Salinität abhängigen Toxizität Assay von Silbernanokolloide Verwendung von Medaka-Eier

Zusammenfassung

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Zusammenfassung

Salinität ist ein wichtiges Merkmal der Gewässer. Für Wasserorganismen definiert sie die Lebensräume von Süßwasser, Brackwasser und Meerwasser. Tests der Toxizität von Chemikalien und Bewertungen ihrer ökologischen Risiken für Wasserorganismen sind in Süßwasser, aber die Toxizität von Chemikalien für Wasserorganismen ist abhängig von pH-Wert, Temperatur und Salzgehalt häufig durchgeführt. Es gibt keine Methode, jedoch zum Testen der Salinität Abhängigkeit von Toxizität für Wasserorganismen. Hier haben wir Medaka (Oryzias latipes) , weil sie an Süßwasser, Brackwasser angepasst werden kann, und Meerwasser. Verschiedene Konzentrationen von Embryo-Aufzuchtmedium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x und 30x) wurden eingesetzt, um die Toxizität von Silber nano-kolloidaler Teilchen (SNCs) zu testen, Eier (1x ERM und 30x WKM Medaka haben osmotischen Druck äquivalent In den Süß- und Meerwasser, beziehungsweise). In Sechs-Well - Kunststoffplatten 15 Medaka - Eier in dreifacher Ausfertigung wurden mit 10 mg / L zu SNCs ausgesetzt ^und# 8722; 1 in verschiedenen Konzentrationen von ERM bei pH 7 und 25 ° C im Dunkeln.

Wir haben ein Binokular und einem Mikrometer auf dem Schlüpfen Tag (Abschnitt 4) Herzfrequenz pro 15 Sekunden und Augen Durchmesser am Tag 6 und voller Körperlänge der Larven zu messen. Die Embryonen wurden bis zum Schlüpfen oder Tag 14 beobachtet; zählten wir dann die Schlupfrate für 14 Tage jeden Tag (Abschnitt 4). Um Silber Akkumulation in Embryonen zu sehen, verwendeten wir induktiv Plasma-Massenspektrometrie gekoppelt mit zunehmender Salinität die Silberkonzentration von Testlösungen (Abschnitt 5) und dechorionated Embryonen (Abschnitt 6) .Die Toxizität der SNCs zu Medaka Embryonen offensichtlich erhöht zu messen. Dieses neue Verfahren ermöglicht es, die Toxizität von Chemikalien in verschiedenen Salzgehalten zu testen.

Einleitung

¹ Seit der Gründung der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) Prüfrichtlinien zur Prüfung von Chemikalien im Jahr 1979 wurden 38 Testrichtlinien wurden in Abschnitt 2 der Leitlinien, Auswirkungen auf biotische Systeme veröffentlicht. Alle von den Wasserorganismen wurden aus Süßwasserhabitaten getestet, nämlich Süßwasserpflanzen; Algen; wirbellose Tiere wie Daphnien und Chironomiden; und Fische wie Medaka, Zebrafisch und Regenbogenforelle. Im Vergleich zu Salzwasser-Umgebungen, Süßwasser-Umgebungen mehr direkt durch menschliche wirtschaftlichen und industriellen Tätigkeiten betroffen. Daher Süßwasser-Umgebungen wurden für den Test priorisiert, weil sie ein höheres Risiko von Verschmutzung sind.

In den Küstengebieten, einschließlich der Mündungen, variieren Salinität zwischen Brackwasser und Meerwasser Bedingungen, und diese Bereiche werden oft durch industrielle Tätigkeit ² belastet. Die Küstengebiete und ihre zugehörigen Feuchtgebiete werden durch h gekennzeichnetigh ökologische Artenvielfalt und Produktivität. Küstenökosysteme müssen daher durch chemische Verschmutzung geschützt werden. Allerdings gibt wurde in Brackwasser und Meerwasser Lebensräume ökotoxikologische Forschung beschränkt.

