Ein vielseitiges Mausmodell von Subcortical Weiß Matter Stroke für das Studium der axonalen Degeneration and White Matter Neurobiologie

Zusammenfassung

Here we present methodology for the production of a focal stroke in murine white matter by local injection of an irreversible endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor (L-Nio). Presented are two stereotactic variations, retrograde neuronal tracing, and fresh tissue labeling and dissection that expand the potential applications of this technique.

Zusammenfassung

Schlaganfall beeinflussen weißen Substanz macht bis zu 25% der klinischen Schlaganfall Präsentationen, tritt leise auf Raten, die 5-10-fach größer, und trägt wesentlich zur Entwicklung von vaskulärer Demenz sein kann. Nur wenige Modelle von fokalen weißen Substanz Schlaganfall existieren und dieser Mangel an geeigneten Modellen hat Verständnis der neurobiologischen Mechanismen zu Verletzungen Antwort und Reparatur nach dieser Art von Schlaganfall beteiligt behindert. Die Hauptbeschränkung von anderen subkortikalen Schlaganfallmodellen ist, dass sie nicht fokal Infarkt zu der weißen Substanz zu beschränken oder haben in nicht-murine Arten validiert primär sind. Dies begrenzt die Fähigkeit, die Vielzahl von murinen Forschungswerkzeuge anzuwenden, um die Neurobiologie der weißen Substanz Schlaganfall zu studieren. Hier präsentieren wir eine Methode für die zuverlässige Herstellung eines fokalen Schlaganfalls in murine weißen Substanz eine lokale Injektion eines irreversiblen eNOS-Inhibitor verwendet wird. Wir präsentieren auch mehrere Varianten auf dem allgemeinen Protokoll einschließlich zwei einzigartige StereotaxieVariationen, retrograden neuronale Tracing sowie frisches Gewebe Kennzeichnung und Dissektion, die stark die möglichen Anwendungen dieser Technik erweitern. Diese Variationen erlauben für mehrere Ansätze, um die neurobiologischen Auswirkungen dieser gemeinsamen und erforschten Form von Schlaganfall zu analysieren.

Einleitung

Stroke affecting the subcortical white matter is a common clinical entity, accounting for up to 25% of clinical strokes annually in the US ¹. Ischemic damage to white matter also occurs silently at a significantly higher rate and contributes to the development of vascular dementia ^2,3. Presently, patients with this form of cerebral ischemia have few, if any treatment choices. Despite the clinical importance of this disease, few clinically relevant animal models exist ^4,5.

The goal of this protocol is to produce a focal ischemic lesion within the murine white matter. This murine model of human disease allows the specific study of axonal injury response to stroke and how the cellular elements of white matter, namely oligodendrocytes and astrocytes along with axons, respond to and repair after stroke.

Previous reports have described a model of subcortical white matter stroke using endothelin-1 (ET-1) ⁶ that is similar to the one described here. Several key changes to the experimental protocol have been made thereby the potential uses of this model have expanded ^7,8. This protocol provides a reliable and modifiable strategy to produce a focal stroke within mouse brain white matter.

The major advantages of this model are the use of a chemical endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine HCl (L-Nio) ⁹ with no known paracrine effects on cellular elements of white matter which had been a complication of models using endothelin-1 ¹⁰. In addition, the stereotactic targeting of white matter in the mouse allows the use of any variety of transgenic or knockout strains, greatly expanding the available tools to determine the effect of stroke on brain white matter. Here, two variations on this technique are described and demonstrate some of the additional variations that can be utilized to enhance the understanding of axonal and white matter damage and repair after stroke.

Protokoll

Die Verwendung von Tieren in diesem Protokoll wurde in Übereinstimmung mit Verfahren, die von der University of California Los Angeles Animal Care und Use Committee genehmigt durchgeführt wurde.

Hinweis: Beginnen Sie mit der Ziel murine Bevölkerung zu identifizieren. In früheren Studien, nur männliche Wildtyp-C57 / BL6-Mäusen verwendet wurden, jedoch verschiedene transgenen oder Knockout-Mäuse auch verwendet werden können. Beachten Sie, dass sind stereotaktischen Koordinaten basierend auf C57 / Bl6 Anatomie. Es wird empfohlen, dass jeder Benutzer zunächst die Lokalisierung des Hubs zu der weißen Substanz zu überprüfen.

