JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Özet

Tuzluluk su ortamında önemli bir özelliğidir. Sudaki organizmalar için tatlı su, tuzlu su ve deniz suyunun yaşam alanları tanımlar. kimyasallar ve Sucul organizmalar için ekolojik riskler değerlendirmelerinin toksisite testleri sıklıkla tatlı yapılmaktadır, ancak Sucul organizmalar için kimyasalların toksisite pH, sıcaklık, tuzluluk ve bağlıdır. Hiçbir yöntem Sudaki organizmalar için toksisite tuzluluk bağımlılığını test etmek için, ancak var. Onlar tatlı su, tuzlu su ve deniz suyuna adapte çünkü Burada, Medaka (Oryzias latipes) kullanılır. embriyo yetiştirme ortamı (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, 30x ve) yumurta (1x ERM ve 30x ERM Medaka gümüş nanocolloidal parçacıklar (SNCS) toksisitesini test etmek için kullanılmıştır sahip ozmotik basıncı eşdeğer farklı konsantrasyonlarda sırasıyla tatlı ve deniz suyu, için). Altı oyuklu plastik tabak olarak, üç kopya halinde 15 Medaka yumurta 10 mg / L ve en SNCS maruz bırakıldı# 8722, 1, karanlıkta, pH 7 ve 25 ° C 'de ERM'in farklı konsantrasyonlarda.

Gün 6 ve gündüz (bölüm 4) kuluçkalık üzerine larva tam vücut uzunluğu 15 sn ve göz çapı başına kalp hızını ölçmek için bir diseksiyon mikroskobu ve bir mikrometre kullanılır. embriyolar kuluçka veya gün 14 kadar gözlenmiştir; Daha sonra 14 gün (bölüm 4) her gün çıkma oranı sayıldı. embriyolarda gümüş birikimi görmek için tümevarımsal gümüş testi çözümleri konsantrasyonu (Bölüm 5) ve dechorionated embriyolar (bölüm 6) açıkça tuzluluk arttıkça artan Medaka embriyolar SNCS KAG toksisitesini ölçmek için plazma kütle spektrometresi birleştiğinde kullandık. Bu yeni yöntem bizi farklı tuzluluk kimyasalların toksisite test etmenizi sağlar.

Giriş

1979 yılında test kimyasallar için Ekonomik İşbirliği ve Kalkınma Örgütü (OECD) test kriterlerine Teşkilatı'nın kuruluşundan bu yana, 38 deney kılavuzları kurallar, Biyotik Sistemleri 1 üzerine etkileri Bölüm 2'de yayınlanmıştır. tatlı su habitatlarının, yani tatlı su bitkilerden olmuştur test Sudaki organizmalar Tüm; yosun; Böyle piresi ve chironomids olarak omurgasızlar; Bu tür Medaka, Zebra balığı ve gökkuşağı alabalığı gibi balıklar. tuzlu su ortamlarına kıyasla, tatlı su ortamları daha doğrudan insan ekonomik ve endüstriyel faaliyetler etkilenir. Onlar kirlilikten daha yüksek risk altındadır, çünkü bu nedenle, tatlı su ortamları test için ön plana çıkmışlardır.

Haliç dahil kıyı bölgelerde, tuzluluk acı su ve deniz suyu koşulları arasında değişir ve bu alanlar genellikle endüstriyel aktivite 2 tarafından kirletilmektedir. Kıyı alanları ve bunların ilişkili sulak h ile karakterizedirüksek ekolojik biyolojik çeşitlilik ve verimlilik. Kıyı ekosistemleri nedenle kimyasal kirlenmeye karşı korunmalıdır. Ancak, acı su ve deniz suyu ortamlarında ekotoksikolojik araştırma var sınırlı kalmıştır.

Sakaizumi 3 Japon Medaka yumurta metil civa ve tuzluluk arasındaki toksik etkileşimler okudu ve test çözeltisi ozmotik basıncı artırarak metil civa toksisitesini arttırdı bulundu. . Sumitani ark 4 sızıntı suyu toksisitesini araştırmak için Medaka yumurta kullanıldı; Onlar yumurtalara sızıntı suyunun osmotik denklik embriyogenez sırasında anormallikleri uyaran anahtarı olduğunu ortaya koymuştur. Buna ek olarak, Kashiwada 5 plastik nanopartiküller (çapı 39,4 nm) kolay tuzlu koşullar altında Medaka yumurta koryon (15x embriyo yetiştirme ortamı (ERM)) üzerinden nüfuz bildirmiştir.