Sakaizumi ³ untersucht die toxischen Wechselwirkungen zwischen Methylquecksilber und Salzgehalt in der japanischen Medaka Eier und festgestellt , dass der osmotische Druck der Testlösung eine Erhöhung der Toxizität des Methylquecksilber verbessert. . Sumitani et al ⁴ verwendet Medaka Eier die Toxizität von Deponiesickerwasser zu untersuchen; sie fanden heraus, dass der osmotische Äquivalenz von Sickerwasser auf die Eier der Schlüssel zu induzieren Anomalien während der Embryonalentwicklung war. Darüber hinaus Kashiwada ⁵ berichtet , dass Kunststoff - Nanopartikel (39,4 nm Durchmesser) leicht durch das Medaka - Ei Chorion unter Brack Bedingungen durch (15x Embryo Aufzuchtmedium (ERM)).

Ein typischer kleiner Fisch - Modell, die japanischen Medaka (Oryzias latipes ) hat in grundlegende Biologie und Ökotoxikologie ⁶ verwendet. Japanische Medaka kann unter den Bedingungen im Bereich von Süßwasser Meerwasser leben wegen ihrer hoch entwickelten Chloridzellen ^7. Sie sind daher geeignet für die Prüfung in Bedingungen mit einem weiten Bereich von Salzkonzentrationen nützlich.

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Protokoll

Die japanischen Medaka in dieser Studie verwendet wurden, auf humane Weise in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts der Toyo University, unter Berücksichtigung für die Linderung von Not und Beschwerden behandelt.

1. Silbernanokolloide (SNCs)

1. Bestellen Sie gereinigte SNCs (20 mg / L ^-1, 99,99% Reinheit, Partikel mittlerer Durchmesser etwa 28,4 ± 8,5 nm in destilliertem Wasser suspendiert).
2. Überprüfen Sie die Reinheit und Konzentration des Silbers durch induktiv gekoppelte Plasma - Massenspektrometrie (ICP-MS) analysiert gemäß Betriebsanleitung ^8. Das Vorbehandlungsverfahren für ICP-MS-Analysen wird in Abschnitt 7 beschrieben.

2. Herstellung von SNC - Lösungen (Mischungen aus Silber Kolloid- und Ag ⁺⁾ mit unterschiedlichen Salinität

1. Vorbereitung 60 × ERM , bestehend aus 60 g NaCl, 1,8 g KCl, 2,4 g CaCl ₂ · 2H ₂ O und 9,78 g MgSO ₄ · 7H ₂ O in 1 l ultrapure Wasser; den pH - Wert auf 7,0 mit 1,25% NaHCO ₃ in Reinstwasser einzustellen.
2. Rühren Sie die ERM-Lösung bei 25 ° C über Nacht.
3. Mix SNCs mit verdünntem ERM. Bereiten Sie 40 ml jeder SNC-ERM Mischlösung. Die Endkonzentration beträgt 10 mg / L ^-1 SNCs in verschiedenen Konzentrationen von ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x oder 30x).
4. Der pH - Wert des SNC-ERM gemischte Lösung auf 7,0 mit 0,625% NaHCO ₃ in Reinstwasser. pH - Einstellung ist sehr wichtig , die SNC - Lösung bei der Vorbereitung, da Ag ⁺ Freisetzung von sauren Bedingungen erleichtert wird ^9.
5. Verwenden Sie AgNO ₃ als Referenzverbindung für SNCs.
   1. Mix AgNO ₃ mit verdünnter ERM. Vorbereitung 40 ml AgNO ₃ -ERM gemischte Lösung bei einer AgNO & _sub3 ; -Konzentration von 15,7 mg / L ^-1 (10 mg / L ^-1 Silber) in verschiedenen Konzentrationen von ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x oder 30x) .
      Hinweis: Um die Silberkolloid Toxizität zu untersuchen, AgNO ₃Lösung, die eine Quelle von löslichem Silber ist, wird als eine Referenzverbindung für SNCs verwendet, die eine Mischung aus Silberkolloide und lösliches Silber sind.

