메다카 계란을 사용하여 실버 Nanocolloids의 염도에 의존하는 독성 분석

요약

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

초록

염분은 수생 환경의 중요한 특성이다. 수생 생물의 경우는 담수, 기수 및 해수의 서식지를 정의합니다. 화학 물질 및 수생 생물에 그들의 생태 학적 위험 평가의 독성 시험은 자주 담수에서 수행되지만, 수생 생물에 화학 물질의 독성의 pH, 온도, 염도에 따라 달라집니다. 있는 방법은 수생 생물에 독성의 염분 의존성을 테스트하기 위해, 그러나,이 없습니다. 그들은 담수, 기수 및 해수에 적응 할 수 있기 때문에 여기서 우리는 송사리 (오리 지 아스 쿠르 latipes)을 사용했다. 배아 양육 매체 (ERM) (1 배, 5 배, 10 배, 15 배, 20 배 및 30 배)의 계란 (1 배의 ERM과 30 배 ERM을 송사리하는 실버 nanocolloidal 입자 (SNCs)의 독성을 테스트하기 위해 사용 된이 삼투 압력 상당의 다른 농도 각각 담수와 해수에). 여섯 아니라 플라스틱 판에, 세중 15 송사리 계란 10 밀리그램 / L ^&에 SNCs에 노출# 8722; 1 어둠 속에서 pH가 7, 25 ° C에서 ERM의 서로 다른 농도이다.

우리는 하루 6 일 (섹션 4) 부화의 유충의 몸 전체 길이에 15 초와 눈 직경에 따라 심장 박동을 측정하기 위해 해부 현미경 마이크로 미터를 사용했다. 배아 또는 부화는 14 일째까지 관찰되었다; 우리는 그 다음 십사일 (4 절)에 대해 매일 부화 속도를 계산. 배아에 실버 축적을 확인하려면, 우리는 유도 실버 테스트 솔루션의 농도 (섹션 5) dechorionated 배아 (6 절) 분명히 염분 증가와 함께 증가 메다카 배아에 SNCs의 국지적 인 독성을 측정하는 플라즈마 질량 분석을 결합 사용합니다. 이 새로운 방법은 우리가 다른 염분도에서 화학 물질의 독성을 테스트 할 수 있습니다.

서문

1979 년 시험 화학 물질에 대한 경제 협력 개발기구 (OECD) 테스트 가이드 라인을위한기구의 설립 이후, 38 테스트 가이드 라인은 가이드 라인, 바이오 틱 시스템 ^1에 미치는 영향의 제 2 항에 발표되었다. 담수 서식지, 즉 담수 공장에서왔다 테스트 수생 생물의 모든; 조류; 이러한 물벼룩 류와 chironomids 같은 무척추 동물; 이러한 송사리, 제브라 피쉬, 무지개 송어 등 물고기. 바닷물 환경에 비해 담수 환경은 더 직접적으로 인간의 경제 및 산업 활동에 의해 영향을받습니다. 그들은 오염 위험이 높은 있기 때문에 따라서, 담수 환경은 테스트를 위해 우선 순위가되었습니다.

하구를 포함한 해안 지역에서, 염분도는 소금기있는 물과 해수 조건 사이에서 변화하고,이 지역은 종종 산업 활동 ^(2)에 의해 오염된다. 해안 지역 및 관련 습지는 시간을 특징으로한다고등학교의 생태 학적 생물 다양성과 생산성. 해안 생태계 따라서 화학 오염으로부터 보호해야합니다. 그러나, 기수 및 해수 서식지의 생태 독성 학적 연구가 제한되어있다.

Sakaizumi ^{3 일본} 메다카 계란 메틸 수은 염분의 독성 작용을 연구 및 시험 용액의 삼투압을 높이면 메틸 수은의 독성 향상된 것으로 나타났다. . Sumitani 등 ⁴ 매립지 침출수의 독성을 조사하기 위해 송사리 계란을 사용; 그들은 계란에 침출수의 삼투압 동등성이 배 발생 과정의 이상을 유도하는 열쇠 것을 발견했다. 또한, Kashiwada ^{5 플라스틱} 나노 입자 (직경 39.4 nm의) 쉽게 기수 조건에서 송사리 계란 융모막 (15 배 배아 양육 매체 (ERM))를 통해 투과 보도했다.

전형적인 작은 물고기 모델, 일본 송사리 (오리 지 아스 쿠르 latipes ) 및 기초 생물학 독물학 ^(6)에 사용되어왔다. 일본어 송사리는 해수 담수에서 그들의 고도로 발달 된 염화 세포 ^(7)에 이르기까지 환경에서 살 수 있습니다. 그들은 염분도의 광범위한 조건에서 테스트에 유용하기 때문에 가능성이 높습니다.

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프로토콜

본 연구에 사용 된 일본 송사리는 고통과 불편의 완화에 대한 상황을 고려하여, 인도적 토요 대학의 제도적 지침에 따라 처리 하였다.

1. 실버 Nanocolloids (SNCs)

1. 정제 SNCs 구매 (20 ㎎ / ℓ ^-1, 99.99 % 순도, 입자 증류수에 현탁 28.4 ± 8.5 nm의에 대한 평균 직경).
2. 유도 결합 플라즈마 질량 분석에 의해 은의 순도와 농도의 유효성을 검사 (ICP-MS) 취급 설명서 ^(8)에 따라 분석한다. ICP-MS의 전처리 방법은, (7)에서 설명하는 분석한다.

SNC 솔루션 다른 염분도와 (실버 콜로이드와의 Ag ^+의 혼합물) 2. 준비

1. 60 g의 NaCl, 1.8 g의 KCl, 2.4 g의 염화칼슘 ₂ · 2H ₂ O, 및 9.78 g 황산 ₄ · 7H ₂ O ULT의 L 1로 구성된 60 ×의 ERM 준비rapure 물; _{초순수에서의 NaHCO3} 1.25 %와 7.0 pH를 조정합니다.
2. 하룻밤 25 ° C에서 ERM 솔루션을 저어.
3. 희석 ERM과 SNCs을 섞는다. 각 SNC-ERM 혼합 용액을 40 ml의를 준비합니다. 최종 농도는 ERM의 서로 다른 농도의 SNCs 10 ㎎ / L ^-1 (1 배, 5 배, 10 배, 15 배, 20 배, 또는 30 배).
4. 초순수에서 0.625 %와 7.0에 SNC-ERM 혼합 _용액의 NaHCO3의 pH를 조정합니다. 의 Ag ^{+ 방출은} 산성 조건 ^(9)에 의해 촉진되기 때문에 pH 조정은 SNC 용액을 제조하는데 매우 중요하다.
5. SNCs에 대한 참조 화합물로서 AGNO _{3을 사용합니다.}
   1. 희석 ERM과 AGNO ₃ 섞는다. 15.7 ㎎ / ℓ의 AGNO ₃ 농도 AGNO ₃ -ERM 혼합 용액을 40 ml의 준비 ^-1 ERM의 서로 다른 농도 (10 ㎎ / ℓ ^-1 실버) (1 배, 5 배, 10 배, 15 배, 20 배, 또는 30 배) .
      참고 : AGNO ₃ 실버 콜로이드 독성을 검사하려면수용성 실버의 소스 솔루션은, 실버 콜로이드 및 수용성 실버의 혼합물이다 SNCs에 대한 기준 화합물로 사용됩니다.

3. 메다카 문화와 계란 수확

1. 메다카 (O.의 latipes) (오렌지 - 붉은 주) (60 명의 남성과 60 명의 여성)을 얻었다.
2. 그룹으로 배양 메다카 (남성 및 20 일 그룹으로 20 명의 여성)를 메다카 관류 배양 시스템을 사용하여 3 L의 탱크 1 배 ERM있다.
   1. 다음과 같은 조건에서 문화 :
      배지의 pH 범위 6.2 6.5까지
      빛 : 어두운주기 : 16 : 8 시간
      문화 매체의 온도 : 24 ± 0.5 ° C
      배양 배지의 삼투압 : 257 mOsm
3. (하루에 다섯 번 () 하루에 한 번) 10시 아테 살리나 노 플리 우스에 송사리를 공급 09:00 11:00 13:00 15:00, 17:00에서 인공 건조 물고기 다이어트를 피드.
   1. A.를 얻 살리나 노 플리 우스.
   <리> 플라스틱 비커에 3.0 % 염 용액의 5 L를 준비합니다.
   2. 비커에서 소금 용액에 소금물 새우 달걀 30g을 추가합니다.
   3. 폭기 펌프를 사용하여 (4 L / 분 ^-1)를 버블 링 48 시간 동안 25 ° C에서 알을 부화.
   4. 48 시간 후, 버블 링을 중지합니다.
   5. 5 ~ 10 분은 부화 A를 분리하는 솔루션이 방치 해칭 달걀과 달걀 껍질에서 살리나 노 플리 우스 (용액의 아래 부분) (용액의 상부).
   6. 데칸 테이션에 의한 용액의 상층을 제거한다.
   7. 283 μm의의 구멍을 가진 체를 통해 솔루션의 하부 필터, 198 μm의의 구멍과 그물에 통과 노 플리 우스를 수집합니다.
   8. 6 시간 이내에 송사리에 노 플리 우스를 공급.
4. 암형 메다카가 산란 한 후 암컷 '본체로부터 부드럽게 외부 달걀 클러스터를 제거 또는 SM을 사용하여 수조의 바닥에서 계란을 수집모든 네트 (그물 크기 5cm × 5 cm의 구멍 크기 0.2 mm X 0.2 mm).
5. 5 초 동안 수돗물 흐르는 계란 클러스터를 씻어.
6. 30 배 ERM 솔루션에 세척 계란 모든 클러스터를 추가합니다.
7. 1 분 후 솔루션에서 클러스터를 제거하고 부드럽게 마른 종이 타올과 롤 사이의 계란 클러스터를 배치합니다.
8. 30 배 ERM에 다시 계란을 넣습니다.
9. 해부 현미경 수정란을 선택합니다.
10. 집게를 사용하여 여섯 잘 플라스틱 접시에 1 배의 ERM에 810 알을 선택한 놓습니다.
11. (21) 발달 단계까지 인큐베이터에서 25 ± 0.1 ° C에서 알을 품어 (메다카 배아의 발달 단계가 Iwamatsu ^(10)의 작업에서 정의되었다.)
12. 해부 현미경 발달 단계 (21)에서 배양 계란을 선택합니다.
13. 1 배의 ERM로 선택한 계란을 씻어.
14. 노출 실험 (4 절)로 세척 계란을 가하지.

4. 독성 SNCs의 시험 또는 AGNO ₃ 다른 ERM의 염분도에서

1. 송사리 계란을 씻어 (단계 21) 테스트 솔루션 [SNCs (10 ㎎ / ℓ ^-1) 또는 AGNO ₃ 3 회 ERM의 각 농도 (1 배, 5 배에서 (15.7 ㎎ / ℓ ^-1 10 ㎎ / ℓ ^-1 실버 등) , 10 배, pH가 7에서 15 배, 20 배, 또는 30 배)]. 컨트롤로, pH가 7에서 30 ×의 ERM 1 × 계란을 사용합니다.
2. 여섯 웰 플라스틱 플레이트에서 각 시험 용액 5 ml의 15 세척 계란을 추가합니다. (SNC의 노출 실험을 세 번 수행하거나 AGNO ₃ 독성 각 시험 용액을 사용하여 시험).
3. 알루미늄 호일 접시를 감싸.
4. 부화 할 때까지 14 일 동안 어둠 속에서 25 ° C에서 랩 번호판을 품어.
5. 생물학적 변화와 죽은 달걀 노출 된 계란마다 24 시간을 관찰한다 (그림 1, 2).
6. 테스트 솔루션마다 24 시간을 교환한다.
7. 다음과 같은 관측을 수행합니다.
   1. 노출의 날 6 일, 오 (15 초당) 심박수를 계산스톱워치 (도 3a)를 사용하여 해부 현미경 F 메다카 배아.
   2. 노광 6 일째, 마이크로 미터 (도 3b)를 사용하여 해부 현미경 메다카 배아의 눈의 크기 (직경)를 측정한다.
   3. 해칭 날, 마이크로 미터 (도 3C)를 사용하여 해부 현미경 유충의 몸 전체의 길이를 측정한다.
   4. 십사일 (도 3d) 위에 부화 노출 알의 총 수를 계산.

SNC 솔루션의 가용성 실버, 실버 분석 5. 분리

1. 14,000 ×에서 3 kDa의 멤브레인 필터로 여과하여 각각 SNC 수용액 (콜로이드 실버와 실버 수용성의 혼합물)으로부터 가용성은 격리 g 및 10 분 동안 4 ° C. 1 배 ERM의 응집 SNCs의보고 된 평균 직경이 67.8 내지 ^11이므로 SNCs에서 수용성은을 분리하는 3 kDa의 멤브레인 필터를 사용하여차의 Ag ^+의는 0.162 내지 ^12; 3 kDa의 막은 2 내지 ¹³ 이상의 직경의 입자를 제외한다.
2. ICP-MS 운영 매뉴얼 ^{8 항에} ICP-MS 분석 (그림 3E)에 의해 여과 된 용액 (= 가용성은 농도)의 50 μL의 실버 농도를 측정한다. ICP-MS의 전처리 방법은, (7)에서 설명하는 분석한다.

메다카 배아에서 실버 생물 농축 6. 측정

1. 4 절에 설명 된대로 메다카 SNCs에 계란 (단계 21) 또는 AGNO ₃ 노출.
2. 노출의 날 (6)에서 메다카 도서 ^(14)에 기술 된 프로토콜에 따라 효소를 부화 송사리를 사용하여 계란 (즉, dechorion)에서 융모막를 제거합니다.
3. ICP-MS 운영 매뉴얼 ⁸ (그림 3 층)에 따라 ICP-MS 분석에 의해 dechorioned 계란의 실버 농도를 측정한다. 전처리ICP-MS에 대한 방법은 7 장에서 설명하는 분석.

ICP-MS 분석에 의해 실버 농도 7. 측정

1. (; 섹션 1은 농도의 검증을위한) 샘플 [실버 용액 50 μl를 추가; 세 dechorionated 배아 (섹션 5); 또는 50 ㎖ 테플론 비커에 여과 된 용액 (섹션 5)]의 50 μL.
2. 50 ML의 비커에 초순수 질산 2.0 ML을 추가합니다.
3. 그것은 (약 3 시간)을 밖으로 건조 직전까지 110 ° C에서 핫 플레이트의 혼합물을 가열한다.
4. 완전 유기물을 용해 초순수 2.0 질산 ㎖의 비이커에 과산화수소 0.5ml를 추가한다.
5. 그것은 (약 3 시간)을 밖으로 건조 직전까지 핫 플레이트에 다시 혼합물을 가열한다.
6. 초순수 1.0 % 질산 수용액 4 ㎖에 잔류 녹인다.
7. 전송 원심 튜브 용액 4 mL를.
8. (3 회 총)을 두 번 7.7-7.6를 반복합니다. 최종 부피는 12.0이고ml의.
9. 취급 설명서 ^{8 항에} ICP-MS 분석을 이용하여 (1.0 %의 고순도 질산에 용해) 시료의 실버 농도를 측정한다.
   1. 내부와 외부 표준 용액을 사용하여 실버 농도를 정량화 (자료 목록을 참조하십시오). 내부 및 외부 표준 용액은 실험실 인증을위한 미국 협회 (A2LA)의 인증을 받았으며. 실버의 검출 한계는 0.0018 ng를 / ㎖ ^-1 (솔루션)와 0.016 NG mg의 무게 ^-1 (배아 체)이었다.

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결과

SNC 독성에 염분의 효과는 매우 분명했다 : 기형 또는 사망의 유도가 염분 따라 (그림 1, 2)이었다. 우리는 (10 ㎎ / ℓ ^-1) -exposed 배아 SNC에서 표현형 바이오 마커 (심장 박동, 눈의 크기, 몸 전체 길이, 부화 속도)를 측정 하였다. 이러한 표현형 바이오 마커는 염분에 의존 SNC 독성을 밝혔다.

심장 ?...

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토론

송사리는 해수에 매우 관대있는 민물 고기이다 잘 물고기의 원래의 자연 서식지는 일본 해안 ⁶ 떨어져 바닷물 것을 알 수 없습니다. 따라서, 송사리는 염화 세포 ⁽⁷⁾ 잘 개발했습니다. 이 독특한 특성은 물고기의 단일 종을 사용하여 (담수 해수) 염분의 함수로서 환경에서 화학 물질의 독성을 시험하는 새로운 방법을 제공 과학자.

단계 21에서 송사리 계란을 얻...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver nanocolloids	Utopia Silver Supplements
NaCl	Nacalai Tesque, Inc.	31319-45	For making ERM
KCl	Nacalai Tesque, Inc.	28513-85	For making ERM
CaCl2·2H2O	Nacalai Tesque, Inc.	06730-15	For making ERM
MgSO4·7H2O	Nacalai Tesque, Inc.	21002-85	For making ERM
NaHCO3	Nacalai Tesque, Inc.	31212-25	For making ERM
AgNO3	Nacalai Tesque, Inc.	31018-72
pH meter	HORIBA, Ltd.	F-51S
Balance	Mettler-Toledo International Inc.	MS204S
medaka (Oryzias latipes) orange-red strain	National Institute for Environmental Studies
medaka flow-through culturing system	Meito Suien Co.	MEITOsystem
Artemia salina nauplii eggs	Japan pet design Co. Ltd	4975677033759
aeration pump	Japan pet design Co. Ltd	non-noise w300
Otohime larval β-1	Marubeni Nissin Feed Co. Ltd	Otohime larval β-1	Artificial dry fish diet
dissecting microscope	Leica microsystems	M165FC
micrometer	Fujikogaku, Ltd.	10450023
incubator	Nksystem	TG-180-5LB
shaker	ELMI Ltd.	Aizkraukles 21-136
6-well plastic plates	Greiner CELLSTAR	M8562-100EA
aluminum foil	AS ONE Co.	6-713-02
stopwatch	DRETEC Co. Ltd.	SW-111YE
3 kDa membrane filter	EMD Millipore Corporation	0.5 ml centrifugal-type filter
50 ml Teflon beaker	AS ONE Co.	33431097
Custom claritas standard	SPEXertificate	ZSTC-538	For internal standard
Custom claritas standard	SPEXertificate	ZSTC-622	For external standard
ultrapure nitric acid	Kanto Chemical Co.	28163-5B
hydrogen peroxide	Kanto Chemical Co.	18084-1B	for atomic absorption spectrometry
ICP-MS	Thermo Scientific	Thermo Scientific X Series 2
hot plate	Tiger Co.	CRC-A300