JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Abstract

מליחות היא מאפיין חשוב של הסביבה המימית. לאורגניזמים מימיים הוא מגדיר את בתי הגידול של מים מתוקים, מים מליחים, ומי ים. בדיקות הרעילות של חומרים כימיים והערכות הסיכונים האקולוגיים שלהם לאורגניזמים מימיים מבוצעות לעתים קרובות במים מתוקים, אך הרעיל של כימיקלים לאורגניזמים מימיים תלוי pH, טמפרטורה, ומליחויות. אין שיטה, עם זאת, לבדיקת התלות המליחה רעילה לאורגניזמים מימיים. הנה, השתמשנו medaka (Oryzias latipes) כי הם יכולים להסתגל מים מתוקים, מים מליחים, ומי ים. ריכוזים שונים של המדיום העובר לגידול (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, ו- 30x) הועסקו כדי לבדוק את רעילות של חלקיקים nanocolloidal כסף (SNCs) כדי Medaka ביצים (ERM 1x ו 30x ERM יש מקבילה לחץ אוסמוטי כדי מים מתוקים ומי ים, בהתאמה). בשש-גם צלחות פלסטיק, 15 ביצי Medaka בשלושה עותקים נחשפו SNCs ב 10 מ"ג / L &# 8722; 1 בריכוזים שונים של ERM ב- pH 7 ו -25 ° C בחושך.

אנו השתמשנו במיקרוסקופ לנתח מיקרומטר למדוד את קצב לב לכל 15 קוטר שניות ועין ביום 6 ואורך גוף מלא של הזחלים על בקיעת יום (סעיף 4). עובר נצפו עד בקיעה או יום 14; אז אנחנו נספר שיעור הבקיעה כל יום במשך 14 ימים (סעיף 4). כדי לראות הצטברות כסף בעוברים, השתמשנו מצמידים אינדוקטיבי ספקטרומטריית מסה פלזמה למדוד את ריכוז כסף של פתרונות בדיקה (סעיף 5) ועוברים dechorionated (סעיף 6) .the רעילות של SNCs עוברי medaka ברור גדל עם הגדלת המליחות. שיטה חדשה זו מאפשרת לנו לבדוק את הרעילות של כימיקלים במליחות שונה.

Introduction

מאז הקמתה של הארגון לשיתוף פעולה ולפיתוח כלכלי (OECD) הנחיות הבדיקה לכימיקלים בדיקות בשנת 1979, 38 הנחיות הבדיקה פורסמו בסעיף 2 של הנחיות, השפעות על ביוטי מערכות 1. כל אורגניזמים הימיים נבדקו כבר מן בתי גידול של מים מתוקים, צמחי מים מתוקים כלומר; אַצוֹת; חסרי חוליות כגון דפניות ו chironomids; ודגים כגון medaka, דג זברה, ו פורל קשת. בהשוואה לסביבות מים מלוחות, מים מתוקי סביבות מושפעות באופן ישיר יותר על ידי פעילות כלכלית ותעשייתית אדם. לכן, בסביבות מים מתוקים כבר עדיפות לבדיקה משום שהם נמצאים בסיכון גבוה יותר מזיהום.

באזורי החוף, כולל שפכי נהרות, למליחות להשתנות בין תנאי מים מליחים ומי ים, ואזורים אלה מזוהמים לעיתים קרובות על ידי פעילות תעשייתית 2. באזורי החוף ביצות הקשורים בהם מאופיינים high מגוון ביולוגי ופריון אקולוגי. מערכות אקולוגיות החוף ולכן צריך להיות מוגן מפני זיהום כימי. עם זאת, יש הוגבל מחקר ecotoxicological בבתי גידול מים מליחים ומי ים.

Sakaizumi 3 בחן את האינטראקציות רעילים בין מתיל-כספית ומליחות בביצים Medaka היפני ומצא כי להגביר את הלחץ האוסמוטי של פתרון המבחן משופרת הרעילות של מתיל-כספית. . Sumitani ואח 4 בשימוש ביצים Medaka לחקור את הרעילות של התשטיפים הטמנה; הם מצאו כי השקילות האוסמוטי של התשטיפים אל הביצים היו המפתח גרימת מומים במהלך embryogenesis. בנוסף, Kashiwada 5 דיווחה כי חלקיקי פלסטיק (39.4 ננומטר בקוטר) חלחלו בקלות הדרך הסיסית medaka הביצה בתנאים מליחים (15x הבינוני גידול העובר (ERM)).