3. Medaka Kultur und Ei Ernte

1. Beziehen Sie die Medaka (O. latipes) (orange-rot - Stamm) (60 Männer und 60 Frauen).
2. Kultur Medaka als Gruppen (20 Männer und 20 Frauen als eine Gruppe) in ERM 1x in 3 L Tanks durch einen Medaka Flow-Through-Kultivierungssystem.
   1. Kultur unter den folgenden Bedingungen:
      pH-Bereich des Kulturmediums: 6,2 bis 6,5
      Licht: Dunkel-Zyklus: 16: 8 Stunden
      Temperatur des Kulturmediums: 24 ± 0,5 ° C
      osmotischen Druck des Kulturmediums 257 mOsm
3. Feed - Medaka auf Artemia salina Nauplien um 10:00 Uhr (einmal täglich) und Futtermittel einen künstlichen trockenen Fisch Diät um 09:00 Uhr, 11:00, 13:00, 15:00, und 17.00 Uhr (fünf Mal pro Tag).
   1. Erhalten A. salina Nauplien.
   2. Bereiten 5 L einer 3,0% igen Salzlösung in einem Kunststoffbecher.
   3. In 30 g Artemia Eier in die Salzlösung in das Becherglas.
   4. Inkubiere die Eier bei 25 ° C für 48 Stunden mit sprudelnden (4 l / min ^-1) eine Belüftungspumpe.
   5. Nach 48 Stunden, die sprudelnden stoppen.
   6. Lassen Sie die Lösung stehen für 5 bis 10 min die schraffierten A. zu trennen salina Nauplien (unterer Teil der Lösung) von den nicht geschlüpften Eier und Eierschalen (oberer Teil der Lösung).
   7. Die obere Schicht der Lösung durch Dekantierung.
   8. Filtern Sie den unteren Teil der Lösung durch ein Sieb mit Öffnungen von 283 & mgr; m, und sammeln Sie die Nauplien, die mit Öffnungen von 198 & mgr; m auf einem Netz passieren.
   9. Führen Sie die Nauplien zu den Medaka innerhalb von 6 Stunden.
4. Nachdem die weiblichen Medaka gelaicht haben, entfernen Sie die externe Ei Cluster sanft aus den Körpern der Frauen oder die Eier aus dem Boden des durch die Verwendung eines sm Fischbehälter sammelnalle netto (netto Größe 5 cm x 5 cm, Lochgröße 0,2 mm x 0,2 mm).
5. Spülen Sie das Ei-Cluster mit Leitungswasser für 5 Sekunden fließt.
6. Fügen Sie alle die gespülten Ei-Cluster zu 30x ERM-Lösung.
7. Entfernen Sie die Cluster aus der Lösung nach 1 min und legen Sie die Ei-Cluster zwischen trockenen Papierhandtüchern und Rolle vorsichtig.
8. Setzen Sie die Eier wieder in den 30x ERM.
9. Wählen Sie befruchtete Eier unter einem Binokular.
10. Platz ausgewählt 810 Eier in 1x ERM in Sechs-Well-Kunststoffplatten mit einer Pinzette.
11. Inkubiere die Eier bei 25 ± 0,1 ° C in einem Inkubator , bis Entwicklungsstadium 21 (Entwicklungsstadien der Medaka - Embryonen aus der Arbeit von Iwamatsu ¹⁰ definiert wurden.)
12. Suchen Sie sich bebrütete Eier in Entwicklungsstufe 21 unter einem Binokular.
13. Spülen Sie ausgewählte Eier mit 1x ERM.
14. Betreff der gespülten Eier Belichtungsexperimente (Abschnitt 4).