Tipik bir küçük balık modeli, Japon Medaka (Oryzias latipes ) Temel biyoloji ve ekotoksikolojisine 6 kullanılmaktadır. Japon Medaka deniz suyuna tatlı gelen dolayı son derece gelişmiş klorür hücrelerinin 7 arasında değişen koşullarda yaşayabilir. Bunlar tuzluluk geniş bir yelpazede olan koşullarda test etmek için yararlı olduğu umulmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan Japon Medaka sıkıntı ve rahatsızlık hafifletilmesi için göz önünde bulundurularak, insani Toyo Üniversitesi kurumsal kurallarına uygun olarak tedavi edildi.

1. Gümüş Nanocolloids (SNCS)

  1. Saflaştırılmış SNCS satın (20 mg / L-1,% 99.99 saflıkta, partikül damıtılmış su içinde süspansiyon haline getirilmiş 28.4 ± 8.5 nm ila ortalama çap).
  2. Indüktif eşleşmiş plazma kütle spektrometresi ile gümüş saflık ve konsantrasyon doğrulamak (ICP-MS) kullanma kılavuzuna 8'e göre analiz eder. ICP-MS için tedavi öncesi yöntemi Bölüm 7'de açıklanan analizler.

SNC Çözümleri Farklı tuzluluk ile (Gümüş Colloids ve Ag + Karışımlarının) 2. Hazırlık

  1. 60 g NaCl, 1.8 g KCI, 2.4 g CaCI2 · 2H 2 O ve 9.78 gr MgSO 4 · 7H 2 O Arıza sebebinin L 1 aşağıdakilerden oluşan 60 x ERM'yi hazırlanmasırapure su; ultra saf su içinde NaHCO 3% 1.25 ile 7.0 arasında pH değeri ayarlanır.
  2. gece boyunca 25 ° C'de bir ERM çözeltisi karıştırılır.
  3. seyreltilmiş ERM ile SNCS karıştırın. Her SNC-ERM karışık çözelti, 40 ml hazırlayın. Nihai konsantrasyon ERM farklı konsantrasyonlarda SNCS 10 mg / L -1 (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, 30x veya).
  4. Ultra saf su içinde% 0.625 ile 7.0 arasında SNC-ERM karışık çözelti NaHCO 3 pH ayarlayın. Ag + salma asidik koşullar 9 kolaylaştırılır, çünkü pH ayarlaması SNC çözeltisinin hazırlanması için çok önemlidir.
  5. SNCS için bir referans bileşiği olarak iyodinin 3 kullanın.
    1. Sulandırılmış ERM ile Agno 3 karıştırın. 15.7 mg / L arasında bir iyodinin 3 konsantrasyonda iyodinin 3 -ERM karışık çözelti, 40 ml hazırlamak -1 ERM'in farklı konsantrasyonlarda (10 mg / L-1 gümüş) (1 x, 5x, 10x, 15x, 20x veya 30x) .
      Not: AgNO 3 gümüş kolloid toksisitesini incelemek içinçözünür bir gümüş kaynağı solüsyonu, gümüş koloitler ve çözünür gümüş karışımı SNCS için bir referans bileşik olarak kullanılır.