דגם דגים קטן טיפוסי, Medaka היפני (latipes Oryzias ) נעשה שימוש בביולוגיה בסיסית ecotoxicology 6. Medaka היפני יכול לחיות בתנאים החל מים מתוקים מי ים בגלל תאי כלוריד המפותחים ביותר שלהם 7. לכן הם עשויים להיות שימושיים לבדיקה בתנאים עם מגוון רחב של למליחות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Medaka היפני השתמש במחקר זה טופל באופן הומאני בהתאם להנחיות המוסדיות של Toyo אונ' ובשים לב להקלה של מצוקה ואי נוחות.

1. כסף Nanocolloids (SNCs)

  1. לרכוש SNCs המטוהר (20 מ"ג / ל -1, טוהר% 99.99, חלקיקים מתכוונים בקוטר כ ננומטר 28.4 ± 8.5 המרחפים במים מזוקקים).
  2. אמת את הטוהר וריכוז של הכסף על ידי ספקטרומטריית מסת פלזמה מצמידה אינדוקטיבי (ICP-MS) מנתח על פי הפעלה במדריך 8. השיטה המקדימה עבור ICP-MS הניתוחי מתוארת בסעיף 7.

2. הכנת פתרונות SNC (תערובות של קולואידים סילבר Ag +) עם המליחות שונים

  1. הכן 60 × ERM בהיקף של 60 גרם NaCl, KCl 1.8 גרם, 2.4 גרם CaCl 2 · 2H 2 O, ו 9.78 גרם MgSO 4 · 7H 2 O ב 1 ליטר של ultמי rapure; להתאים את ה- pH ל 7.0 עם 1.25% NaHCO 3 במים ultrapure.
  2. מערבבים את הפתרון ERM ב 25 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. מערבבים SNCs עם ERM מדולל. הכן 40 מ"ל של כל פתרון מעורב SNC-ERM. הריכוז הסופי הוא 10 מ"ג / ל -1 של SNCs בריכוזים שונים של ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, 30x או).
  4. התאם את ה- pH של הפתרון המעורב SNC-ERM ל -7.0 עם 0.625% NaHCO 3 במי ultrapure. התאמת pH חשובה מאוד בהכנת פתרון SNC, כי שחרור Ag + בהנחייתם בתנאים חומציים 9.
  5. השתמש אגנו 3 כמתחם התייחסות SNCs.
    1. מערבבים אגנו 3 עם מדולל ERM. הכן 40 מ"ל של אגנו 3 -ERM פתרון מעורב לעבר ריכוז אגנו 3 של 15.7 מ"ג / ל -1 (10 מ"ג / ל -1 כסף) בריכוזים שונים של ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, 30x או) .
      הערה: כדי לבדוק רעילות קולואיד כסף, אגנו 3פתרון, אשר מהווה מקור של כסף מסיס, משמש כמתחם התייחסות SNCs, שהם תערובת של קולואידים כסף וכסף מסיס.