1. Weiß Matter Stroke Induktion - Medial mit schräger Ansatz

1. Beginnen Sie mit einer gezogenen Glaspipette unter Verwendung von 0,5 mm Kapillarrohr vorbereitet , so dass der distale Durchmesser zwischen 15 bis 25 & mgr; m ¹¹ ist.
2. Bereiten einer sterilen 10-ul-Aliquot von L-Nio (N (5) - (1) -iminoethyl-L-Ornithin HCl) bei 27,4 mg / ml (130 uM) in steriler 0,9% normale Kochsalzlösung.
3. Vorfüllen die gezogener Glaspipettemit einem kleinen Volumen von L-Nio (2-5 & mgr; l) durch die Glaspipette Befestigung mit einer Vakuumleitung an die Rohrleitung. Legen Sie die Pipette flach auf der Tischplatte und setzen Sie das zog Ende in die L-Nio Lösung.
   1. Übernehmen des Vakuums, bis mindestens 2 mm von der 0,5 mm Abschnitt der Pipetten gefüllt ist. Schalten Sie das Vakuum aus, und die Pipette zurückziehen. Legen Sie sie beiseite, bis Schritt 1.12.
4. Platzieren Sie die Maus in einer Induktionskammer und induzieren Anästhesie der Maus unter Verwendung von Standard 32% Isofluran floss durch einen Verdampfer (5 l / min inhaliert mit 5 l / min Sauerstoff und 0,5 l / min N ₂₎ für 1 min oder bis tief anästhesiert. Übertragen Sie die Maus an einen stereotaktischen Apparat mit einem stereotaktischen Mikroskop ausgestattet. Geben Sie Isofluran Aufrechterhaltung der Narkose mit 32% floss durch einen Verdampfer (2 l / min inhaliert mit 5 l / min Sauerstoff und 0,5 l / min N ₂₎ und einem Nasenkegel. Prüfen Tiefe der Anästhesie mit einer Zehe Prise.
5. Stellen Sie den Injektionsarm bis 36 °.
6. Affixa gezogen Glaspipette Halter an das distale Ende eines geringen Volumendruck-Einspritzsystem und befestigen Sie es an der Injektions Arm des Stereotaxie-Setup.
7. Mantel des narkotisierten Tieres Whiskers mit Vaseline und Ort künstliche Tränen Salbe über beide Augen. Bereiten Sie eine sterile OP-Feld durch einen sterilen Tuch über den Kopf des Tieres mit einer 5-10 cm Öffnung über den Kopf stellen. Bereiten Sie eine aseptischen OP-Oberfläche, die durch das Fell rasiert den Schädel überlagert. Reinigen Sie die Kopfhaut mit abwechselnden betadine und 70% Alkoholtupfer.
8. Machen Sie eine 1,5 cm Mittellinie Kopfhauteinschnitt mit sterilen feinen Schere, um die Schädeloberfläche zu belichten. Trocknen Sie den Schädel mit einem sterilen Wattestäbchen und unter Verwendung eines stereotaktischen Mikroskop bei 1-3x Vergrößerung, entfernen Sie alle darüber liegenden periostaler Gewebe eine sterile Mikropunkt-Werkzeug.
9. Markieren Sie die Bregma als Referenzpunkt einen feinen Punkt Marker.
10. Bohren Sie ein 2 mm ellipitical Craniotomie einer sterilen feinen stip chirurgische Bohrer mit0; posterior am Bregma beginnen und nach vorne gerade links von der Mittellinie erstrecken. Entfernen von Knochenfragmenten und Weichgewebe überlagert, so dass der Großhirnrinde sichtbar gemacht werden kann.
11. Halten Sie das OP-Feld und kortikalen Oberfläche feucht durch intermittierend Tropfen steriler Kochsalzlösung anwenden.
12. Affix eine gezogen Glaspipette mit dem Injektor Arm des stereotaktischen Apparat. Richten Sie das distale Ende der Pipette mit dem Bregma und Null, um die stereotaktischen Koordinaten.
13. Vorzurücken die Pipette mit dem ersten anterioren / posterioren (A / P) und medial / lateral (M / L) -Koordinaten in Tabelle 1 bereitgestellt.
14. Schieben Sie die Pipette auf die kortikalen Oberfläche und Null die dorsale / ventralen (D / V) Messung.
15. Passieren langsam die Pipette in das Gehirn bis zum Erreichen der ersten D / V in Tabelle 1 zu koordinieren.
16. Mit einem geringen Volumendruck-Einspritzsystem bei 20 psi für 20 ms Impulse gesetzt, injizieren 100 nl von L-Nio in das Gehirn ein und warten 5 Minuten Reflux zu verhindernup der Pipette Spur.
    1. Verwenden eines kalibrierten Retikel in das Okular des Stereotaxie-Mikroskop und einer Vergrößerung von 3X.
    2. Dementsprechend insgesamt 0,100 mm ³ (0,5 mm Länge in einer 0,5 mm Durchmesser Pipette bis 100 nl entspricht) verdrängen aus der ausgezogenen Glaspipette für jeden Satz von Koordinaten. Mit der Einrichtung eines reticule mit, zu messen und zu standardisieren, da jeder einrichten variiert in Abhängigkeit von der Vergrößerung und Skalen verwendet.
    3. Für eine genaue Volumenmessung während jedes Einspritz nähern sich die abgewinkelten Pipette mit dem Mikroskop von der Seite, so dass der Flüssigkeitsmeniskus eine Sagittalansicht aufweist. Der Meniskus sollte in der gleichen Brennebene erscheinen sowohl der Innen- und Außenwand der Pipette.
17. Langsam die Pipette zurückziehen und die Schritte wiederholen 1.13-1.16.3 bei der zweiten und dritten Satz von Koordinaten in Tabelle 1 zur Verfügung gestellt.
18. Nach der letzten Injektion, entfernen Sie die Pipette und legen genug Knochenwachs die Kraniotomiestelle zu füllen. EINpproximate die Kanten der Kopfhaut Wunde und binden mit dermal Klebstoff.
19. Injizieren von 0,1 ml 0,5% Marcain in die Wundränder eine sterile 30 G-Nadel zu verhindern, lokale Schmerzen zu verhindern, mit der Kopfhaut Einschnitt verbunden.
20. Bringen Sie das Tier mit dem Gehäuse und Versorgung postoperativer Antibiotika (0,48 mg / ml Trimethoprim-Sulfamethoxazol oder 0,5 mg / ml Levofloxacin) im Trinkwasser für 5 Tage.

2. Weiß Matter Stroke Induktion - posterior gewinkelt Ansatz

1. Führen Sie die Schritte 1,1-1,12 wie im medialen abgewinkelte Ansatz Protokoll, mit Ausnahme der Injektionsarm des stereotaktischen Setup anpassen, um 45 Grad ausgerichtet von vorne nach hinten.
2. Vorzurücken die Pipette mit dem ersten A / P und M / L - Koordinaten in Tabelle 2 bereitgestellt.
3. Vollständige verbleibenden Schritte 1,14-1,20 wie in der seitlichen abgewinkelten Ansatz Protokoll.

3. Rückläufige Neuronale Labeling

1. Bereiten Sie eine sterile 10& mgr; l Aliquot von L-Nio bei 54,8 mg / ml in 0,9% physiologischer Kochsalzlösung.
2. Bereiten Sie eine sterile aliquote Menge von 20% Fluororuby (oder 20% biotinyliertes Dextran Amin oder 2% Fluorogold) in 0,9% physiologischer Kochsalzlösung.
3. Verdünnte zusammen 1: 1 für Endkonzentrationen von 27,4 mg / ml L-NiO und 10% Fluororuby.
4. Führen Sie den Hub-Protokoll, wie oben in den Schritten 1,3-1,23.
5. Visualisieren Sie die nativ fluoreszierende Tracer in Gewebeschnitt durch Perfusionsfixierung, Kryoschneiden und Mikroskopie wie zuvor ⁸ beschrieben.

4. Gewebeverarbeitung für Immunofluoreszenz

1. Zu einem geeigneten post-Takt-Intervall im Bereich von 3 Stunden bis 14 Tage nach Schlaganfall, einschläfern Mäuse über Isofluran Überdosierung oder lokalen IACUC Verfahren genehmigt.
2. Öffnen Sie die Brusthöhle mit abgewinkelten Schere und legen Sie eine 23 G Butterfly-Nadel in den linken Ventrikel.
3. Setzen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof mit einer feinen Schere einen Abfluss Spur für die Perfusionsflüssigkeit zu ermöglichen.
4. Transkardial mit 30-40 ml kaltem Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung perfundiert von 30-40 ml kaltem 4% Paraformaldehyd bei einer Rate von 10 ml / min bei RT verfolgt.
5. Enthaupten die Maus und entfernen Sie das Gehirn mit einer sterilen Schere den Schädel posterior zu öffnen und entfernen Sie dann vorsichtig den darüber liegenden Schädel mit einem Spatel, legen Sie das Gehirn in kalte 4% PFA für 24 h und dann übertragen auf 30% Saccharose in PBS für 48 Stunden .
6. Bereiten Sie vierzig Mikron schwebenden Abschnitte unter Verwendung eines Kryostats und Antikörper - Verarbeitung durchführen , wie zuvor ^6-8 beschrieben. In dieser Studie wurden die folgenden Antikörper: Kaninchen-Anti-Neurofilament 200 (1: 500 Verdünnung); Kaninchen-anti-Vimentin (1: 500); Ziege-Anti-GFAP (1: 500); Kaninchen-anti-Iba-1 (1: 1000).