4. Prüfung der Toxizität von SNCs oder AgNO ₃ Bei verschiedenen ERM Salzhaltigkeiten

1. Spülen Sie Medaka Eier (Stufe 21) dreimal mit Testlösung [SNCs (10 mg / L ^-1) oder AgNO ₃ (15,7 mg / L ^-1 als 10 mg / L ^-1 Silber) bei jeder Konzentration von ERM (1x, 5x , 10x, 15x, 20x, 30x oder) bei pH 7]. Als Kontrollen verwenden Eier in 1 × bis 30 × ERM bei pH 7.
2. Liste 15 gespült Eier bis 5 ml jeder Testlösung in Sechs-Well-Kunststoffplatten. (Führen Sie die Belichtungsexperimente dreimal für SNC oder AgNO ₃ Toxizität Testen jeder Testlösung verwendet wird .)
3. Wickeln Sie die Platten in Aluminiumfolie.
4. Inkubieren Sie die gewickelt Platten bei 25 ° C im Dunkeln bis zum Schlüpfen oder für 14 Tage.
5. Beachten Sie die exponierten Eier alle 24 Stunden für biologische Veränderungen und tote Eier (Abbildungen 1 und 2).
6. Tauschen Sie den Prüflösungen alle 24 Stunden.
7. Führen Sie Beobachtungen wie folgt.
   1. Am 6. Tag der Exposition, zählen die Herzfrequenz (je 15 sec) of Medaka - Embryonen unter einem Präpariermikroskop mit einer Stoppuhr (Abbildung 3a) verwendet wird .
   2. Am 6. Tag der Exposition, messen die Augengröße (Durchmesser) von Medaka - Embryonen unter einem Binokular mit einem Mikrometer (Abbildung 3b) verwendet wird .
   3. Auf dem Schlüpfen Tag, messen die volle Körperlängen von Larven unter einem Binokular mit einem Mikrometer (Abbildung 3c) verwendet wird .
   4. Zählen Sie die Gesamtzahl der exponierten Eier , die über den 14 Tagen (Abbildung 3d) schlüpfen.

5. Isolierung von löslichen Silber von SNC-Lösung und Silber-Analyse

1. Isolieren lösliches Silber von jeder SNC-Lösung (eine Mischung aus Silberkolloide und löslichen Silber) durch Filtrieren durch einen 3 kDa-Membranfilter bei 14000 x g und 4 ° C für 10 min. Verwenden Sie ein 3 kDa Membranfilter löslichen Silber aus den SNCs zu isolieren, da der gemeldete mittleren Durchmesser von aggregierten SNCs in ERM 1x 67,8 nm ¹¹ and der von Ag ⁺ ist 0,162 nm ^12; die 3 kDa Membran schließt Teilchen mit Durchmessern von 2 nm oder mehr ^13.
2. Messung der Silberkonzentration in 50 & mgr; l filtrierten Lösung (= die löslichen Silberkonzentration) durch ICP-MS - Analyse (Abbildung 3e) nach der ICP-MS - Betriebshandbuch ^8. Das Vorbehandlungsverfahren für die ICP-MS-Analysen wird in Abschnitt 7 beschrieben.

6. Messung der Silber Bioakkumulation in Medaka Embryonen

1. Expose Medaka Eier (Stufe 21) zu SNCs oder AgNO ₃ , wie in Abschnitt 4 beschrieben.
2. Am Tag 6 der Belichtungs Entfernen Chorion aus dem Ei (dh dechorion) durch in der Medaka Buch ¹⁴ beschrieben Medaka Schlüpfen Enzym gemäß dem Protokoll.
3. Messung der Silberkonzentration der dechorioned Eier durch ICP-MS - Analyse nach der ICP-MS - Betriebshandbuch ⁸ (3f). die VorbehandlungsVerfahren für die ICP-MS-Analysen wird in Abschnitt 7 beschrieben.

7. Messung der Silberkonzentration mittels ICP-MS-Analyse

1. In Proben [50 ul Silberlösung (für die Validierung der Silberkonzentration; Teil 1); drei dechorionated Embryonen (Abschnitt 5); oder 50 & mgr; l der gefilterten Lösung (Abschnitt 5)] in ein 50 ml Teflonbecher.
2. Werden 2,0 ml ultrareinem Salpetersäure zu dem 50 ml-Becherglas.
3. Das Gemisch wird auf einer Heizplatte bei 110 ° C, bis kurz bevor es austrocknet (ca. 3 h).
4. Aufzulösen vollständig die organische Substanz, fügen 2,0 ml ultrareinem Salpetersäure und 0,5 ml Wasserstoffperoxid in das Becherglas.
5. Das Gemisch wird wieder auf der heißen Platte bis kurz bevor es austrocknet (ca. 3 h).
6. Löse den Rückstand in 4 ml 1,0% ultrareine Salpetersäure-Lösung.
7. Transfer 4 ml der Lösung in ein Zentrifugenröhrchen.
8. Wiederholen 7,6-7,7 zweimal (insgesamt dreimal). Das Endvolumen beträgt 12,0ml.
9. Messen Sie die Silberkonzentration der Probe (gelöst in 1,0% Reinst - Salpetersäure) unter Verwendung von ICP-MS - Analyse nach der Betriebsanleitung ^8.
   1. Verwenden Sie einen internen und einen externen Standardlösung (siehe Materialliste) , um die Silberkonzentration zu quantifizieren. Die internen und externen Standardlösung wird durch American Association for Laboratory Accreditation (A2LA) akkreditiert. Die Nachweisgrenzen von Silber waren 0,0018 ng / ml ^-1 (Lösung) und 0,016 ng mg-Gewicht ^-1 (Embryo Körper).