תרבות ביצה קציר 3. Medaka

  1. השג את medaka (O. latipes) (זן כתום-אדום) (60 גברים ו -60 נשים).
  2. Medaka תרבות כקבוצות (20 זכרים ו -20 נקבות כקבוצה אחת) ב ERM 1x ב 3 טנקים L באמצעות מערכת culturing זרימה דרך medaka.
    1. תרבות על התנאים הבאים:
      טווח ה- pH של מדיום התרבות: 6.2 כדי 6.5
      מחזור כהה:: אור 16: 8 שעות
      טמפרטורה של מדיום התרבות: 24 ± 0.5 ° C
      הלחץ האוסמוטי של המדיום תרבות: 257 mOsm
  3. Feed medaka על Nauplii Salina הארטמיה בשעה 10:00 (פעם ביום) ולהאכיל דיאטה דגים יבש מלאכותית בשעה 09:00, 11:00, 13:00, 15:00, 17:00 (חמש פעמים ביום).
    1. השג א Salina Nauplii.
    2. כן 5 ליטר של תמיסת מלח 3.0% בכוס פלסטיק.
    3. להוסיף 30 גרם של ביצים ארטמיה לפתרון מלח בכוס.
    4. דגירת הביצים על 25 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות עם המבעבעים (4 L / min -1) באמצעות משאבת אוורור.
    5. לאחר 48 שעות, לעצור את המבעבע.
    6. אפשר הפתרון לעמוד במשך 5 עד 10 דקות כדי להפריד את א בקע Salina Nauplii (חלק תחתון של הפתרון) מן הביצים וקליפות ביצים שלא נולדו (חלק עליון של הפתרון).
    7. הסר את השכבה העליונה של הפתרון על ידי decantation.
    8. סנן את החלק התחתון של הפתרון דרך מסננת עם פתחים של 283 מיקרומטר, לאסוף את Nauplii העוברות על רשת עם פתחים של 198 מיקרומטר.
    9. להאכיל את Nauplii אל medaka בתוך 6 שעות.
  4. לאחר Medaka הנקבה הולידה, להסיר את אשכולות ביצה החיצוניים בעדינות מהגופים 'הנקבות או לאסוף את הביצים מהתחתיות האקווריום באמצעות SMהכל בניכוי (גודל נטו 5 ס"מ x 5 ס"מ, גודל החור 0.2 מ"מ x 0.2 מ"מ).
  5. שוטפים את אשכול ביצה עם מים זורמים מהברז במשך 5 שניות.
  6. הוסף את כל אשכולות ביצת השטופה 30x פתרון ERM.
  7. הסר את האשכולות מהפתרון לאחר 1 דקות ומניחים אשכולות הביצה בין מגבות נייר היבשות אנד רול בעדינות.
  8. מכניסים את הביצים בחזרה ERM 30x.
  9. בחר ביצים מופרות תחת מיקרוסקופ לנתח.
  10. מקום שנבחר 810 ביצי ERM 1x בשש-גם צלחות פלסטיק באמצעות מלקחיים.
  11. לדגור על הביצים של 25 ± 0.1 ° C באינקובטור עד לשלב ההתפתחותי 21. (שלבי ההתפתחות של עוברי medaka הוגדרו מהעבודה של Iwamatsu 10.)
  12. בחרו ביצים וטופחו על השלב ההתפתחותי 21 תחת מיקרוסקופ לנתח.
  13. לשטוף ביצים שנבחרו עם ERM 1x.
  14. נושא את הביצים שטופות לניסויי חשיפה (סעיף 4).

4. בדיקת רעילות של SNCs או אגנו 3 ב למליחות ERM השונה

  1. לשטוף ביצים Medaka (שלב 21) שלוש פעמים עם פתרון המבחן [SNCs (10 מ"ג / ל -1) או אגנו 3 (15.7 מ"ג / ל -1 ל -10 מ"ג / ל -1 כסף) בכל ריכוז של ERM (1x, 5x , 10x, 15x, 20x, 30x או) ב- pH 7]. כפי שולט, להשתמש ביצי 1 × 30 × ERM ב- pH 7.
  2. הוסף 15 ביצים שטפו עד 5 מיליליטר של כל פתרון מבחן בצלחות פלסטיק שש היטב. (בצע את ניסויי החשיפה שלוש פעמים במשך SNC או אגנו רעיל 3 בדיקות באמצעות כל פתרון מבחן.)
  3. לעטוף את הצלחות בנייר אלומיניום.
  4. דגירת הצלחות העטופות ב 25 ° C בחושך עד בקיעה או במשך 14 ימים.
  5. שים את הביצים החשופות כל 24 שעות עבור שינויים ביולוגיים וביצים מתות (איורים 1 ו -2).
  6. להחליף את פתרונות בדיקה כל 24 שעות.
  7. בצעו תצפיות כדלקמן.
    1. ביום 6 של חשיפה, לספור את קצב הלב (מחיר 15 שניות) oעוברים Medaka f תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות סטופר (איור 3 א).
    2. ביום 6 של חשיפה, למדוד את גודל העין (קוטר) של עוברים medaka תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מיקרומטר (איור 3B).
    3. ביום הבקיעה, למדוד את אורכי גוף מלא של הזחלים תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מיקרומטר (איור 3c).
    4. לספור את המספר הכולל של ביצים חשופות שבוקעות במשך 14 הימים (איור 3D).