3. Medaka Kültür ve Yumurta Hasat

  1. Medaka (O. latipes) (turuncu-kırmızı suşu) (60 erkek ve 60 kadın) edinin.
  2. gruplar olarak kültür Medaka (20 erkek ve bir grup olarak 20 kadın) bir Medaka akış kültür sistemi kullanılarak 3 L tanklarda 1x ERM.
    1. Aşağıdaki koşullarda Kültür:
      kültür ortamının pH aralığı 6.2 ila 6.5
      Işık: karanlık döngüsü: 16: 8 saat
      Kültür ortamının sıcaklığı: 24 ± 0.5 ° C
      kültür ortamının ozmotik basınç: 257 mOsm
  3. (Günde beş kez) (günde bir kez) saat 10:00 'Artemia salina nauplii üzerinde Medaka Yem ve 09:00, 11:00, 13:00, 15:00 ve 17:00 yapay kuru balık diyet yem.
    1. A. elde salina nauplii.
    2. plastik kabı içinde bir% 3.0 tuz solüsyonu 5 L hazırlayın.
    3. beher tuz çözeltisine tuzlu su karidesi yumurta 30 g ekleyin.
    4. Bir havalandırma pompası kullanılarak (4 L / dk-1) geçirilerek, 48 saat boyunca 25 ° C'de kuluçkaya.
    5. 48 saat sonra, köpüren durdurun.
    6. 5 ila 10 dk yumurtadan A. ayırmak için çözüm bekletin çıkmamış yumurta ve yumurta kabuğu arasından salina nauplii (çözelti alt kısmı) (çözelti üst kısmı).
    7. durultma yoluyla çözeltinin üst tabakayı çıkarın.
    8. 283 um gözenekli bir elekten çözelti alt kısmının filtre ve 198 um arasında açıklıkları olan bir net geçmesine nauplii toplar.
    9. 6 saat içerisinde Medaka için nauplii besleyin.
  4. kadın Medaka olurken sonra, dişilerin organları hafifçe dış yumurta kümeleri kaldırmak veya sm kullanarak akvaryum dibinden yumurta toplamakTüm ağ (net büyüklüğü 5 cm x 5 cm, delik boyutu 0.2 mm x 0.2 mm).
  5. 5 saniye boyunca musluk suyu akan yumurta küme durulayın.
  6. 30x ERM çözüm durulanır yumurta kümelerinin tüm ekleyin.
  7. 1 dakika sonra çözeltiden kümeleri kaldırın ve yavaşça kuru kağıt havlu ve silindir arasındaki yumurta kümeleri yerleştirin.
  8. 30x ERM geri yumurta koymak.
  9. bir mikroskop altında döllenmiş yumurta seçin.
  10. forseps kullanarak altı-iyi plastik plakalar 1x ERM 810 yumurta, seçilen yerin.
  11. 21. gelişim aşamasına kadar bir kuluçka 25 ± 0.1 ° C'de kuluçkaya (Medaka embriyoların gelişim aşamaları Iwamatsu 10 çalışmalarından tanımlanmıştır.)
  12. bir mikroskop altında gelişme aşamasında 21 inkübe yumurta dışarı seçin.
  13. 1x ERM ile seçilen yumurta durulayın.
  14. Pozlama deneyleri (bölüm 4) ile durulanır yumurta Konu.

4. Toksisite SNCS test veya AgNO 3 Farklı ERM tuzluluk de

  1. Medaka yumurta yıkayın (aşama 21), test çözeltisi [SNCS (10 mg / L-1) ya da iyodinin 3 ile üç kez ERM'in her bir konsantrasyonu (1 x, 5x (15.7 mg / L-1, 10 mg / L-1, gümüş gibi) , 10x, pH 7'de 15x, 20x, 30x veya)]. Kontroller olarak, pH 7, 30 x ERM'e 1 x yumurta kullanımı.
  2. Altı oyuklu plastik plakalar her bir test çözeltisi, 5 ml 15 durulandı yumurta ekleyin. (SNC için poz deneyler üç kez yapın veya AgNO 3 toksisite her test solüsyonu kullanarak test.)
  3. alüminyum folyo tabak sarın.
  4. Enkübasyon kadar ya da 14 gün boyunca karanlıkta 25 ° C 'de sarılmış inkübe edin.
  5. Biyolojik değişiklikler ve ölü yumurta maruz yumurta her 24 saat gözlemlemek (Şekil 1 ve 2).
  6. Test çözümleri her 24 saat değişimi.
  7. aşağıdaki gibi gözlemleri gerçekleştirin.
    1. maruz kalma 6. günde, o (15 saniyede) kalp hızını saymakbir kronometre (Şekil 3a) ile bir mikroskop altında F Medaka embriyolar.
    2. Maruziyet 6. günde, bir mikrometre (Şekil 3b) kullanılarak bir mikroskop altında Medaka embriyoların göz boyutu (çap) ölçün.
    3. Kuluçka gününde, bir mikrometre (Şekil 3c) kullanarak bir mikroskop altında larva tam vücut uzunluklarının.
    4. 14 gün (Şekil 3d) üzerinde yumurtadan maruz yumurta sayısını saymak.

SNC Çözüm Çözünür Gümüş ve Gümüş Analizi 5. İzolasyon

  1. 14,000 x bir 3 kDa'lık bir zar filtre ile filtre her SNC çözeltisi (gümüş kolloidler ve çözünür gümüş bir karışımı) çözünür gümüş izole g ve 10 dakika süre ile 4 ° C. 1x ERM'in agrege SNCS bildirilen ortalama çapı 67.8 mil 11, çünkü SNCS çözünür gümüş izole etmek için 3 kDa'lık bir zar filtresi kullanınnd Ag + o 0.162 nm 12'dir; 3 kDa'lık bir membran 2 nm 13 ya da daha fazla bir çapa sahip olan parçacıklar hariç tutar.
  2. ICP-MS yapan kılavuzu 8'e göre, ICP-MS analizi (Şekil 3E) tarafından filtre edilmiş çözelti (= çözünebilen gümüş konsantrasyonu), 50 ul gümüş konsantrasyonu ölçümü. ICP-MS için tedavi öncesi yöntemi Bölüm 7'de açıklanan analizler.

Medaka Embriyolar Gümüş Biyoakümülasyon 6. Ölçüm

  1. Bölüm 4'de anlatıldığı gibi Medaka SNCS yumurta (evre 21) ya da iyodinin 3 Açığa.
  2. Maruziyet 6. günde, Medaka Kitap 14'te tarif edilen protokole göre enzim kuluçka Medaka'nın kullanılarak yumurta (yani, dechorion) koryon çıkarın.
  3. ICP-MS işletim manuel 8 (Şekil 3f) 'ye göre ICP-MS analizi ile dechorioned yumurta gümüş konsantrasyonu ölçün. önICP-MS yöntemi, Bölüm 7'de açıklanan analizler.

ICP-MS Analizi ile Gümüş Konsantrasyon 7. ölçümü

  1. (; Bölüm 1 gümüş konsantrasyonu doğrulama için) örnekleri [gümüş çözeltisi 50 ul ekleyin; Üç dechorionated embriyolar (bölüm 5); ya da bir 50 mL teflon çanağa filtre edilmiş çözelti (bölüm 5)], 50 ul.
  2. 50 ml'lik bir cam kap, aşırı saf, nitrik asit 2.0 ml ilave edilir.
  3. (yaklaşık 3 saat) kurur hemen öncesine kadar 110 ° C'de sıcak bir plaka üzerinde karışımı ısıtın.
  4. Tamamen organik madde çözülür 2.0 ultra saf nitrik asit ilave edildi ve beher için hidrojen peroksit, 0.5 ml ekleyin.
  5. (yaklaşık 3 saat) kurur hemen öncesine kadar sıcak plaka üzerinde yine karışımı ısıtın.
  6. % 1.0, aşırı saf, nitrik asit çözeltisinin 4 ml artığı içinde çözündürülür.
  7. Transfer santrifüj tüpüne 4 ml.
  8. (Üç kez olmak üzere toplam) iki kez 7.7 7.6 tekrarlayın. Nihai hacim 12.0;mi.
  9. Kullanma kılavuzuna 8'e göre ICP-MS analizi ile (% 1.0 ultra saf nitrik asit içinde eritilmiş) numune gümüş konsantrasyonu ölçümü.
    1. Bir iç ve bir dış standart solüsyonu kullanın gümüş konsantrasyonu ölçmek için (Malzeme Listesi). iç ve dış standart bir çözüm Laboratuvar Akreditasyon Amerikan Derneği (A2LA) tarafından akredite edilmiştir. Gümüş tespit limitleri 0.0018 ng / ml -1 (çözüm) ve 0.016 ng mg ağırlık -1 (embriyo gövdesini) idi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

SNC toksisite tuzluluk etkisi çok açıktı: deformite veya ölüm indüksiyon tuzluluk bağımlı (Şekil 1 ve 2). Biz (10 mg / L -1) -exposed embriyolar SNC fenotipik biyobelirteçleri (kalp atım hızı, göz boyutu, tam vücut uzunluğu ve çıkma oranı) ölçüldü. Bu fenotipik biyomarkırlar tuzluluk bağımlı SNC toksisite ortaya koydu.