5. Gewebeverarbeitung für Protein oder RNA-Analyse

1. Zu einem geeigneten post-Takt-Intervall im Bereich von 3 Stunden bis 14 Tagen nach dem Schlaganfall, einschläfern über Isofluran Überdosierung oder lokalen IACUC Verfahren genehmigt.
2. enthaupten dieMaus und das Gehirn mit einer sterilen Schere entfernen Sie den Schädel posterior zu öffnen und dann mit einem Spachtel die darüber liegende Schädel sanft entfernen.
3. Legen Sie eine sterile 4 mm Spachtel an der Vorderseite des Gehirns Riechkolben und Sehnerven zu trennen. Heben Sie vorsichtig das Gehirn aus dem Schädelkalotte aufnehmen und in eiskalten Dissektion Puffer (1x Hanks Balanced Salt Solution, 25 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 35 mM Glucose, 4 mM Natriumbicarbonat und 0,01 mg / ml Cycloheximid).
4. Mit einem Gehirn blockieren und sterile neue Rasierklingen, vorbereiten 2-3 mm Platten den Hub und Ort in kalte Dissektion Puffer enthält.
5. Unter einem Binokular, identifizieren die weiße Substanz zugrunde liegenden motorischen Kortex in der injizierten Hemisphäre. Bei längeren post stroke Intervallen kann die Region visuell durch fokale Nekrosen und Myelin Blässe identifiziert werden.
   Hinweis: Bei früheren Post-Takt-Intervalle, die Injektion von L-Nio gemischt mit 1 ul 10% Fast Green kann eine visuelle Identifikation des Hubs ermöglichen ( 4A).
6. Unter Anleitung eines Binokular und ein frisches Skalpell vorsichtig die Region der weißen Substanz sezieren den Hub enthält, identifiziert durch entweder Fast Green Kennzeichnung oder Gewebeverlust. Entfernen Sie darüber liegenden Kortex und der zugrunde liegenden Striatum nach Wunsch.

Ergebnisse

Mit dem Modell dargestellt wird, kann die weiße Substanz zugrunde liegenden forelimb sensomotorischen Kortex zuverlässig ausgerichtet sein. Diese chemisch induzierte Hubmodell produziert Brenn axonalen und Myelinverlust, Astrozytose und Mikrogliose (Abbildung 1), wie sie typischerweise in menschlichen lacunar Infarkte zu sehen ist. Durch die Verwendung von drei Injektionen, ein klinisch nützliches Modell mit frühen Beeinträchtigung auf forelimb motorischen Aufgaben ...

Diskussion

Eine Anzahl von früheren Modellen von subkortikalen Schlaganfall einschließlich Brenn Injektionen von Endothelin-1 in die Capsula interna, subkortikalen weißen Substanz und Striatum in der Ratte und Maus - ^{12-14 6,15} beschrieben. Neuere Modelle von kleinen Brenn Hübe haben Cholesterin Mikroemboli Injektion in die Arterie carotis ¹⁶ verwendet und photothrombotic Okklusion eines einzelnen eindringenden arteriole ^17. Jedes dieser Modelle hat sowohl Vorteile als auch Nachteile...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride	Calbiochem	400600-20MG
Isoflurane	Phoenix Pharmaceutical, Inc.	NDC 57319-559-06
Capillary tubes	World Precision Instruments	50-821-807
Picospritzer	Parker Instrumentation	Picospritzer II
Stereotactic setup	Kent Scientific	KSC51725
Pipette puller	KOPF	Model 720
Stereomicroscope SZ51	Olympus	88-124
Fine scissors	Fine Scientific Tools	14084-08
Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8547
Curved Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8598
Blunt dissection tool	Fine Scientific Tools	10066-15
Drill	Dremel	8220-1/28
Drill bits	Fine Scientific Tools	19007-05
Vetbond	3M	1469SB
Marcaine	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
Trimethoprim-Sulfamethaxole	STI Pharmacy	NDC 54879-007-16
Fluororuby	Fluorochrome Inc	30mg
Paraformaldehyde	Fisher	O4042-500
Sucrose	Fisher	BP220-10
Cryostat	Leica CM3050 S	14047033518
Glass slides	Fisher	12-544-7
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Dissection microscope	Nikon	SMZ1500
23 gauge butterfly needle	Fisher	14-840-35
10X Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14065056
1M HEPES-KOH, pH 7.4	Affymetrix	16924
D-Glucose	Sigma	G8270
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Cyclohexamide	Sigma	01810