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Ergebnisse

Die Wirkung der Salinität auf SNC Toxizität war sehr offensichtlich: die Induktion von Deformitäten oder Tod abhängig war Salinität (Abbildungen 1 und 2). Wir maßen phänotypische Biomarker (Herzfrequenz, Augengröße, voller Körperlänge und Schlupfrate) in SNC (10 mg / L ^-1) -exposed Embryonen. Diese phänotypischen Biomarker Salinität abhängige SNC Toxizität ergab.

Die ...

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Diskussion

Medaka ist ein Süßwasserfisch, die sehr tolerant gegenüber Meerwasser ist; es ist nicht bekannt , dass die ursprüngliche natürliche Lebensraum dieser Fisch Salzwasser vor der japanischen Küste ⁶ war. Daher haben Medakafisches Chloridzellen ⁷ gut entwickelt. Diese einzigartige Eigenschaft bietet Wissenschaftlern eine neue Möglichkeit, die Toxizität von Chemikalien in der Umwelt als eine Funktion der Salinität (Süßwasser Meerwasser) zu testen, indem nur eine einzige Art von Fisch verwendet...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver nanocolloids	Utopia Silver Supplements
NaCl	Nacalai Tesque, Inc.	31319-45	For making ERM
KCl	Nacalai Tesque, Inc.	28513-85	For making ERM
CaCl2·2H2O	Nacalai Tesque, Inc.	06730-15	For making ERM
MgSO4·7H2O	Nacalai Tesque, Inc.	21002-85	For making ERM
NaHCO3	Nacalai Tesque, Inc.	31212-25	For making ERM
AgNO3	Nacalai Tesque, Inc.	31018-72
pH meter	HORIBA, Ltd.	F-51S
Balance	Mettler-Toledo International Inc.	MS204S
medaka (Oryzias latipes) orange-red strain	National Institute for Environmental Studies
medaka flow-through culturing system	Meito Suien Co.	MEITOsystem
Artemia salina nauplii eggs	Japan pet design Co. Ltd	4975677033759
aeration pump	Japan pet design Co. Ltd	non-noise w300
Otohime larval β-1	Marubeni Nissin Feed Co. Ltd	Otohime larval β-1	Artificial dry fish diet
dissecting microscope	Leica microsystems	M165FC
micrometer	Fujikogaku, Ltd.	10450023
incubator	Nksystem	TG-180-5LB
shaker	ELMI Ltd.	Aizkraukles 21-136
6-well plastic plates	Greiner CELLSTAR	M8562-100EA
aluminum foil	AS ONE Co.	6-713-02
stopwatch	DRETEC Co. Ltd.	SW-111YE
3 kDa membrane filter	EMD Millipore Corporation	0.5 ml centrifugal-type filter
50 ml Teflon beaker	AS ONE Co.	33431097
Custom claritas standard	SPEXertificate	ZSTC-538	For internal standard
Custom claritas standard	SPEXertificate	ZSTC-622	For external standard
ultrapure nitric acid	Kanto Chemical Co.	28163-5B
hydrogen peroxide	Kanto Chemical Co.	18084-1B	for atomic absorption spectrometry
ICP-MS	Thermo Scientific	Thermo Scientific X Series 2
hot plate	Tiger Co.	CRC-A300