Прикосновение Универсальный мышиной модели подкорковых белого вещества для изучения дегенерации аксонов и белого вещества нейробиологии

Резюме

Here we present methodology for the production of a focal stroke in murine white matter by local injection of an irreversible endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor (L-Nio). Presented are two stereotactic variations, retrograde neuronal tracing, and fresh tissue labeling and dissection that expand the potential applications of this technique.

Аннотация

Инсульт влияет на белые материя составляет до 25% клинических инсульта презентаций, происходит бесшумно по ставкам, которые могут быть в 5-10 раз больше, и вносит значительный вклад в развитие сосудистой деменции. Немногие модели фокальной белого инсульта вещества существуют, и это отсутствие соответствующих моделей затрудняет понимание нейробиологических механизмов, участвующих в реакции повреждения и восстановления после этого типа инсульта. Основным ограничением других подкорковых моделей инсульта является то, что они не ограничивают очаговым Инфаркт к белого вещества или в основном были подтверждены в не-мышиных видов. Это ограничивает возможность применять широкий спектр мышиных исследовательских инструментов для изучения нейробиологии белого инсульта вещества. Здесь мы представляем методологию для надежного производства фокальной инсульта в мышиной белом веществе, используя локальную инъекцию необратимого ингибитора ENOS. Мы также представляем несколько вариаций на общем протоколе, включая два уникальных стереотаксическойвариации, ретроградной нейронная трассировка, а также маркировки свежей ткани и рассечение, что существенно расширит возможности применения этой техники. Эти изменения позволяют несколько подходов к анализу последствий нейробиологических этой общей и изученной формой инсульта.

Введение

Stroke affecting the subcortical white matter is a common clinical entity, accounting for up to 25% of clinical strokes annually in the US ¹. Ischemic damage to white matter also occurs silently at a significantly higher rate and contributes to the development of vascular dementia ^2,3. Presently, patients with this form of cerebral ischemia have few, if any treatment choices. Despite the clinical importance of this disease, few clinically relevant animal models exist ^4,5.

The goal of this protocol is to produce a focal ischemic lesion within the murine white matter. This murine model of human disease allows the specific study of axonal injury response to stroke and how the cellular elements of white matter, namely oligodendrocytes and astrocytes along with axons, respond to and repair after stroke.

Previous reports have described a model of subcortical white matter stroke using endothelin-1 (ET-1) ⁶ that is similar to the one described here. Several key changes to the experimental protocol have been made thereby the potential uses of this model have expanded ^7,8. This protocol provides a reliable and modifiable strategy to produce a focal stroke within mouse brain white matter.

The major advantages of this model are the use of a chemical endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine HCl (L-Nio) ⁹ with no known paracrine effects on cellular elements of white matter which had been a complication of models using endothelin-1 ¹⁰. In addition, the stereotactic targeting of white matter in the mouse allows the use of any variety of transgenic or knockout strains, greatly expanding the available tools to determine the effect of stroke on brain white matter. Here, two variations on this technique are described and demonstrate some of the additional variations that can be utilized to enhance the understanding of axonal and white matter damage and repair after stroke.

протокол

Использование животных в этом протоколе было проведено в соответствии с процедурами, утвержденными в Университете Калифорнии в Лос-Анджелесе уходу и использованию животных комитета.

Примечание: Начните с определения мышиного населения целевой. В предыдущих исследованиях, только самцов дикого типа мышей линии C57 / BL6 были использованы, однако также могут быть использованы различные трансгенные или нокаутированные мыши. Обратите внимание, что Стереотаксические координаты основаны на С57 / НД6 анатомии. Рекомендуется, чтобы каждый пользователь сначала проверить локализацию инсульта до белого вещества.

1. Белое вещество Инсульт Induction - медиальная Угловая подход

1. Начинают с подготовки вытащил стеклянную пипетку с использованием 0,5 мм капиллярной трубки таким образом, что дистальный диаметр находится в диапазоне от ¹¹ мкм 15-25.
2. Приготовьте стерильную 10 мкл аликвоты L-Нио (N (5) - (1) -iminoethyl-L-орнитин HCl) при 27,4 мг / мл (130 мкМ) в стерильном 0,9% физиологического раствора.
3. Предварительно заполнить притянутое стеклянную пипеткус небольшим объемом L-Нио (2-5 мкл) путем прикреплени стеклянной пипетки для трубки соединена с вакуумной линией. Положите пипеток квартиру на скамейке сверху и вставьте притянутое конец в L-Нио раствора.
   1. Применение вакуума до тех пор, по крайней мере, на 2 мм 0,5 мм части пипетки не будет заполнена. Выключите пылесос и вынуть пипетку. Поместите его в сторону до шага 1.12.
4. Поместите мышь в индукционной камере и вызывают анестезию мыши , используя стандартный 32% изофлуран протекал через испаритель (5 л / мин вдыхают с 5 л / мин кислорода и 0,5 л / мин N ₂₎ в течение 1 мин или до глубоко анестезируют. Перенесите мышь в стереотаксической аппарат, снабженный стереотаксической микроскопом. Обеспечивают поддержание анестезии с использованием 32% изофлуран протекал через испаритель (2 л / мин вдыхают с 5 л / мин кислорода и 0,5 л / мин N ₂₎ и носового конуса. Проверьте глубину анестезии с пальца щепоткой.
5. Отрегулируйте инъекционный руку до 36 °.
6. AffiXa вытащил стеклянный держатель пипетки к дальнему концу системы впрыска под давлением низкого объема и прикрепить его к инъекционной руку стереотаксической установки.
7. Пальто усов наркозом животного с вазелином и место искусственного мазь слезу над обоими глазами. Приготовьте стерильную хирургическую поле путем размещения Салфетка стерильная над головой животного с отверстием 5-10 см над головой. Подготовка aspetic хирургической поверхности бритье мех, покрывающий череп. Очистите кожу головы с чередующимися бетадин и 70% спиртом тампоны.
8. Сделать 1,5 см по средней линии скальпа разрез стерильным мелкими ножницами, чтобы обнажить поверхность черепа. Сушат череп с стерильным ватным тампоном и с помощью стереотаксической микроскопа при увеличении 1-3 раза, удалите облегающего периостальное ткани с помощью стерильного инструмента микро точки.
9. Отметьте брегма в качестве опорной точки, используя тонкую точку маркера.
10. Дрель 2 мм ellipitical краниотомия с помощью стерильной тонкой хирургической Stip сверло0, начиная кзади на темени и кпереди, простирающейся только слева от средней линии. Удалить фрагменты костей и вышележащих мягких тканей, так что кора головного мозга можно визуализировать.
11. Держите операционное поле и корковое поверхность влажной за счет прерывистого нанесения капель стерильного физиологического раствора.
12. Прикрепите вытащил стеклянную пипетку к инжектору плеча стереотаксической аппарата. Совместите дальний конец пипетки с темени и нулю стереотаксической координаты.
13. Advance пипетку к первой передней / задней (A / P) и медиальной / боковой (M / L) координаты приведены в таблице 1.
14. Advance пипетку к поверхности коры и обнулить спинные / вентральной (D / V) измерение.
15. Медленно пройти пипетку в мозг до достижения первой D / V координат в таблице 1.
16. Используя систему впрыска под давлением низкого объема установлена ​​в размере 20 фунтов на квадратный дюйм в течение 20 мс импульсов, вводят 100 нл L-Нио в мозг и подождать 5 минут, чтобы предотвратить рефлюксдо пипетки дорожки.
    1. Используйте калиброванный визира в окуляр микроскопа стереотаксической и увеличением 3X.
    2. Соответственно, смещают в общей сложности 0,100 мм ³ (длина 0,5 мм в пипетку диаметром 0,5 мм, что соответствует 100 нл) из захватного стеклянной пипетки для каждого набора координат. С помощью ридикюль, измерения и стандартизации, поскольку каждый настройки изменяется в зависимости от увеличения и шкал.
    3. Для точного измерения объема при каждой инъекции, приближаются к наклонную пипетку с микроскопом со стороны так, чтобы воздух-жидкость мениска имеет сагиттальный вид. Мениск должен появиться в той же фокальной плоскости и на внутренней, и внешней стенкой пипеткой.
17. Медленно вывести пипетку и повторить шаги 1.13-1.16.3 на втором и третьем наборе координат , представленных в таблице 1.
18. После последней инъекции, удалите пипеткой и поместите достаточное количество костной массы воска, чтобы заполнить сайт краниотомии.pproximate края раны кожи головы и связать с кожном клеем.
19. Вводят 0,1 мл 0,5% -ного Marcaine в краев раны с использованием стерильного 30 G иглу, чтобы предотвратить, чтобы предотвратить локальную боль, связанную с кожей головы надрез.
20. Вернуть животное к жилью и снабжения Послеоперационный антибиотиками (0,48 мг / мл триметоприм-сульфаметоксазол, или 0,5 мг / мл левофлоксацина) в питьевой воде в течение 5 дней.

2. Белое вещество Инсульт Induction - Задней Угловая подход

1. Выполните шаги 1.1-1.12 как в медиальной под углом протокола захода на посадку, за исключением регулировки впрыска руку стереотаксической установки до 45 градусов ориентированных передних к задним.
2. Advance пипетку к первому A / P и M / L координаты приведены в таблице 2.
3. Полные оставшиеся шаги 1.14-1.20, как в боковом угловом протокола захода на посадку.

3. Ретроградная Нейрональная Этикетировочное

1. Подготовить стерильный 10мкл аликвоты L-Нио при 54,8 мг / мл в 0,9% физиологического раствора.
2. Приготовьте стерильную аликвоты 20% Fluororuby (или 20% биотинилированным декстрана амина или 2% Fluorogold) в 0,9% физиологическом растворе.
3. Разведите вместе соотношении 1: 1 для конечной концентрации 27,4 мг / мл L-Нио и 10% Fluororuby.
4. Выполнение протокола хода, как описано выше в пунктах 1.3-1.23.
5. Визуализируйте изначально флуоресцентного индикатора в секции ткани путем перфузионной фиксации, cryosectioning и микроскопии , как описано выше ^8.

4. обработка ткани для иммунофлуоресценции

1. При соответствующем интервале постинсультной в интервале от 3 часов до 14 дней после инсульта, усыпить мышей через изофлуран передозировки или местного IACUC утвержденной процедурой.
2. Откройте грудной полости с помощью ножниц под углом и вставить 23 G бабочки иглу в левый желудочек.
3. Поместите небольшой разрез в правом предсердии с помощью тонких ножниц, чтобы отток дорожки для перфузионной жидкости.
4. Транскардиальную обрызгивать с 30-40 мл холодного забуференного фосфатом физиологического раствора с последующим 30-40 мл холодной 4% параформальдегида со скоростью 10 мл / мин при комнатной температуре.
5. Обезглавьте мыши и удалить мозг с помощью стерильных ножниц, чтобы открыть череп кзади, а затем аккуратно удалить облегающего череп с лопаточкой, поместите мозг в холодной 4% PFA в течение 24 ч, а затем передать до 30% сахарозы в PBS в течение 48 часов ,
6. Подготовьте сорок микрон плавающих частей с помощью криостата и выполнять обработку антитела , как было описано выше ^6-8. В данном исследовании используются следующие антитела: кролик анти-нейрофиламентов 200 (1: 500 разведение); кролика против виментин (1: 500); козий анти-GFAP (1: 500); кроличье анти-Iba-1 (1: 1000).

5. обработка ткани для анализа белка или РНК

1. При соответствующем интервале постинсультной в интервале от 3 часов до 14 дней после инсульта, усыпить с помощью изофлуран передозировки или местный IACUC утвержденной процедурой.
2. обезглавитьмыши и удалить мозг с помощью стерильных ножниц, чтобы открыть череп кзади, а затем аккуратно удалить облегающего череп с помощью шпателя.
3. Вставьте стерильный 4 мм шпателем на передней части мозга, чтобы разъединить обонятельную луковицу и зрительных нервов. Осторожно поднимите мозг из свода черепа и поместить в ледяную рассечение буфера (1х Хэнкса сбалансированный солевой раствор, 25 мМ HEPES-KOH, рН 7,4, 35 мМ глюкозы, 4 мМ бикарбонат натрия, и 0,01 мг / мл cyclohexamide).
4. Используя блок мозга и стерильные новые лезвия бритвы, подготовить 2-3 мм плиты, содержащие ход и место в холодном буфере рассечение.
5. Под микроскопом рассекает, определить белого вещества основной моторной коры в закачиваемой полушарии. На более длинных интервалах постинсультных, область может быть визуально идентифицирован очаговым некрозом и миелиновой бледность.
   Примечание: В более ранних интервалах после инсульта, инъекции L-Нио смешивают с 1 мкл 10% Fast Green может позволить визуальную идентификацию инсульта ( Рисунок 4A).
6. Под руководством рассекает микроскопом и с использованием свежей скальпель, тщательно препарировать область белого вещества, содержащего инсульт, идентифицированного либо Fast Green маркировки или потери ткани. Удалить облегающего корой и подстилающей полосатого тела по желанию.

Результаты

Используя модель, представленную, белое вещество лежащий в основе передних конечностей сенсомоторной коры головного мозга надежно могут быть направлены. Это химически индуцированных модель удара производит фокусного аксонов и потерю миелина, астроцитоз и microgliosis

Обсуждение

Ряд предыдущих моделей подкорковых инсульта были описаны в том числе очаговых инъекции эндотелина-1 во внутреннюю капсулу, подкорковых белого вещества и полосатого тела в крыс и мышей ^{12-14 6,15.} Более поздние модели небольших очаговых инсультов использовали холестерина инъек...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride	Calbiochem	400600-20MG
Isoflurane	Phoenix Pharmaceutical, Inc.	NDC 57319-559-06
Capillary tubes	World Precision Instruments	50-821-807
Picospritzer	Parker Instrumentation	Picospritzer II
Stereotactic setup	Kent Scientific	KSC51725
Pipette puller	KOPF	Model 720
Stereomicroscope SZ51	Olympus	88-124
Fine scissors	Fine Scientific Tools	14084-08
Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8547
Curved Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8598
Blunt dissection tool	Fine Scientific Tools	10066-15
Drill	Dremel	8220-1/28
Drill bits	Fine Scientific Tools	19007-05
Vetbond	3M	1469SB
Marcaine	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
Trimethoprim-Sulfamethaxole	STI Pharmacy	NDC 54879-007-16
Fluororuby	Fluorochrome Inc	30mg
Paraformaldehyde	Fisher	O4042-500
Sucrose	Fisher	BP220-10
Cryostat	Leica CM3050 S	14047033518
Glass slides	Fisher	12-544-7
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Dissection microscope	Nikon	SMZ1500
23 gauge butterfly needle	Fisher	14-840-35
10X Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14065056
1M HEPES-KOH, pH 7.4	Affymetrix	16924
D-Glucose	Sigma	G8270
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Cyclohexamide	Sigma	01810