軸索変性と白質神経生物学の研究のための皮質下白質ストロークの多彩なマウスモデル

要約

Here we present methodology for the production of a focal stroke in murine white matter by local injection of an irreversible endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor (L-Nio). Presented are two stereotactic variations, retrograde neuronal tracing, and fresh tissue labeling and dissection that expand the potential applications of this technique.

要約

ストローク臨床ストロークプレゼンテーションの最大25％を白質アカウントに影響を与え、5〜10倍大きくすることができる速度で静かに発生し、血管性認知症の発展に大きく貢献しています。焦点白質ストロークのいくつかのモデルが存在し、適切なモデルの欠如は、脳卒中のこのタイプの後に損傷応答と修復に関与する神経生物学のメカニズムの理解を妨げています。他の皮質下脳卒中モデルの主な制限は、彼らが限局的に白質に梗塞を制限しないか、主に非マウス種で確認されていることです。これは、白質ストロークの神経生物学を研究するために、マウス研究ツールを幅広く適用する能力を制限します。ここでは、不可逆的なeNOSの阻害剤の局所注射を使用して、マウスの白質における焦点脳卒中の信頼性の高い生産のための方法論を提示します。また、2つのユニークな定位を含む一般的なプロトコルにいくつかのバリエーションを提示しますバリエーション、大幅にこの技術の潜在的な用途を拡大する逆行性神経のトレースだけでなく、新鮮な組織標識および解剖。これらの変化は、脳卒中のこの共通とunderstudied形の神経生物学的効果を分析するための複数のアプローチを可能にします。

概要

Stroke affecting the subcortical white matter is a common clinical entity, accounting for up to 25% of clinical strokes annually in the US ¹. Ischemic damage to white matter also occurs silently at a significantly higher rate and contributes to the development of vascular dementia ^2,3. Presently, patients with this form of cerebral ischemia have few, if any treatment choices. Despite the clinical importance of this disease, few clinically relevant animal models exist ^4,5.

The goal of this protocol is to produce a focal ischemic lesion within the murine white matter. This murine model of human disease allows the specific study of axonal injury response to stroke and how the cellular elements of white matter, namely oligodendrocytes and astrocytes along with axons, respond to and repair after stroke.

Previous reports have described a model of subcortical white matter stroke using endothelin-1 (ET-1) ⁶ that is similar to the one described here. Several key changes to the experimental protocol have been made thereby the potential uses of this model have expanded ^7,8. This protocol provides a reliable and modifiable strategy to produce a focal stroke within mouse brain white matter.

The major advantages of this model are the use of a chemical endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine HCl (L-Nio) ⁹ with no known paracrine effects on cellular elements of white matter which had been a complication of models using endothelin-1 ¹⁰. In addition, the stereotactic targeting of white matter in the mouse allows the use of any variety of transgenic or knockout strains, greatly expanding the available tools to determine the effect of stroke on brain white matter. Here, two variations on this technique are described and demonstrate some of the additional variations that can be utilized to enhance the understanding of axonal and white matter damage and repair after stroke.

プロトコル

このプロトコルでの動物の使用は、カリフォルニア州ロサンゼルス動物実験委員会の大学によって承認された手順に従って行われています。

注：ターゲットマウスの人口を識別することによって開始します。以前の研究では、唯一の雄の野生型C57 / BL6マウスが使用されている、しかし、様々なトランスジェニックまたはノックアウトマウスを使用することもできます。定位座標はC57 / BL6の解剖学に基づいていることに注意してください。各ユーザーが最初に白質へのストロークの局在を確認することをお勧めします。

1.白質ストロークの誘導 - 内側側斜めのアプローチ

1. 先端径が15~25ミクロン¹¹との間にあるようには0.5mmのキャピラリーチューブを用いて引っ張らガラスピペットを調製することによって開始します。
2. 0.9％滅菌生理食塩水中27.4 mg / mlで（130μM）で - L-仁王の滅菌10μlのアリコート（（1）-iminoethyl-L-オルニチン塩酸N（5））を準備します。
3. 引っ張られたガラスピペットをプレフィルガラスピペットを固定することによりL-仁王（2-5μL）の小容量の真空ラインに接続されたチューブにします。作業台の上に平らにピペットを置き、L-仁王溶液中に引き込まの端を挿入します。
   1. ピペットの0.5ミリメートル部の少なくとも2ミリメートルが満たされるまで真空を適用します。真空の電源をオフにし、ピペットを撤回。ステップ1.12になるまでそれを脇に置きます。
4. 誘導チャンバー内にマウスを置き、標準の32％イソフルランを用いてマウスの麻酔を誘導し、1分間または深く麻酔されるまで（5 L /分5リットル/分の酸素と0.5 L / minのN ₂と吸入）気化器を通って流れます。定位顕微鏡を備えた定位装置にマウスを転送します。気化器を通って流れ32％イソフルランを使用して、メンテナンス麻酔を提供し、ノーズコーン（2 L /分5リットル/分の酸素と0.5 L / minのN ₂と吸入しました）。つま先のピンチで麻酔の深さを確認してください。
5. 36°に注入アームを調整します。
6. アッフィXAは、低容量の圧力噴射システムの先端にガラスピペットホルダーを引っ張り、定位セットアップの射出アームに取り付けます。
7. コー​​ト両目の上にワセリンと場所人工涙軟膏で麻酔動物のウィスカー。頭の上に5〜10センチメートル開口部と、動物の頭の上に滅菌ドレープを配置することにより、無菌手術野を準備します。頭蓋骨を覆う毛を剃ることによってaspetic手術用表面を準備します。ベタジンおよび70％アルコール綿棒を交互に頭皮をきれいにしてください。
8. 頭蓋骨の表面を露出させる滅菌細かいハサミ1.5センチ正中頭皮切開を行います。滅菌綿棒で頭蓋骨を乾燥さ1-3X倍率で定位顕微鏡を用いて、滅菌マイクロポイントツールを使用して、任意の上に重なる骨膜組織を除去します。
9. 細かい点マーカーを使用して、基準点としてマークブレグマ。
10. 滅菌細かいSTIP手術用ドリルビットを使用して、2ミリメートルellipitical開頭術をドリル0;ブレグマで後方に始まり、ちょうど正中線の左前方に延びています。骨片を取り外し、大脳皮質を可視化することができるように、軟組織の上に重なります。
11. 断続的に滅菌生理食塩水の滴を適用することによって、手術野と湿った皮質表面を保管してください。
12. 定位装置のインジェクタアームに引っ張らガラスピペットを貼り付けます。ブレグマとピペットの先端の位置を合わせ、定位座標をゼロ。
13. 最初の前方/後方（A / P）にピペットを進め、（M / L）内側/外側の表1に調整します。
14. 皮質表面にピペットを進め、背/腹側（D / V）測定をゼロ。
15. ゆっくりと第1のD / V、表1の座標に達するまで脳内にピペットを渡します。
16. 20ミリ秒パルスの20 psiで設定された低容量圧力噴射システムを使用して、脳内にL-仁王の100 NLを注入し、逆流を防止するために、5分を待ちますピペットトラックアップ。
    1. 定位顕微鏡の接眼レンズと3Xの倍率で校正レチクルを使用してください。
    2. したがって、座標のセットごとに引っ張らガラスピペットから（100 NLに対応し、直径0.5mmのピペットで0.5ミリメートルの長さ）0.100ミリメートル³の合計を変位。レチクルを使用することにより、それぞれが使用倍率とスケールに依存して変化する設定以来測定し、標準化します。
    3. 空気流体メニスカスがサジタルビューを持っているように、各注入時の正確な体積測定のために、側から顕微鏡で角度の付いたピペットに近づきます。メニスカスは、ピペットの内側と外側の壁の両方の同じ焦点面に表示されます。
17. ゆっくりピペットを撤回し、手順を繰り返し1.13-1.16.3 表1に提供された座標の2番目と3番目のセットで。
18. 最後の注射の後、ピペットを削除し、開頭術部位を満たすのに十分な骨ワックスを配置します。 A頭皮の傷の縁をpproximateと皮膚接着剤で結合します。
19. 頭皮切開に関連した局所疼痛を防止するために予防するために無菌の30 G針を使用して、創傷縁に0.5％マーカインを0.1mlを注入。
20. 5日間飲料水中ハウジングと供給術後の抗生物質（0.48 mg / mlでトリメトプリム・スルファメトキサゾール、または0.5 mg / mlとレボフロキサシン）に動物を返します。

2.白質ストロークの誘導 - 後方斜めアプローチ

1. 後部に前方を指向45度に定位セットアップの注入アームを調整する以外は、内側斜めのアプローチプロトコルのように、手順1.1から1.12を実行します。
2. 第1のA / Pにピペットを進め、M / Lは、 表2に提供さ座標。
3. 横方向の角度の付いたアプローチプロトコルのように、残りのステップ1.14から1.20までは完了。

3.逆行性神経ラベリング

1. 滅菌10を準備します0.9％の生理食塩水で54.8 mg / mlでのL-仁王μlのアリコート。
2. 0.9％の生理食塩水で20％Fluororuby（または20％ビオチン化デキストランアミンまたは2％フルオロゴールド）の無菌アリコートを準備します。
3. 27.4 mg / mlでL-NiO及び10％Fluororubyの最終濃度のために1：一緒に1を希釈します。
4. ステップ1.3から1.23に上記のようにストロークプロトコルを実行します。
5. 以前に^8を説明したように灌流固定、凍結切片および顕微鏡により組織切片でネイティブに蛍光トレーサーを可視化します。

免疫蛍光4.組織処理

1. 脳卒中後の14日に3時間の範囲の適切な脳卒中後の間隔で、イソフルラン過剰摂取またはローカルIACUC承認手続きを経て、マウスを安楽死させます。
2. 角度のついたハサミを使用して胸腔を開き、左心室に23 Gの翼状針を挿入します。
3. 灌流液のための流出トラックを可能にするために、微細なハサミを使用して右心房に小さなカットを配置します。
4. 経RTで10 ml /分の速度で冷4％パラホルムアルデヒド30〜40 MLにより、その後の冷リン酸緩衝化生理食塩水30〜40 mlの灌流。
5. マウスを刎ねると後方頭蓋骨を開くために、滅菌ハサミを使って脳を除去した後、静かに24時間の冷4％PFAに脳を、スパチュラで覆って頭蓋骨を削除置き、その後、48時間、PBS中30％スクロースに転送。
6. クライオスタットを用いて、40ミクロンの浮遊切片を作製し、以前^6-8に記載^{されている}よう^に 、抗体処理を行います。本研究では、以下の抗体を使用します：ウサギ抗ニューロフィラメント200（1：500希釈）。ウサギ抗ビメンチン（1：500）。ヤギ抗GFAP（1：500）。ウサギ抗伊庭-1（1：1,000）。

タンパク質またはRNA分析5.組織処理

1. 脳卒中後の14日に3時間の範囲の適切な脳卒中後の間隔で、イソフルラン過剰摂取またはローカルIACUC承認手続きを経て安楽死させます。
2. 首をはねます後方頭蓋骨を開き、静かにスパチュラで上層の頭蓋骨を削除するには、滅菌ハサミを使って脳をマウスおよび削除します。
3. 嗅球と視神経を切断するために、脳の前部に滅菌4ミリメートルのへらを挿入します。ゆっくり頭蓋冠から脳を持ち上げ、氷冷解剖バッファー（1×ハンクス液、25mMのHEPES-KOH、pHが7.4、35 mMグルコース、4 mMの重炭酸ナトリウム、および0.01 mg / mlでシクロヘキ）に配置します。
4. 脳ブロックおよび滅菌新しいかみそりの刃を使用して、冷たい解剖バッファにストロークと場所を含む2〜3ミリメートルのスラブを準備します。
5. 解剖顕微鏡下で、注入された半球に運動皮質の基礎となる白質を識別します。長い脳卒中後の間隔で、領域を視覚的巣状壊死およびミエリン蒼白によって同定することができます。
   注：以前の脳卒中後の間隔で、10％ファストグリーン1μlのと混合し、L-仁王の注射は、脳卒中の視覚的な識別を可能にすることができます（ 図4A）。
6. 解剖顕微鏡の指導の下、新鮮なメスを使用して、慎重にファストグリーンラベル付けや組織損失のいずれかによって識別さストロークを含む白質領域を解剖。所望のように上に重なる皮質と下にある線条体を削除します。

結果

提示されたモデルを用いて、白質下地前肢感覚皮質を確実に標的とすることができます。典型的にはヒトラクナ梗塞に見られるように、この化学的に誘発された脳卒中モデルは、焦点軸索およびミエリン損失、星状細胞、および小膠（ 図1）を生成します。 3回の注射を使用することにより、臨床的に有用なモデルは、前肢の運動課題⁷

ディスカッション

皮質下脳卒中の前モデルの数は、ラット^12-14とマウス^6,15における内部のカプセルへのエンドセリン-1の焦点注射、皮質下白質と線条体を含む、記載されています。小焦点脳卒中のより最近のモデルは、頸動脈¹⁶と、単一の貫通動脈¹⁷の光血栓閉塞中のコレステロール微小塞栓注射を利用してきました。これらのモデルのそれぞれが長所と短所⁵の両方を?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride	Calbiochem	400600-20MG
Isoflurane	Phoenix Pharmaceutical, Inc.	NDC 57319-559-06
Capillary tubes	World Precision Instruments	50-821-807
Picospritzer	Parker Instrumentation	Picospritzer II
Stereotactic setup	Kent Scientific	KSC51725
Pipette puller	KOPF	Model 720
Stereomicroscope SZ51	Olympus	88-124
Fine scissors	Fine Scientific Tools	14084-08
Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8547
Curved Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8598
Blunt dissection tool	Fine Scientific Tools	10066-15
Drill	Dremel	8220-1/28
Drill bits	Fine Scientific Tools	19007-05
Vetbond	3M	1469SB
Marcaine	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
Trimethoprim-Sulfamethaxole	STI Pharmacy	NDC 54879-007-16
Fluororuby	Fluorochrome Inc	30mg
Paraformaldehyde	Fisher	O4042-500
Sucrose	Fisher	BP220-10
Cryostat	Leica CM3050 S	14047033518
Glass slides	Fisher	12-544-7
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Dissection microscope	Nikon	SMZ1500
23 gauge butterfly needle	Fisher	14-840-35
10X Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14065056
1M HEPES-KOH, pH 7.4	Affymetrix	16924
D-Glucose	Sigma	G8270
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Cyclohexamide	Sigma	01810