Kalp hızı 29.6 32.2 atım / kontr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Medaka deniz suyu son derece hoşgörülü bir tatlı su balığıdır; o da bu balığın orijinal doğal yaşam Japon sahil 6 kapalı tuzlu su olduğu bilinmemektedir. Bu nedenle, Medaka balık klorid hücreleri 7 iyi gelişmiştir. Bu benzersiz özellik balık sadece tek bir tür kullanarak (tatlı su deniz suyu için) tuzluluk bir fonksiyonu olarak çevre kimyasalların toksisite test etmek için yeni bir yol ile bilim adamları sağlar.

aşamada 21, Medaka yumurta ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors declare that they have no competing financial interests.

Teşekkürler

We are grateful to Ms. Kaori Shimizu and Mr. Masaki Takasu of the Graduate School of Life Sciences, Toyo University, for their technical support. This project was supported by research grants from the Special Research Foundation and Bio-Nano Electronics Research Centre of Toyo University (to SK); by the Science Research Promotion Fund of the Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan (to SK); by the New Project Fund for Risk Assessments, from the Ministry of Economy, Trade and Industry (to SK); by a Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (award 23651028 to SK); by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and (C) (award 23310026 and 26340030 to SK); and by a Grant-in-Aid for Strategic Research Base Project for Private Universities (award S1411016 to SK) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Silver nanocolloidsUtopia Silver Supplements
NaClNacalai Tesque, Inc.31319-45For making ERM
KClNacalai Tesque, Inc.28513-85For making ERM
CaCl2·2H2ONacalai Tesque, Inc.06730-15For making ERM
MgSO4·7H2ONacalai Tesque, Inc.21002-85For making ERM
NaHCO3 Nacalai Tesque, Inc.31212-25For making ERM
AgNO3Nacalai Tesque, Inc.31018-72
pH meterHORIBA, Ltd.F-51S
BalanceMettler-Toledo International Inc.MS204S
medaka (Oryzias latipes) orange-red strainNational Institute for Environmental Studies
medaka flow-through culturing systemMeito Suien Co.MEITOsystem
Artemia salina nauplii eggsJapan pet design Co. Ltd4975677033759
aeration pumpJapan pet design Co. Ltdnon-noise w300
Otohime larval β-1Marubeni Nissin Feed Co. LtdOtohime larval β-1Artificial dry fish diet
dissecting microscopeLeica microsystemsM165FC
micrometerFujikogaku, Ltd.10450023
incubatorNksystemTG-180-5LB
shakerELMI Ltd.Aizkraukles 21-136
6-well plastic platesGreiner CELLSTARM8562-100EA
aluminum foilAS ONE Co.6-713-02
stopwatchDRETEC Co. Ltd.SW-111YE
3 kDa membrane filterEMD Millipore Corporation0.5 ml centrifugal-type filter
50 ml Teflon beakerAS ONE Co.33431097
Custom claritas standardSPEXertificateZSTC-538For internal standard
Custom claritas standardSPEXertificateZSTC-622For external standard
ultrapure nitric acidKanto Chemical Co.28163-5B
hydrogen peroxide Kanto Chemical Co.18084-1Bfor atomic absorption spectrometry
ICP-MSThermo ScientificThermo Scientific X Series 2 
hot plateTiger Co.CRC-A300

Referanslar

  1. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , OECD. Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761 (2015).
  2. National Coastal Condition Report. , Environmental Protection Agency, Office of Water and Office of Research and Development. Washington, DC. (2001).
  3. Sakaizumi, M. Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes. J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).
  4. Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites. J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).
  5. Kashiwada, S. Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes). EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).
  6. Iwamatsu, T. The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , University Education Press. Japan. (2006).
  7. Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes. Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).
  8. XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , Thermo Fisher Scientific Inc.. Available from: http://202.127.146.37/eWebEditor/uploadfile/20130314161434190.pdf (2007).
  9. Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions. ES & T. 46 (11), 6278-6287 (2012).
  10. Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).
  11. Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos. Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).
  12. Shannon, R. D. Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides. Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).
  13. Pore size chart. , Spectrum Laboratories, Inc.. Available from: http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html (2015).
  14. Wakamatsu, Y. Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , National BioResource Project (NBRP) Medaka. Available from: [cited 2015] https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 109su toksikolojiMedakananoNanotoksikolojituzlulukdeniz suyug m nanocolloids

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır