שבץ בחומר הלבן צדדי דגם Murine של קורטיקליים לחקר ניוון אקסונלית ולבן Matter לנוירוביולוגיה

Summary

Here we present methodology for the production of a focal stroke in murine white matter by local injection of an irreversible endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor (L-Nio). Presented are two stereotactic variations, retrograde neuronal tracing, and fresh tissue labeling and dissection that expand the potential applications of this technique.

Abstract

שבץ המשפיעים חשבונות בחומר לבנים של עד 25% של מצגות שבץ קליניות, מתרחש בשקט בשיעורים שעשויות להיות 5-10 לקפל יותר, ותורם רב להתפתחות של דמנציה וסקולרית. דגמים מעטה לשבץ חומר לבן מוקדים להתקיים זה חוסר הדגמים המתאימים עכב את הבנת מנגנוני הנוירולוגית המעורבת בתגובת פציעה ותיקון לאחר סוג זה של שבץ. המגבלה העיקרית של מודלי שבץ קורטיקליים אחרים היא שהם לא focally להגביל את האוטם אל החומר הלבן או אומתו בעיקר במינים שאינם בעכברים. זה מגביל את היכולת ליישם המגוון הרחב של כלי מחקר בעכברים ללמוד לנוירוביולוגיה לשבץ חומר לבן. כאן אנו מציגים מתודולוגיה לייצור האמין של שבץ מוחה מוקדים בעניין בעכברים לבן באמצעות זריקה מקומית של מעכב eNOS בלתי הפיך. כמו כן, אנו מציגים כמה וריאציות על הפרוטוקול הכללי כולל שני stereotactic ייחודיוריאציות, מעקב עצבי מדרדר, כמו גם תיוג רקמות טרי לנתיחה המרחיב את היישומים האפשריים מאוד של טכניקה זו. וריאציות אלו מאפשרות גישות מרובות כדי לנתח את השפעות הנוירולוגית של צורה נפוצה, אלתרה זה של שבץ.

Introduction

Stroke affecting the subcortical white matter is a common clinical entity, accounting for up to 25% of clinical strokes annually in the US ¹. Ischemic damage to white matter also occurs silently at a significantly higher rate and contributes to the development of vascular dementia ^2,3. Presently, patients with this form of cerebral ischemia have few, if any treatment choices. Despite the clinical importance of this disease, few clinically relevant animal models exist ^4,5.

The goal of this protocol is to produce a focal ischemic lesion within the murine white matter. This murine model of human disease allows the specific study of axonal injury response to stroke and how the cellular elements of white matter, namely oligodendrocytes and astrocytes along with axons, respond to and repair after stroke.

Previous reports have described a model of subcortical white matter stroke using endothelin-1 (ET-1) ⁶ that is similar to the one described here. Several key changes to the experimental protocol have been made thereby the potential uses of this model have expanded ^7,8. This protocol provides a reliable and modifiable strategy to produce a focal stroke within mouse brain white matter.

The major advantages of this model are the use of a chemical endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine HCl (L-Nio) ⁹ with no known paracrine effects on cellular elements of white matter which had been a complication of models using endothelin-1 ¹⁰. In addition, the stereotactic targeting of white matter in the mouse allows the use of any variety of transgenic or knockout strains, greatly expanding the available tools to determine the effect of stroke on brain white matter. Here, two variations on this technique are described and demonstrate some of the additional variations that can be utilized to enhance the understanding of axonal and white matter damage and repair after stroke.

Protocol

השימוש בבעלי חיים בפרוטוקול זה בוצע בהתאם לנהלים שאושרו על ידי האוניברסיטה של ​​טיפול בבעלי חיים קליפורניה בלוס אנג'לס ועדת שימוש.

הערה: התחל על ידי זיהוי אוכלוסיית murine היעד. במחקרים קודמים, wild-type זכרו רק עכברי C57 / BL6 שמשו, אולם עכברים מהונדסים או נוק אאוט שונים יכולים לשמש גם. שים לב קואורדינטות stereotactic מבוססים על האנטומיה C57 / BL6. מומלץ לכל משתמש בתחילה לאמת לוקליזציה של שבץ חומר לבן.

1. אינדוקציה שבץ החומר הלבן - גישת זוויתי המדיאלי

1. בגין על ידי הכנת פיפטה זכוכית משך באמצעות צינור נימי 0.5 מ"מ כך בקוטר דיסטלי הוא בין 15-25 מיקרומטר ^11.
2. הכן aliquot סטרילי 10 μl של L-נ.י.ו. (N (5) - (1) -iminoethyl-L-ornithine HCl) ב 27.4 מ"ג / מ"ל ​​(130 מיקרומטר) מלח רגיל 0.9% סטרילי.
3. מילוי מראש פיפטה זכוכית המשךעם קטן נפח של L-נ.י.ו. (2-5 μl) על ידי הדבקת פיפטה זכוכית צינורות לחבר לקו ואקום. הנח את פיפטה שטוח על גבי ספסל והכנס סוף נכנס הפתרון L-נ.י.ו..
   1. החלתי את הוואקום עד לפחות 2 מ"מ של חלק 0.5 מ"מ של פיפטה מתמלא. כבה את הוואקום למשוך את פיפטה. מניח אותו בצד עד שלב 1.12.
4. מניחים את העכבר בתא אינדוקציה ולגרום הרדמה של העכבר באמצעות isoflurane 32% תקן זרמו מאדה (5 L / min בשאיפה עם 5 חמצן L / min ו -0.5 ליטר / דקה N ₂₎ 1 דקות או עד anesthesized עמוק. העברת העכבר מנגנון stereotactic מצויד מיקרוסקופ stereotactic. תחזוקה לספק הרדמה באמצעות 32% isoflurane זרמו מאדה (2 ליטר / דקה בשאיפה עם 5 חמצן L / min ו -0.5 ליטר / דקה N ₂₎ וכן חרטומו. בדוק עומק ההרדמה עם קמצוץ הבוהן.
5. התאם את הזרוע הזריק ל -36 °.
6. אפיXA משך בעל פיפטה זכוכית אל הקצה הדיסטלי של מערכת הזרקה בלחץ נמוך נפח וצרף אותו בזרוע הזרקה של ההתקנה stereotactic.
7. מעיל הדובדבן החיה הרדים עם וזלין משחה דמעה מלאכותית מקום מעל שתי העיניים. כן שדה כירורגי סטרילי על ידי צבת וילון סטרילי מעל הראש של החיה עם פתח 5-10 סנטימטר מעל הראש. כן משטח כירורגית aspetic ידי גילוח הפרווה המכסה את הגולגולת. נקה את הקרקפת בבטאדין לסירוגין ו מטליות אלכוהול 70%.
8. לעשות חתך בקרקפת קו האמצע 1.5 ס"מ עם מספריים בסדר סטרילי לחשוף את פני הגולגולת. לייבש את הגולגולת עם מקלון צמר גפן סטרילי באמצעות מיקרוסקופ stereotactic בהגדלה 1-3X, להסיר את כל רקמת periosteal שמעליה באמצעות כלי הנקודות מיקרו סטרילי.
9. סמן את גבחת כנקודת התייחסות באמצעות סמן נקודה בסדר.
10. לקדוח craniotomy 2 מ"מ ellipitical באמצעות מקדח כירורגית Stip בסדר סטרילי0; החל בדיעבד על גבחת והארכת anteriorly רק השמאלי של קו האמצע. סר שבר עצם מכסת רקמות רכות כך בקליפת המוח ניתן דמיינה.
11. שמור בתחום כירורגית קליפת המוח משטח לח ידי החלת טיפות לסירוגין של תמיסת מלח סטרילית.
12. להטביע טפטפת זכוכית משך לזרוע מזרק של המנגנון stereotactic. יישר את הקצה הדיסטלי של פיפטה עם גבחת ואפס את הקואורדינטות stereotactic.
13. לקדם את פיפטה הקדמי / האחורי (A / P) המדיאלי / לרוחב (M / L) קואורדינטות מופיע בלוח 1 הראשון.
14. לקדם את פיפטה אל פני שטח קליפת המוח ואפס מדידת גב / גחון (D / V).
15. לאט להעביר את פיפטה לתוך המוח עד שמגיעים D / V הראשון לתאם בטבלה 1.
16. באמצעות מערכת הזרקה בלחץ נמוך נפח נקבע על 20 psi במשך 20 פולסים msec, להזריק 100 nl של L-נ.י.ו. לתוך המוח ולחכות 5 דקות כדי למנוע ריפלוקסאת מסלול פיפטה.
    1. השתמש reticle מכויל העינית של המיקרוסקופ stereotactic וכן הגדלה של 3X.
    2. בהתאם לכך, לעקור סך של 0.100 מ"מ ³ (0.5 אורך מ"מ טפטף בקוטר 0.5 מ"מ, מקביל ל -100 NL) מן פיפטה זכוכית משך עבור כל קבוצה של קואורדינטות. באמצעות reticule, למדוד ולתקנן שכן כל להגדיר משתנה בהתאם הגדלה וקשקשת בשימוש.
    3. למדידת נפח מדויקת במהלך כל זריקה, מתקרב פיפטה זוויתי עם מיקרוסקופ מהצד כך המניסקוס נוזל-האוויר יש נוף sagittal. המניסקוס אמור להופיע באותו מישור המוקד של שני הקיר הפנימי והחיצוני של פיפטה.
17. לאט למשוך את פיפטה וחזר על צעדי 1.13-1.16.3 על הסט השני ושלישי של קואורדינטות מופיעות בלוח 1.
18. לאחר הזריקה האחרונה, להסיר את פיפטה ולמקם שעוות עצם מספיק כדי למלא את אתר craniotomy. אpproximate קצות הפצע בקרקפת להיקשר עם דבק עורי.
19. להזריק 0.1 מיליליטר של 0.5% Marcaine לשולי הפצע באמצעות מחט 30 G סטרילי כדי למנוע למנוע כאב מקומי המשויכים חתך בקרקפת.
20. מחזירים את החיה לאנטיביוטיקה שלאחר הניתוח דיור ואספקה ​​(0.48 מ"ג / מ"ל ​​trimethoprim-sulfamethoxazole, או 0.5 מ"ג / מ"ל ​​levofloxacin) במי השתייה במשך 5 ימים.

2. אינדוקצית שבץ חומר לבן - גישת זוויתי אחורית

1. בצע שלבים 1.1-1.12 כפי בפרוטוקול הגישה זוויתי המדיאלי, למעט להתאים את הזרוע ההזרקה של ההתקנה stereotactic ל -45 מעלות בכיוון הקדמי אל האחורי.
2. לקדם את פיפטה A / P ו- M / L קואורדינטות תחילה סיפקה בטבלה 2.
3. שלבים נותרים שלמים 1.14-1.20 כמו בפרוטוקול הגישה זוויתי לרוחב.

3. תיוג המדרדר עצבי

1. כן סטרילית 10aliquot μl של L-נ.י.ו. ב 54.8 מ"ג / מ"ל ​​סליין 0.9% נורמלי.
2. כן aliquot סטרילי של 20% Fluororuby (או 20% אמינים dextran biotinylated או 2% Fluorogold) סליין 0.9% נורמלים.
3. לדלל יחד 1: 1 עבור ריכוזי הסופי של 27.4 מ"ג / מ"ל ​​L-נ.י.ו. ו -10% Fluororuby.
4. בצעו את פרוטוקול שבץ כנ"ל בצעדים 1.3-1.23.
5. דמיינו את נותב ניאון מקורי בסעיף הרקמה על ידי קיבעון זלוף, cryosectioning מיקרוסקופ כפי שתואר לעיל ^8.

עיבוד רקמות 4. Immunofluorescence

1. בהפרש שלאחר שבץ מתאים הנעים בין 3 שעות ל -14 ימים לאחר שבץ, להרדים עכברים באמצעות מנת יתר isoflurane או מקומיים IACUC אושרו הליך.
2. פתח את חלל בית החזה באמצעות מספריים בזווית וכנס מחט פרפר 23 G לתוך החדר השמאלי.
3. מניח חתך קטן העלייה הימנית באמצעות מספריים בסדר לאפשר מסלול יצוא של נוזל זלוף.
4. Transcardially perfuse עם 30-40 מ"ל של תמיסת מלח פוספט שנאגרו קר ואחריו 30-40 מ"ל של paraformaldehyde 4% קר בשיעור של 10 מ"ל / דק 'ב RT.
5. לערוף את העכבר להסיר את המוח באמצעות מספריים סטרילי כדי לפתוח את הגולגולת בדיעבד ולאחר מכן הסר בעדינות את הגולגולת שמעליה עם מרית, מניחים את המוח לתוך 4% קר PFA למשך 24 שעות, ולאחר מכן להעביר סוכרוז 30% ב PBS במשך 48 שעות .
6. כן ארבעים סעיפים צפים מיקרון באמצעות cryostat ולבצע עיבוד נוגדנים כפי שתואר לעיל ^6-8. במחקר זה, השתמש הנוגדנים הבאים: ארנב 200 נגד neurofilament (דילול 1: 500); ארנב-vimentin אנטי (1: 500); עז נגד GFAP (1: 500); ארנב נגד תייבא-1 (1: 1,000).

עיבוד רקמות 5. חלבון או ניתוח RNA

1. בהפרש שלאחר שבץ מתאים הנעים בין 3 שעות ל -14 ימים לאחר שבץ, להרדים באמצעות מנת יתר isoflurane או מקומיים IACUC אושר הליך.
2. לערוף אתעכבר ולהסיר את המוח באמצעות מספריים סטרילי כדי לפתוח את הגולגולת בדיעבד ולאחר מכן הסר בעדינות את הגולגולת שמעליה עם מרית.
3. הכנס מרית 4 מ"מ סטרילי בקדמת המוח לנתק את הנורה חוש הריח ואת עצבי הראייה. הרם בעדינות את המוח מתוך calvarium ומניחים למאגר לנתיחה קר כקרח (תמיסת מלח מאוזן של 1x האנק, 25 מ"מ HEPES-KOH, pH 7.4, 35 גלוקוז מ"מ, 4 מ"מ סודיום ביקרבונט, ו 0.01 מ"ג / מ"ל ​​cyclohexamide).
4. באמצעות בלוק מוח סכיני גילוח חדשים סטרילי, להכין 2-3 לוחות מ"מ המכילים שבץ ומקום למאגר לנתיחה קר.
5. תחת מיקרוסקופ לנתח, לזהות את הקורטקס המוטורי הבסיסי חומר לבן בחצי הכדור מוזרק. במרווחים שלאחר בתנועה ארוכה באזור ניתן לזהות ויזואלית על ידי נימק מוקדים וחיוורון המיאלין.
   הערה: במרווחי מוקדם שלאחר שבץ, הזרקה של L-נ.י.ו. מעורבב עם 1 μl של 10% מהיר גרין יכול לאפשר זיהוי חזותי של שבץ ( איור 4 א).
6. תחת הדרכתו של מיקרוסקופ לנתח באמצעות אזמל טרי, בזהירות לנתח את האזור של חומר לבן המכיל את השבץ, המזוהה באמצעות תיוג ירוק מהיר או אובדן רקמות. סר הקורטקס שמעליה בסטריאטום בסיסית כפי רצוי.

תוצאות

בעזרת המודל שהוצג, קליפת הסנסורית הבסיסית forelimb חומר הלבן יכולה להיות ממוקדת באופן מהימן. מודל שבץ כימי מושרה זו מפיק אובדן axonal ו המיאלין מוקדי, astrocytosis, ו microgliosis (איור 1), כפי שנראה בדרך כלל אוטמי אַגמִימִי אדם. באמצעות שלוש זריקות, מודל שימושי...

Discussion

מספר הדגמים הקודמים של שבץ קורטיקליים תואר כולל זריקות מוקד של אנדותלין -1 לתוך הקפסולה הפנימית, חומר לבן קורטיקליים בסטריאטום ב ^6,15 עכברוש ^12-14 והעכבר. מודלים מאוחרים יותר של משייכות מוקדים קטנות נצלו הזרקת microemboli כולסטרול בעורק התרדמה ¹⁶ ו חסימת photothro...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride	Calbiochem	400600-20MG
Isoflurane	Phoenix Pharmaceutical, Inc.	NDC 57319-559-06
Capillary tubes	World Precision Instruments	50-821-807
Picospritzer	Parker Instrumentation	Picospritzer II
Stereotactic setup	Kent Scientific	KSC51725
Pipette puller	KOPF	Model 720
Stereomicroscope SZ51	Olympus	88-124
Fine scissors	Fine Scientific Tools	14084-08
Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8547
Curved Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8598
Blunt dissection tool	Fine Scientific Tools	10066-15
Drill	Dremel	8220-1/28
Drill bits	Fine Scientific Tools	19007-05
Vetbond	3M	1469SB
Marcaine	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
Trimethoprim-Sulfamethaxole	STI Pharmacy	NDC 54879-007-16
Fluororuby	Fluorochrome Inc	30mg
Paraformaldehyde	Fisher	O4042-500
Sucrose	Fisher	BP220-10
Cryostat	Leica CM3050 S	14047033518
Glass slides	Fisher	12-544-7
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Dissection microscope	Nikon	SMZ1500
23 gauge butterfly needle	Fisher	14-840-35
10X Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14065056
1M HEPES-KOH, pH 7.4	Affymetrix	16924
D-Glucose	Sigma	G8270
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Cyclohexamide	Sigma	01810