Síntese de nanofibras baseado em queratina de Engenharia Biomédica

Resumo

nanofibras electrospun têm uma área de superfície elevada em relação ao peso, a integridade mecânica excelente, e suportar o crescimento e proliferação celular. Estas nanofibras têm uma ampla gama de aplicações biomédicas. Aqui podemos fabricar queratina / nanofibras PCL, usando a técnica de electrospinning, e caracterizar as fibras para possíveis aplicações em engenharia de tecidos.

Resumo

Electrospinning, devido à sua versatilidade e potencial para aplicações em vários campos, está a ser frequentemente utilizado para fabricar nanofibras. A produção destes nanofibras porosa é de grande interesse devido às suas propriedades físico-químicas únicas. Aqui nós elaborar sobre a fabricação de queratina contendo poli (ε-caprolactona) (PCL) nanofibras (ou seja, PCL / fibra composta de queratina). queratina solúvel em água foi primeiro extraído a partir de cabelo humano e misturado com PCL em diferentes proporções. A solução combinada de PCL / queratina foi transformada em membranas nanofibrous usando um electrospinning laboratório concebido configurar. A morfologia das fibras e propriedades mecânicas do nanofibras obtidas foram observados e medidos através de microscopia eletrônica de varredura e testador de tração. Além disso, degradabilidade e químicas propriedades do nanofibras foram estudados por FTIR. MEV mostrou morfologia da superfície uniforme para fibras PCL / queratina de diferentes composições. Estes PCL / keratin fibras também mostrou excelentes propriedades mecânicas, tais como ponto de módulo e falha de Young. células de fibroblastos foram capazes de prender e proliferam, assim, provando boa viabilidade celular. Com base nas características acima discutidas, pode-se fortemente argumentam que as nanofibras de misturas de polímeros naturais e sintéticos podem representar um excelente desenvolvimento de materiais compósitos que podem ser usadas para diferentes aplicações biomédicas.

Introdução

Eletrofiação é reconhecido como um método predominante de realização nanofibras de polímero. As fibras podem ser produzidas em nanoescala e as propriedades das fibras são personalizada ^1. Estes desenvolvimentos e as características de nanofibras electrospun têm sido especialmente interessante para suas aplicações em engenharia biomédica especialmente em engenharia de tecidos. As nanofibras electrospun apresenta semelhanças com a matriz extracelular e, portanto, promover a adesão celular, a migração e proliferação ^2. Devido a esta semelhança com a matriz extracelular (ECM), fibras electrospun podem ser utilizados como materiais para auxiliar na limpeza de feridas, a entrega de drogas, e para tecidos de engenharia, tais como o fígado, ossos, coração, músculo e ^3.

Uma variedade de diferentes polímeros de origem sintética e natural foram usadas para criar fibras electrospun para diferentes aplicações de engenharia biomédica ^4. Recentemente, tem vindo a crescer emteresse no desenvolvimento de nanofibras compostas por mistura sintética e polímeros naturais ^4. Nestas composições os produtos finais tipicamente herdar a resistência mecânica associados com o polímero sintético, ao mesmo tempo que adopta pistas biológica e as propriedades do polímero natural.

Nesta experiência, PCL e queratina são apresentados como os polímeros sintéticos e naturais, para serem utilizados para a síntese de um composto de nanofibras. A queratina é um polímero natural que se encontra no cabelo, lã e unhas. Ela contém muitos resíduos de aminoácidos; de interesse notável é cisteína ^4,5. Idealmente um polímero de ocorrência natural seria biorenewable, biocompatível e biodegradável. Queratina possui todas estas três características, acentuando a proliferação celular e apego aos biomateriais tem sido incorporadas no ^6.

Policaprolactona (PCL) é um polímero reabsorvível, sintético que é significativo emengenharia de tecidos ^4. Este polímero foi anteriormente reconhecida por sua estabilidade estrutural e mecânica, no entanto, carece de afinidade celular e exibe uma taxa de degradação longa. A natureza hidrofóbica de PCL é provavelmente responsável para a falta de afinidade de células ^7. No entanto, PCL compensa suas limitações por ser altamente miscível com outros polímeros. A PCL / composite queratina deve demonstrar as propriedades mecânicas do PCL e incorporar as propriedades biológicas de queratina, tornando-o uma escolha ideal para várias aplicações biomédicas.

Protocolo

Todos protocolo segue as diretrizes do Escritório de Pesquisa Compliance e Ética da Universidade Estadual da Carolina do Norte A & T.

1. Preparação Químico para queratina Extraction ⁴

1. Para preparar 1000 ml de 2% p / v de solução de ácido peracético (PAS), sob uma coifa adicionar 20 ml de ácido peracético a 980 ml de Água desionizada (DI).
2. Para preparar 1000 ml de solução de base 100 mM Tris (TBS), adicione 12,2 g de Tris base a 1.000 ml de água DI e mexa até dissolver completamente.
3. Preparar a solução diluída de ácido clorídrico (DHAS) numa hotte vertendo 4 ml de ácido clorídrico concentrado em 30 ml de água Dl.
4. Obter aproximadamente 20 g de aparas de cabelo humano, que não foram tratadas quimicamente ou alterados. O cabelo pode ser de qualquer comprimento.
5. Lavar o cabelo cuidadosamente, à mão, com água morna e sabão. Use água deionizada (DI) para o enxágüe final.
6. Coloque o cabelo em duas 600 ml copos e colocar em um 80 ºC oven durante 1 h.
7. Drenar o líquido do fundo do copo e colocar de novo no forno até que o cabelo esteja completamente seco.
8. Divide cabelos secos igualmente entre os 600 ml copos, colocando 10 g de cabelo em cada copo. Não permita que o cabelo para preencher mais de 500 ml.
9. Despeje 500 ml de PAS em cada copo certificando-se de cobrir todo o cabelo. Cobrir os copos com parafilme e armazenar durante 12 h.

2. Preparação de queratina solução de extracção

1. Separa-se o cabelo da PAS usando um crivo de 500 um. Recolher as PAS resíduos em um recipiente separado. Lavar o cabelo cuidadosamente com água DI para remover qualquer PAS restante.
2. Colocar o cabelo lavado em um balão de 500 ml. Pour 400 ml de TBS para o balão, certificando-se que o cabelo é coberto. Colocar o balão num banho de agitação ajustado a 38 ° C, 65 rpm durante 1 h.
3. Após 1 hora, retire do tremendo banheira e despeje o líquido, cerca de 400 ml de solução de extracção queratina (KES), into num copo de 1000 ml.
4. Pour 400 ml de água Dl ao frasco contendo o cabelo assegurar que o cabelo é coberto e colocar de volta no banho de agitação durante 1 h. Retirar o balão do banho de agitação e despeje os restantes 400 ml de KES para o copo de 1000 ml com o KES previamente coletadas. O cabelo não é mais necessária e pode ser despejado para fora do frasco e descartado no receptáculo de lixo mais próxima.

3. A concentração de queratina solução de extracção

1. Encha banho rotodistiller para a linha superior com água destilada e ajustado para 90 ºC. Defina a velocidade de rotação de 200 rpm. Ligue o chiller-bomba de refrigeração e definir a -10 ºC.
2. Utilizando um medidor de pH para monitorizar o pH da KES, utilizar uma pipeta para adicionar lentamente DHAS 1 mM para o KES até atingir um pH de 7,0. Agita-se lentamente à medida que a solução é adicionada.
3. Despeje a KES neutralizada em 500 ml balão de fundo redondo até cerca trimestre completo. Execute o destilador de acordo com o fabricante doProtocolo para 1,25 h.
   1. Repetir o passo 3.3 até todo o KES foi destilada. O frasco que está ligado firmemente.

4. Diálise de queratina solução de extracção

1. Pour solução KES igualmente em 12 14 ml de tubos cónicos separadas. Centrifugar os tubos a 1050 xg durante 10 min.
2. Despeje a KES centrifugado para um copo limpo, certificando-se de deitar fora dos escombros recolhidos. Repetir até que todo o KES foi centrifugada.
3. Encha uma 2.000 ml cilindro graduado com água DI.
4. Corte de membrana de celulose tubulação de diálise a 24 polegadas, e prenda uma extremidade do tubo para mantê-la fechada.
5. Mergulhar o comprimento do tubo no interior do cilindro de água Dl para torná-lo mais flexível e mais fácil de abrir.
6. Abrir a extremidade não cortada da membrana de celulose tubo de diálise e lentamente verter 60 ml da solução KES centrifugado para o tubo. Use outro clipe para fechar esta extremidade do tubo.
7. Coloque o ditubo ANÁLISE no 2.000 ml cilindro de água DI e deixe descansar por 24 h. Mudar a água Dl no cilindro a cada 3 a 4 horas.
8. Após o período de 24 horas, esvaziar a solução KES dialisados ​​em frascos tapados, certificando-se de deixar espaço na parte superior e coloque no congelador a -20 ° C durante 24 h.

5. Liofilização de queratina solução de extracção

1. Defina o liofilizador a -86 ºC.
2. Retirar os frascos contendo congelada KES do congelador, retire as capas dos frascos e colocá-los em ampolas liofilizador. Coloque as vedações nas ampolas e gire o botão para criar uma pressão de vácuo de 0,133 mbar. Liofilizar as amostras durante cerca de 48 horas, até que toda a umidade está desaparecido.

6. Preparação de Soluções de electrospinning (10% em peso de solução de queratina)

1. Remover a queratina em pó a partir do liofilizador e pesá-lo.
2. Adicionar água Dl para o pó de queratina para criar a 10% peso / pesosolução de queratina.

7. Preparação de solução a 10% em peso de PCL

1. Obter PCL (polímero ε-caprolactona, Mn 70-90 kDa), e trifluoroetanol (TFE). Prepara-se uma 10% em peso de PCL em TFE por agitação S / N e se obter uma mistura homogénea.

8. Preparação de Solução queratina / PCL

1. Obter a solução de PCL a 10% em peso de solução previamente preparada e queratina 10% em peso. Adicionar queratina na gota solução PCL sábio, a fim de criar 10 ml PCL / soluções de queratina de 90:10, 80:20, 70:30 e 60:40 proporções.
2. Use um vortex para obter uma mistura homogénea de solução PCL / queratina antes eletrofiação.

9. Produção de electrospun PCL / fibra de queratina

1. Colocar aproximadamente 8 ml da solução de PCL / queratina numa seringa descartável de 10 ml, equipado com um tubo de plástico de diâmetro 0,5 mm. Colocar a seringa numa bomba de seringa em que a taxa de fluxo é ajustado para ser 2,5 ml / h.
2. Aplicar a tensão para a extremidade da agulha ligada ao tubo (~ posicionado 23 cm a partir da fibra de recolha do tambor, e ~ 30 graus a partir da horizontal). Aplicar um 19 - Tensão kV 22 ao tubo e girar o tambor colector em cerca de 200 rpm.
   1. Enrole o tambor colector com folha de alumínio antes de executar a amostra. Certifique-se de que a folha de alumínio é estável através da aplicação da fita de rotulagem em cada extremidade.
      Nota: As fibras irá formar na folha de alumínio (Ver Figura 2), armazenar a folha coberta de fibra à TA.

10. Análise Mecânica de PCL / queratina nanofibras

1. Cortar a amostra em 60 mm por 8 mm. Certifique-se de gravar a espessura usando micrômetro digital. Para cada uma das composições preparadas, usar cinco amostras.
2. Fixe a amostra de 60 x 8 mm para o testador de tração. Use um suporte de amostra projetado para anexar a amostra. Sanduíche da amostra entre suportes de amostra que é feita a partir de um cartão de índice usando duplofita de lado. Aplicar a célula 10 N de carga com uma taxa de deslocamento de 10 mm / min.
   Nota: O suporte de amostra foi projetado para ser 62 mm por 40 mm com uma janela interna de 50 mm por 38 mm.
3. extensão de registro e valores de carga por meio de software de acordo com o protocolo de software.
4. Calcule o estresse dividindo-se a força pela área da amostra testada. Em seguida, calcula-se dividindo a estirpe mudança no comprimento pelo comprimento inicial.
5. Gerar a curva de tensão-deformação traçando estresse em eixo y para o valor de tensão correspondente no eixo x.
6. Calcular o módulo de Young a partir da região linear onde inclinação é igual ao módulo de elasticidade. Determinar a força de tração do enredo estirpe estresse tomando 0,2 compensados ​​em estirpe% e desenhar uma linha paralela à curva região linear.
7. Realizar a análise estatística dos dados mecânicos obtidos em triplicado anteriormente utilizando a análise de variância usando software de análise ^8. Valores de p <0,05 nósestá considerado estatisticamente significativo.

11. Superfície Morfologia e Caracterização Estrutural

1. Use microscópio electrónico de varrimento (SEM) com parâmetros de tensão de aceleração de 15 kV e corrente de 5 mA para observar a morfologia das fibras electrospun.
   1. Antes de imagem com SEM, cortar uma secção 2 ^cm2 da fibra e anexá-lo a um estágio SEM utilizando fita de cobre. Coloque a fase interior do revestidor por crepitação e revestimento com ouro a 15 mA durante 1 min e 30 seg para criar uma camada de ouro de aproximadamente 11 nm de espessura. Coloque a amostra na câmara do SEM. Observe as amostras de fibras.
2. Use transformada de Fourier espectroscopia de infravermelho (FTIR) para caracterizar a ligação química entre o PCL e queratina. Coloque o ponto 2 ^cm2 da membrana electrospun nanofibras em um suporte magnético e purgar o sistema com ar seco antes do teste. Obter espectros para 200 scans e analisar o espectro usando stasoftware ndard acordo com o protocolo de software.
3. Realizar análise de espectro usando o software padrão e usar triplicado de cada relação de nanofibras de acordo com o protocolo do fabricante.

12. Estudos de Interacção de fibra celular

1. Fibras cortadas em 16 mm, ^duas amostras. Use um, à base de silicone cola biocompatível para corrigir cada amostra a lamelas com um diâmetro de 12 mm.
2. Cole uma extremidade da amostra de fibra para a parte de trás da lâmina de cobertura, embrulhar a amostra em torno da lamela, depois cola a extremidade livre da amostra para a parte de trás da lâmina de cobertura, bem como, deixando a parte superior do deslizamento coberto com apenas o amostra de fibra.
3. Coloque as amostras de fibras numa placa de 24 poços. Esterilizar as amostras por imersão em etanol a 80% durante 1 h.
4. Lavar o etanol a partir das amostras usando água Dl. Em seguida, pipeta de 2 ml de meio basal para as amostras, assegurando-se a cobrir a totalidade da amostra. Remover o meio após 5 min.
5. Use fibroblastos 3células T3 para semear as amostras de fibras. Suspender as células em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com antibióticos e soro bovino fetal a 10% (FBS), de modo que existem cerca de 62000 células / cm ² por 1 ml de DMEM.
6. 1 ml da solução de MEMD contendo células 3T3 em cada placa de assegurar que cada amostra de fibra é coberto com cerca de 62000 ^células / cm2. Incubar o bem-placas durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO _2. Nota: O uso de 5% de CO _{2, porque} esse nível pode normalmente manter o pH do meio celular no gama fisiológica para dia.

13. Degradação de nanofibras Matrix

1. Corte seco / membranas de nanofibras de queratina PCL em quadrado aproximadamente 30 mm x 30 mm.
2. Esterilizar as amostras de 900 mm ² com álcool 80% por um período de incubação de 10 min e lavar abundantemente com água DI. Incubar as amostras em 15 ml de PBS, pH 7,5, a 37 ° C. Substitua o buffer a cada 3 dias.
3. Tome as membranas fora da solução a intervalos especificados, 1 semana e 7 semanas, e enxaguar com água DI.
4. Coloque as amostras de membrana em ampolas liofilizador. Coloque as vedações nas ampolas e gire o botão para criar um vácuo. Liofilizar durante 24 horas, até que esteja completamente seco.
5. Fixe a amostra seca para um estágio SEM utilizando fita de cobre. Coloque a fase interior do revestidor por crepitação e revestimento com ouro a 15 mA durante 1 min e 30 seg.
6. Coloque a amostra na câmara do SEM. Observe as amostras de fibras a uma tensão de aceleração de 1,5 kV e 5 corrente mA.

Resultados

fibra Morfologia
As imagens SEM das fibras foram obtidos para todas as composições de fibra. Ver Figura 3. Imagem Fibra confirma que as fibras são orientadas aleatoriamente.

Ensaios mecânicos
Mecanicamente fibras fortes são geralmente necessários para várias aplicações de engenharia de tecidos. Estas fibras devem manter força e flexibilidade su...

Discussão

Extracção de queratina do cabelo humano foi conseguida com sucesso. O ácido peracético actuou como um agente de oxidação sobre o cabelo humano, permitindo que a queratina a ser extraído pela base Tris. A produção de pó de queratina era pequena escala, devido ao facto de que só foi feito para fins de investigação. Este processo já foi estabelecido na indústria para a produção em larga escala. O objectivo de extrair a queratina em pequena escala foi para controlar a contaminação, a variabilidade do lote...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Hair			Obtained from Local Barber Shop in Greensboro
Peracetic acid	Sigma Aldrich
PCL (e-caprolactone polymer)	Sigma Aldrich	502-44-3	Mn 70-90 kDa
Trifluoroethanol (TFE)	Sigma Aldrich	75-89-8
Tris Base (TrizmaTM Base Powder)	Sigma Aldrich		>99.9% crystalline
Hydrochloric Acid	Fischer Scientific	A144C-212 Lot 093601	Waltham, MA
Kwik-Sil	World Precision Instruments		Sarasota, FL
Cellulose membrane	Sigma Aldrich		12 - 14 kDa molecular cut off
optical microscope	Olympus BX51M	BX51M	Japan
scanning electron microscope	Hitachi SU8000	SU8000	Japan
Table-Top Shimadzu machine	North America Analytical and Measuring Instruments AGS-X series	AGS-X Series	Columbia, MD
Fourier transform infrared spectroscopy	Bruker Tensor 2 Instrument		Billerica, MA
Microcal Origin software			Northampton, MA
X-ray diffraction (XRD)	Bruker AXS D8 Advance X-ray Diffractometer		Madison, WI
Fibroblast 3T3  cell	American Tissue Type Culture Collection		Manassas, VA
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM	Invitrogen		Grand Island, NY
Spectra max Gemini XPS microplate reader	Molecular Devices		Sunnyvale, CA
Student- Newman-Keuls post hoc test	SigmaPlot 12 software