d'environ 30 mm x 30 mm.
2. Stériliser les échantillons de 900 mm ² avec 80% d'alcool pour une période d'incubation de 10 min et laver soigneusement avec de l'eau DI. Incuber les échantillons dans 15 ml de PBS, pH 7,5, à 37 ° C. Remplacer le buffert tous les 3 jours.
3. Prenez les membranes de la solution à des intervalles déterminés, 1 semaine et 7 semaines, et rincer avec de l'eau DI.
4. Placer les échantillons de membrane dans des ampoules de lyophilisateur. Placez les joints sur les ampoules et tourner le bouton pour créer un vide. Lyophiliser pendant 24 heures, jusqu'à séchage complet.
5. Fixer l'échantillon séché à un stade SEM en utilisant du ruban de cuivre. Placez la scène à l'intérieur du dispositif de revêtement par pulvérisation et le manteau d'or à 15 mA pendant 1 min et 30 sec.
6. Chargez l'échantillon dans la chambre de la SEM. Respecter les échantillons de fibres à une tension d'accélération de 1,5 kV et 5 courant de pA.

Résultats

fibre Morphologie
images MEB des fibres ont été obtenues pour toutes les compositions de fibres. Voir la figure 3. Fibre image confirme que les fibres sont orientées de manière aléatoire.

essais mécaniques
Mécaniquement fibres résistantes sont généralement nécessaires pour diverses applications d'ingénierie tissulaire. Ces fibres doivent ...

Discussion

Extraction de la kératine des cheveux humains a été réalisée avec succès. L'acide peracétique a agi comme un agent oxydant sur la chevelure humaine, ce qui permet la kératine à être extraite par la base Tris. La production de poudre de kératine était petite échelle en raison du fait qu'il n'a été fait à des fins de recherche. Cette procédure a déjà été établie dans l'industrie pour la production à grande échelle. Le but de l'extraction de la kératine à petite échelle était...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Hair			Obtained from Local Barber Shop in Greensboro
Peracetic acid	Sigma Aldrich
PCL (e-caprolactone polymer)	Sigma Aldrich	502-44-3	Mn 70-90 kDa
Trifluoroethanol (TFE)	Sigma Aldrich	75-89-8
Tris Base (TrizmaTM Base Powder)	Sigma Aldrich		>99.9% crystalline
Hydrochloric Acid	Fischer Scientific	A144C-212 Lot 093601	Waltham, MA
Kwik-Sil	World Precision Instruments		Sarasota, FL
Cellulose membrane	Sigma Aldrich		12 - 14 kDa molecular cut off
optical microscope	Olympus BX51M	BX51M	Japan
scanning electron microscope	Hitachi SU8000	SU8000	Japan
Table-Top Shimadzu machine	North America Analytical and Measuring Instruments AGS-X series	AGS-X Series	Columbia, MD
Fourier transform infrared spectroscopy	Bruker Tensor 2 Instrument		Billerica, MA
Microcal Origin software			Northampton, MA
X-ray diffraction (XRD)	Bruker AXS D8 Advance X-ray Diffractometer		Madison, WI
Fibroblast 3T3  cell	American Tissue Type Culture Collection		Manassas, VA
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM	Invitrogen		Grand Island, NY
Spectra max Gemini XPS microplate reader	Molecular Devices		Sunnyvale, CA
Student- Newman-Keuls post hoc test	SigmaPlot 12 software