בידוד 5. של כסף מסיס מפתרון SNC, וניתוח כסף

  1. לבודד כסף מסיס מכל פתרון SNC (תערובת של קולואידים כסף וכסף מסיס) על ידי סינון דרך פילטר קרום 3 kDa ב 14,000 x ז ו -4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. שימוש במסנן קרום 3 kDa לבודד כסף מסיס מן SNCs, משום בקוטר הממוצע המדווחים של SNCs מצטבר ב ERM 1x הוא 67.8 ננומטר 11 אnd כי של Ag + הוא 0.162 ננומטר 12; קרום 3 kDa כולל חלקיקים בקוטר של 2 ננומטר או יותר 13.
  2. למדוד את ריכוז הכסף ב 50 μl של פתרון מסונן (= ריכוז הכסף המסיס) על ידי (3E איור) ניתוח ICP-MS בהתאם למדריך 8 פועלי ICP-MS. השיטה המקדימה עבור ICP-MS הניתוחי מתוארת בסעיף 7.

6. מדידת כסף פגיעה מתמשכת ב Medaka עוברים

  1. לחשוף ביצים Medaka (שלב 21) כדי SNCs או אגנו 3 כמפורט בסעיף 4.
  2. ביום 6 של חשיפה, להסיר סיסי מן הביצה (כלומר, dechorion) באמצעות medaka בקיעת אנזים לפי הפרוטוקול המתואר בספר Medaka 14.
  3. למדוד את ריכוז הכסף של ביצי dechorioned ניתוח ICP-MS פי (3F איור) ידני 8 פועלי ICP-MS. המקדיםשיטת ICP-MS הניתוחי מתוארת בסעיף 7.

מדידה 7. הריכוזיות כסף על ידי ICP-MS Analysis

  1. להוסיף דוגמאות [50 μl של פתרון כסף (עבור אימות של ריכוז כסף; סעיף 1); שלושה עוברי dechorionated (סעיף 5); או 50 μl של פתרון מסוננים (סעיף 5)] כדי מבחנה טפלון 50 מ"ל.
  2. להוסיף 2.0 מ"ל של חומצה חנקתית ultrapure אל מבחנה 50 מ"ל.
  3. מחממים את התערובת על פלטה חשמלית ב 110 מעלות צלזיוס עד ממש לפני שהוא מתייבש (כ -3 שעות).
  4. כדי לפזר את החומר האורגני לחלוטין, להוסיף 2.0 מ"ל של חומצה חנקתית ultrapure ו -0.5 מ"ל של מי חמצן אל מבחנה.
  5. מחממים את התערובת שוב על צלחת חמה אלא רגע לפני מתייבש (כ -3 שעות).
  6. ממיסים את שאריות 4 מ"ל של תמיסת חומצה חנקתית ultrapure 1.0%.
  7. העברה 4 מיליליטר של תמיסה לצינור צנטריפוגות.
  8. חזור על 7.6 כדי 7.7 פעמים (בסך הכל שלוש פעמים). ההיקף הסופי הוא 12.0מ"ל.
  9. למדוד את ריכוז כסף של המדגם (מומס חומצה חנקתית ultrapure 1.0%) באמצעות ניתוח ICP-MS בהתאם למדריך ההפעלה 8.
    1. השתמש פנימי פתרון סטנדרטי חיצוני (ראה רשימת חומרים) לכמת את ריכוז הכסף. הפתרון תקן פנימי וחיצוני הוא מוכר על ידי האגודה האמריקאית הלאומית להסמכת מעבדות (A2LA). גבולות איתור של כסף היו מ"ל 0.0018 ng / -1 (פתרון) ו 0.016 ng מ"ג משקל -1 (גוף העובר).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

השפעת המליחות על רעילות SNC היה מאוד ברור: אינדוקציה של מום או מוות היה מליחות תלויים (איורים 1 ו -2). מדדנו סמנים פנוטיפי (קצב לב, גודל עין, אורך גוף מלא, וקצב בקיעה) ב SNC (10 מ"ג / ל -1) עובר -exposed. הסמנים פנוטיפי הללו גילו רעילות SNC תל?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Medaka הוא דג מים מתוקים, שהינו סובלני מי ים; זה לא ידוע היטב כי הגידול הטבעי המקורי של הדג הזה היה מים מלוחים מול חופי היפני 6. לפיכך, דגי medaka יש מפותח תאי כלוריד 7. מאפיין ייחודי זה מספק למדענים דרך חדשה לבדוק את רעילות של כימיקלים בסביבה כפונקציה של מליחות (מים...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

We are grateful to Ms. Kaori Shimizu and Mr. Masaki Takasu of the Graduate School of Life Sciences, Toyo University, for their technical support. This project was supported by research grants from the Special Research Foundation and Bio-Nano Electronics Research Centre of Toyo University (to SK); by the Science Research Promotion Fund of the Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan (to SK); by the New Project Fund for Risk Assessments, from the Ministry of Economy, Trade and Industry (to SK); by a Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (award 23651028 to SK); by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and (C) (award 23310026 and 26340030 to SK); and by a Grant-in-Aid for Strategic Research Base Project for Private Universities (award S1411016 to SK) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Silver nanocolloidsUtopia Silver Supplements
NaClNacalai Tesque, Inc.31319-45For making ERM
KClNacalai Tesque, Inc.28513-85For making ERM
CaCl2·2H2ONacalai Tesque, Inc.06730-15For making ERM
MgSO4·7H2ONacalai Tesque, Inc.21002-85For making ERM
NaHCO3 Nacalai Tesque, Inc.31212-25For making ERM
AgNO3Nacalai Tesque, Inc.31018-72
pH meterHORIBA, Ltd.F-51S
BalanceMettler-Toledo International Inc.MS204S
medaka (Oryzias latipes) orange-red strainNational Institute for Environmental Studies
medaka flow-through culturing systemMeito Suien Co.MEITOsystem
Artemia salina nauplii eggsJapan pet design Co. Ltd4975677033759
aeration pumpJapan pet design Co. Ltdnon-noise w300
Otohime larval β-1Marubeni Nissin Feed Co. LtdOtohime larval β-1Artificial dry fish diet
dissecting microscopeLeica microsystemsM165FC
micrometerFujikogaku, Ltd.10450023
incubatorNksystemTG-180-5LB
shakerELMI Ltd.Aizkraukles 21-136
6-well plastic platesGreiner CELLSTARM8562-100EA
aluminum foilAS ONE Co.6-713-02
stopwatchDRETEC Co. Ltd.SW-111YE
3 kDa membrane filterEMD Millipore Corporation0.5 ml centrifugal-type filter
50 ml Teflon beakerAS ONE Co.33431097
Custom claritas standardSPEXertificateZSTC-538For internal standard
Custom claritas standardSPEXertificateZSTC-622For external standard
ultrapure nitric acidKanto Chemical Co.28163-5B
hydrogen peroxide Kanto Chemical Co.18084-1Bfor atomic absorption spectrometry
ICP-MSThermo ScientificThermo Scientific X Series 2 
hot plateTiger Co.CRC-A300

References

  1. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , OECD. Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761 (2015).
  2. National Coastal Condition Report. , Environmental Protection Agency, Office of Water and Office of Research and Development. Washington, DC. (2001).
  3. Sakaizumi, M. Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes. J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).
  4. Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites. J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).
  5. Kashiwada, S. Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes). EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).
  6. Iwamatsu, T. The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , University Education Press. Japan. (2006).
  7. Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes. Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).
  8. XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , Thermo Fisher Scientific Inc.. Available from: http://202.127.146.37/eWebEditor/uploadfile/20130314161434190.pdf (2007).
  9. Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions. ES & T. 46 (11), 6278-6287 (2012).
  10. Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).
  11. Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos. Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).
  12. Shannon, R. D. Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides. Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).
  13. Pore size chart. , Spectrum Laboratories, Inc.. Available from: http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html (2015).
  14. Wakamatsu, Y. Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , National BioResource Project (NBRP) Medaka. Available from: [cited 2015] https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

109Medakananotoxicologynanocolloids

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved