באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

Summary

אנו מציגים פרוטוקול על איך לנצל טומוגרפיה קריו-אלקטרון תפוקה גבוהה כדי לקבוע ברזולוציה גבוהה במבנים באתרו של מכונות מולקולריות. הפרוטוקול מאפשר כמויות גדולות של נתונים לעיבוד, ימנע צווארי בקבוק משותפים ומפחית את זמן ההשבתה משאב, המאפשר למשתמש להתמקד בשאלות ביולוגיות חשובות.

Abstract

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

Introduction

III מערכות סוג ההפרשה (T3SS) הן גורמי אלימות חיוניים לפתוגנים גראם שלילי רבים. Injectisome, הידוע גם במתחם המחט, הוא המכונה T3SS המרכזית הנדרשת לטרנסלוקציה הישירה של חלבוני מפעיל מהחיידק לתאי מארח אוקריוטים ^{1, 2.} Injectisome כולל מחט תאית, גוף בסיסי, ומורכב cytoplasmic גם ידוע כמורכב מיון ^3. מחקרים קודמים הובהרו מבני 3-D של injectisomes המטוהר מסלמונלה וShigella, יחד עם המבנים האטומיים של חלבוני גוף בסיסיים גדולים ^{4, 5.} אחרונים במבנים באתרו של injectisomes מסלמונלה, Shigella, וYersinia נחשפו על ידי cryo-ET ^{6 , 7.} עם זאת, מורכב cytoplasmic, חיוני לבחירת מפעיל והרכבת מחט, לא דמיינו במבנים אלה.

קריו ET הוא most טכניקה מתאימה להדמיה מולקולרית מכונות ברזולוציה ננומטר בתוך הקשרה המקורי הסלולרי (באתר). עם זאת, החלטת השגה על ידי cryo-ET מוגבל על ידי עובי דגימה. כדי להתגבר על החסרון, שצלמנו injectisomes שלם במתח flexneri ארסי Shigella שמהונדס גנטי כדי לייצר minicells רזה מספיק cryo-ET. מגבלה נוספת של cryo-ET היא הרגישות של המדגם לקרינה הנגרמת על ידי קרן האלקטרונים, שהורס את המידע ברזולוציה הגבוהה במדגם מהר מאוד. כתוצאה מכך, במינונים נמוכים מאוד משמשים להטיה-תמונות בודדות, כך שמינון מתאים יכול להיות מופץ בקרב ההטיה-הסדרה המלאה. זה מוריד את יחס אות לרעש (SNR) בשחזור הגמר, מה שהופך את זה קשה להבחין תכונות המבניות של הנושא מהכמות הגדולה של רעש בtomogram ומגביל את הרזולוציה שיכול להיות מושגת על ידי הוצאה מחדר הקפאה מאוד ET. Conventiעיבוד תמונת onal כגון פורייה ומסננים אמיתיים-חלל כמו גם את הדגימה ניתן להשתמש כדי להגביר את הניגודיות, אבל על חשבון סינון הרבה של המידע ברזולוציה הגבוהה. לאחרונה, מיצוע תת-tomogram איפשר להגדיל באופן משמעותי את יחס האות לרעש ולאחר מכן ההחלטה הסופית במקרים מסוימים לרמות תת-ננומטר ^{8, 9.} ניתוח מפורט יותר של מתחמים מתאפשר על ידי המחשוב חילוץ אלפי תת-tomograms מכיל תחומי העניין מtomograms המקורי ולאחר מכן יישור וממוצע תת-tomograms לקבוע במבנים מורכבים אתר עם ​​יחס אות לרעש גבוה יותר ורזולוציה גבוהה יותר. ניתן לשלב שיטות אלה עם גישות גנטיות לספק תובנות גדולות עוד יותר למכלולי macromolecular והתצורות הדינמיות שלהם בהקשר הסלולרי המקומי.

באופן כללי, עשרות או אפילו מאות אלף תת-tomograms צריכים להיות בממוצע על מנת לקבוע גבוהמבני -resolution באתר. הרכישה של מספר מספיק הטיה-סדרה של דרושה כדי לייצר מספר רב של תת-tomograms הופך לצוואר בקבוק במהירות. הטיה-הסדרה וכתוצאה מכך מושפעת לעתים שינוי מושרה קרן, תגובה חריפה שלב, כמו גם הגדלה, סיבוב והטית פגמים, שיש לפתור כדי להביא את ההטיה-הסדרה ליישור לפני השחזור. סדרת ההטיה מיושרת בדרך כלל על ידי סמני מעקב זהב fiducial, אשר נבחרו באופן מסורתי באופן ידני באמצעות בדיקה של ההטיה-הסדרה, וגרמו עוד צוואר בקבוק. חבילות תוכנה רבות פותחו עבור רכישת הטיה-סדרה אוטומטית באמצעות מיקרוסקופים מבוקרים מחשב אלקטרונים ^{10, 11, 12,} יישור הטיה-סדרה ושחזור ^{13, 14} ותת-tomogram ממוצע ^15-18. חבילות אלה להתמודד עם פעולות בדידות בזרימת העבודה של cryo-ET, הוא הופך להיות רצוי לבנות רמה גבוהה יותר של הפשטה בתהליך לSystematically לייעל את כל התכנית לצינור אחד. לכן, פיתחנו ספריית עטיפת תוכנה "tomoauto" שנועדה לארגן מספר החבילות אלה ליחידה חצי אוטומטי יחידה, המאפשר למבצע משתמש פשוט, תוך שמירה על תצורה מלאה של כל רכיב באופן ריכוזי. הספרייה היא קוד פתוח, מתועד היטב, שפותח ללא הרף וזמין באופן חופשי לשימוש, פיתוח מותאם או אינטגרציה נוספת באמצעות מאגר קוד מקור מרוחק מקוון (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).

צינור cryo-ET תפוקה גבוהה זה נוצל כדי להמחיש injectisomes שלם בס minicells flexneri. סך של 1,917 tomograms נוצרו בשיטה זו, חושף ברזולוציה גבוהה במבנה אתר של המכונה ללא פגע כולל פלטפורמת מיון cytoplasmic נקבעה על ידי משנה tomogram ממוצע ^19. יחד עם הדמיה מולקולרית של wild-type ומטרמכונות utant, צינור התפוקה גבוהה שלנו מספקת דרך חדשה להבין את המבנה ותפקוד של injectisome שלם בהקשר הסלולרי המקומי.

Protocol

1. הכנת Minicell

1. כדי להפוך ס minicells flexneri, להפוך 1 μl של פלסמיד pBS58, המבטא constitutively גני חלוקת התא הקולי Escherichia ftsQ, ftsA, וftsZ מנמוך עותק spectinomycin עמיד פלסמיד לתוך 5 μl electrocompetent סטרפטומיצין עמיד 5a סרוטיפ (M90T-SM) תאים על ידי electroporation 2.5 קילו וולט עבור 5 אלפיות שניים בcuvettes 1 מ"מ.
2. דגימות minicell החנות ב -80 ° C בגליצרול 15% בmicrotube קריוגני 1.5 מיליליטר. כשמוכנים לשימוש, לגרד כ 5 μl של תאים מmicrotube הופשר באמצעות קצה פיפטה ולהשעות את התאים 4 מיליליטר מרק סויה tryptic עם spectinomycin הוסיף 100 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז. לגדול O / N על 37 מעלות צלזיוס.
3. פיפטה 2 מיליליטר של התרבות ממרק סויה 1.2 לtryptic 200 מיליליטר עם spectinomycin הוסיף שוב ל -100 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז. לגדול ב 37 מעלות צלזיוס לשלב מאוחר יומן.
4. כדי להעשיר את minicells, צנטריפוגה200 מיליליטר של התרבות מ1.3 XG ב 1000 במשך 5 דקות. יוצק בזהירות את חלק supernatant לתוך צינור צנטריפוגות חדש וצנטריפוגות ב 20,000 XG במשך 10 דקות. יוצק בזהירות ותשאיר חלק supernatant, ולערבב בעדינות את הכדור עם הנוזל שנותר באמצעות קצה פיפטה ולהעביר כ -100 μl של תערובת גלולה לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר.

2. EM הכנת רשת

1. מניחים בצד פחמן רשת נחושת 200-רשת סרט פחמן מחורר R2 / 2 עד בשקופית זכוכית.
   הערה: / 2 רשת 200-רשת R2 נבחרה על מנת למקסם את מספר ההטיה סדרה-שניתן להגדיר לרכוש בכיכר רשת אחת ועדיין תומך בדגימה והצבת הקצה של סרט פחמן בתחום של המצלמה של בהגדלה הרצויה. רשתות פיינר רשת וסרטים קטנים יותר המחוררת פחמן כגון R1.2 / 1.3 400-רשת יכולה לשמש לדגימות הדמיה בהגדלה גבוהה יותר; סרטים גדולים המחוררת פחמן כגון R3.5 / 1 200 רשת יכולה להיות שימושד עבור דגימות צילם בהגדלה נמוכה או אם מיקרוסקופ לא יכיל קצה פחמן וסרטי פחמן מחוררים עם מרווח גדול יותר כגון R1 / 4 200-רשת יכול לשמש כדי לסייע עם יישור השלב לאזור של עניין והגנת אזורים מ חשיפת יתר בהתמקדות ושגרת מעקב.
2. מניחים את השקף על הפלטפורמה במכשיר הפרשות זוהרת.
   הערה: אנו משתמשים במכשיר בבית שבו האנודה ופלטפורמה כבר במכונה לייבוש ואקום, והוא מופעל על ידי גנרטור בתדירות גבוהה. לאחר יצירת ואקום, לצרף את מחולל הבדיקה בתדירות גבוהה להאנודה והכוח על הבדיקה דקות 1 לזהור לפרוק את הרשת. הזמן הדרוש לזוהר פריקת הרשת יכולה לנוע בין כמה שניות עד דקה. שינוי זמן הפרשות זוהרת יכול לשמש כדי לאבחן בעיות בריכוז דגימה ורשתות המופיעות יבש ללא קרח זגוגית.
3. הסר את הרשת עם סט של מלקחיים, ולנעול את המלקחיים סגרו עם ב אלסטיו.
4. להוסיף 10 פתרון זהב colloidal ננומטר לצינור microcentrifuge עם minicells הערוך 1.4 100 μl ומערבבים בעדינות על ידי מצליף את הצינור עם אצבע. עם 4 מקום פיפטה μl חדש של התערובת על הרשת מוכנה ב 2.2.
   הערה: זהב קולואיד הוא זמין במגוון של גדלים ויש להיזהר שהגודל של הזהב הוא יותר מ -5 פיקסלים בהתחשב בגודל פיקסל של micrographs להיות מעובד בהגדלת רכש, בעוד שלא היה גדול מדי לתכונות מעורפלות של עניין.
5. הכן את מנגנון הצעד-הקפאה; למלא את מיכל ההקפאה החיצוני עם חנקן נוזלי ולאחר מכן למלא את התא הפנימי עם אתאן הנוזלי. צרף את המלקחיים עם הרשת למוט הבוכנה ולנעול את מוט הבוכנה למצב המורם.
   הערה: ראה ינקו ואח ^'20 לפרוטוקול המתאר את השימוש במנגנון צניחה-הקפאה מסחרית..
6. למחוק את הרשת על ידי הנגיעה בזהירות פיסת נייר סינון כדי לאהוא שחרר של מדגם עד המניסקוס בין מפריד רשת ונייר סינון והפתילה על נייר המסנן מפסיק, ואז לשחרר באופן מיידי את מוט הבוכנה, הקפאת הרשת. מוציאים בזהירות את המלקחיים ממוט הבוכנה ולמקם את הרשת לבעל רשת.
7. הכן את תחנת מעבר cryo-EM ידי מילוי מיכל משאבת אזור הטעינה וקליטה עם חנקן נוזלי. ברגע שאזור הטעינה הוא במקום טמפרטורת חנקן נוזלי בעל הרשת ומחסנית דגימת מיקרוסקופ באזור הטעינה.
8. מוציא בזהירות את טבעת הנעילה, אשר היא או טבעת נעילת הברגה קטנה על מיקרוסקופי Polara מוקדם או טבעת קליפ בסגנון C על מודלים מאוחר יותר; הנח את רשת EM לתוך המחסנית באמצעות מלקחיים ולאחר מכן בעדינות לצרף את טבעת הנעילה בחזרה אל מחסנית אבטחת הרשת.
9. הסר את בעל דגימה מרובה ממיקרוסקופ ולצרף אותו לתחנת המעבר. הנח את מחסנית הדגימה לתוך מחזיק באמצעות מלקחיים מחסניתd לחזור בעל מאזור הטעינה ולהעביר את בעל דגימה מרובה חזרה למיקרוסקופ.
   הערה: ראה חן et al ²¹ לפרוטוקול חזותי המפרט 2.1-2.9..

אוסף הטיה-סדרה אוטומטית 3. תפוקה גבוהה

1. אוסף של מפות נמוכה הגדלה
   1. פתח חלון Navigator חדש באמצעות לחיצה על 'פתח' בתפריט 'Navigator "של SerialEM ¹⁰ (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
   2. מצא את ריבועי רשת המכילים תנאי הדמיה מקובלים (כלומר, קרח דק, אין זיהום, נושא הריבית) באמצעות מסך הניאון בהגדלה נמוכה (~ 2,300X לדגימת minicell).
      הערה: [אופציונאלי:. יכול להיות אוטומטי צעד זה עם SerialEM ידי montaging כל הרשת, אבל זה יכול להיות מהיר יותר פשוט לבחור כמה אזורים ידני]
   3. התאם את השלב לגובה eucentric ידי הטיית בעל הדגימה עד 50 ° לאחר מכן להתאיםZ-הגובה עד תרגום XY של השלב הוא מינימאלי בין הנופים המוטה וuntilted.
   4. לעבור למרכז כיכר הרשת ולחץ על הכפתור 'הוסף שלב ממוצע' בחלון הניווט כדי לאחסן את מיקום השלב הנוכחי.
   5. המשך צעדים 3.1.1-4 מעל עד שכל עמדות שלב ריבועי רשת המקובלות נשמרו.
   6. פתיחת קובץ MRC מונטאז 'חדש באמצעות לחיצה על' מונטאז 'החדש' בתפריט 'הקובץ'. בהגדרת Montage שיח שנפתחת, בחר מספר החתיכות בX ו- Y שתרכושנה את כל כיכר הרשת (לדוגמא, 10 x 10 לרשת 200 רשת סטנדרטית). השתמש binning גבוה כגון 8 ובחר את "הזז שלב במקום העברת תמונה 'ו' דלג מתאמים משמשים כדי ליישר חתיכות" כפתורי רדיו.
   7. בחלון Navigator לחץ עמדת השלב הראשונה ולהגדיר אותו יירכש על ידי סימון התיבה 'רוכש את'. חזור על פעולה זו עבור כל עמדת שלב בחלון Navigator.
   8. פתח את Navigator לרכוש שיח באמצעות לחיצה על 'רוכשים בנקודות' בתפריט 'Navigator ". בדוק את 'התמונה רוכשת את המפה' ותיבת סימון 'eucentricity קשוח "ולוודא שכל תיבות הסימון אחרות שלא נבדק. לחץ על 'המשך' כדי לאסוף מונטאז 'בכל עמדת שלב.
2. רכישת הטיה-סדרה
   1. בחלון Navigator בחר באחת מהמפות שנרכשו ולחץ על הכפתור 'טען המפה'.
   2. בחלון Navigator לחץ נקודות 'הוסף נקודות "כפתור ובחר במפה שבה לרכישת הטיה-סדרה. לאחר מכן לחץ על "להפסיק להוסיף נקודות" כפתור. חזור על פעולה עבור כל מפה שנאסף.
   3. בתפריט המצלמה בחר 'פרמטרים' ולהגדיר את הפרמטרים למצבי פוקוס, ניסיון, והשיא. [אופציונאלי:.-מופרדת מנה יכולים להיות מוגדרים נתונים בפרמטרים למצב הקלטה]
   4. בחר נקודה בחלון הניווט ולבדוק את הסדרה-Tilt '9; תיבת סימון. בחלון הדו-שיח הגדרת ההטיה הסדרה-שנפתח בחרו בפרמטרים רצויים לאוסף הטיה-הסדרה. חזור לשאר נקודות שנבחרו בחלון Navigator, אך לא יבחר המפות.
   5. בתפריט הניווט בחר שוב 'רוכשים בנקודות ". בנווט רוכשים הדו-שיח לבחור "ליישר מחדש לפריט ', מיקוד אוטומטי' ו 'eucentricity קשוח" כמשימות ראשוניות, ובחר' סדרת הטיה לרכוש "כמשימה העיקרית, ובחר 'שסתומים עמודה לסגור בסוף' כדי לסגור את הטור כאשר כל מהנקודות שנאספו. על הליך הטיה-סדרה ייאסף בכל נקודה בכל מפה.

עיבוד הטיה-סדרה אוטומטית 4. תפוקה גבוהה ושיקום באמצעות Tomoauto

1. תיקון של תנועה מושרה קרן בנתונים מופרדים במינון [אופציונאלי]
   הערה: Tomoauto משתמשת MOTIONCORR ²² (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.htמיליליטר) כדי להסיר תנועה מושרה קרן מmicrographs-מופרד מינון. NOTIONCORR ¹⁶ חייבים להיות מותקנים במערכת.
   1. עם ההטיה-הסדרה המקורית, יומן הפלט מSerialEM ¹⁰ ותמונות מינון מופרד בודדות כל בספריית העבודה הנוכחית, במסוף לבצע את הפקודה:
      dose_fractioned_to_stack
      הוא שמו של ההטיה הסדרה לעבד.
2. יישור ושיקום הטיה-סדרה
   הערה: Tomoauto כברירת מחדל משתמש ¹³ IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/) כדי להתמודד עם דור הטיה-סדרה אוטומטית מודל fiducial, יישור, נחישות של פונקצית ההעברה לעומת זאת, CTF-תיקון ^23, (CTF) ו שִׁחזוּר. לחלופין יש למשתמשים את האפשרות בtomoauto להשתמש ²⁴ RAPTOR (כלולה בIMOD) לדור אוטומטי fiducial מודל, CTFFIND4 ²⁵ (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) כדי לקבוע את CTF, וtomo3d ²⁶ (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) לשיקום או בכל שילוב של חבילות תוכנה על ידי תְצוּרָה. תצורה זו, כמו גם את הפרמטרים זמינה בכל חבילה מתבצעת על ידי קובץ תצורה גלובלי שניתן לערוך כדי להתאים את הערכים הנפוצים ביותר במעבדה בעת גם ניתן ליצור קבצי תצורה מקומיים לפרמטרים המשמשים לפירוט דגימה ספציפית, אוסף להגדיר או הטיה-סדרה בודדת. כל החבילות שרוצות לשמש חייבת להיות מותקנות במערכת.
   1. עם ההטיה-הסדרה בספריית העבודה הנוכחית, במסוף לבצע את הפקודה
      tomoauto --CTF --mode = ליישר
      היא ההטיה-הסדרה להיות מעובד ו< fid_diam> הוא diameter של סמני fiducial בננומטרים. פקודה זו תהיה ליישר ולהעריך את CTF של ההטיה-הסדרה באופן אוטומטי. אפשר לדלג על עיבוד CTF על ידי הסרת אפשרות --CTF מהפקודה.
   2. בדוק את ההטיה-הסדרה מיושרת חזותי לטעויות בולטות בעיבוד היישור ולבדוק המוערך CTF על ידי ביצוע הפקודות:
      3dmod <שם הקובץ> .ali
      submfg <שם הקובץ> _ctfplotter.com
      בהתאמה, כאשר <שם קובץ> הוא שמו של ההטיה-הסדרה בלי סיומת. כמו כן, בדוק את הפלט של פקודת tomoauto לראות את שגיאת השייר הממוצעת שנוצרה על ידי היישור, שבו הוא נתון כמותי של איכות יישור.
   3. בהתחשב יישור מקובל להמשיך עיבוד על ידי ביצוע הפקודה:
      tomoauל--CTF --mode = לשחזר
      עם אותו המשתמש כמו בהחלפות 4.2.1. פקודה זו תתקן CTF, למחוק את סמני fiducial מההטיה-הסדרה ולחשב את השחזור. שוב עיבוד CTF ניתן לדלג כמו ב4.2.1.
   4. [אופציונאלי] כדי לדלג על שלב הבדיקה ויזואלית ולהפוך באופן מלא לעיבוד ושחזור לבצע את הפקודה
      tomoauto --CTF
   5. [אופציונאלי] כדי להשתמש בתצורה מקומית ספציפית, עיין בתיעוד tomoauto על איך ליצור קובץ הגדרות מקומי, ולאחר מכן לבצע את הפקודה
      tomoauto [אפשרויות] ס
      כאשר הוא שמו של conf המקומיקובץ iguration.

מיצוע 5. תת-tomogram

הערה: אנו משתמשים בחבילת i3 ¹⁵ (http://www.electrontomography.org/) לעבד ניסויי מיצוע תת-tomogram, אולם הפרוטוקול מתואר חל בדרך כלל ברוב ניסויי מיצוע תת-tomogram תהליך packages16to תוכנת מיצוע תת-tomogram זמין, עם זאת הפרוטוקול מתואר חל בדרך כלל ברוב חבילות תוכנת מיצוע תת-tomogram זמין ^16-18.

1. עם tomogram המשוחזר בספריית העבודה הנוכחית לפתוח את tomogram לקטיף חלקיקים שהרצת הפקודה:
   tomopick .rec <שם הקובץ>
   כאשר <שם קובץ> הוא כמו ב4.2.2. בחלון שנפתח להשתמש בלחצן העכבר השמאלי כדי ללחוץ על ראשון גוף הבסיסי ולאחר מכן את קצה המחט כדי לבחור injectisome ולהשתמש בחץ-מפתחות למעלה ולמטה כדי ריף דרך פרוסות tomograM. בחר את כל injectisomes הגלוי באופן זה. זה מאחסן את הקואורדינטות בקובץ טקסט המגדירות את הציר של המבנה הארוך, כמו גם הערכה שתיים משלושת זוויות אוילר המתארים את הנטייה של המבנה.
2. תמצית המחשוב 400 ³ קוביות voxel מtomogram מרוכזות בנקודת האמצע של ציר זמן שהוגדר על ידי ביצוע הפקודה:
   קליפ שינוי גודל -cx -cy -cz -ix 400 -iy 400 -iz 400
   <שם קובץ> .rec _001.mrc <שם הקובץ>
   כאשר , , הן קואורדינטות נקודת האמצע של המבנה ו< שם הקובץ> הוא כמו ב4.2.2. הגודל של הקובייה שחולצה צריך להשתנות לפי המבנה והגדלת שימוש, וצריך להיות גדול מספיק כדי להקיף את המבנה של עניין, אשר למדגם זה הוא 400 ³ voxels כראוי.
3. תת-tomogram בפקטור של ארבעה כדי לצמצם את זמן חישוב ליישור ראשוני על ידי ביצוע הפקודה (סל) למטה מדגם:
   binvol -B 4 <שם הקובץ> _001.mrc _001.bin4.mrc <שם הקובץ>
   כאשר <שם קובץ> הוא כמו ב5.2.
4. החל אוילר נקבע זוויות למשנה tomograms ולחשב את הממוצע העולמי לייצר התבנית הראשונית שהרצת הפקודה.
   I3totsum.sh
5. יישר ולסווג תת-tomograms למטה נדגמו באמצעות מסכת סיווג בינארי של אזור cytoplasmic. לבצע מיצוע תת-tomogram בחלל פורייה כדי למזער את חפצי טריז חסר מאפיין של טומוגרפיה. לbinning 4 נתונים, אנא השתמש SAMPFACT = "4 4 4".
   i3mramsacls.sh
6. תת-tomograms באמצעות חזור על שלב 5.5 מטה-נדגמו על ידי גורם משני (SAMPFACT = &# 34; 2 2 2 ") ופעם נוספת עם נתונים המקוריים (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
   i3mramsacls.sh

תוצאות

דוגמאות של minicells ס flexneri נאסף ומעובד כהראה באיור סכמטי 1 באמצעות tomoauto הבא הצינור מפורט באיור 2. הטיה-סדרה נאספו באמצעות ¹⁰ SerialEM, המאפשר לרכישת הטיה-סדרת תפוקה גבוהה בנקודות שנקבעו על ידי המשתמש במפות מונ?...

Discussion

שיטת התפוקה גבוהה המתוארות כאן אפשרה לנו להטות סדרת 1,917 cryo לעבד ולייצר מעל 4,500 תת-tomograms של ס 'שלם flexneri injectisome ^19. הנתונים שנאספו הובילו לאפיון מפורט של בinjectisome אתר, לרבות cytoplasmic מיון מורכב. השיטה נוצלה גם כדי להמחיש כמה תאים שעברו מוטציה עם מחיקה ספצ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Tyrptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S0692
Electroporation Apparatus	Bio-rad	165-2100
1 mm Cuvette	BTX	45-0124
1.5 ml Cryogenic Tube	Thermoscientific	5000-1020
1.5 ml Microcentrifuge Tube	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey Carbon Grids	Quantifoil (Electron Microscopy Sciences)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
Glow Discharge Device	In-House		Commercial Alternative Available
Vacuum Desiccator	Sigma-Aldrich	Z119016	Used in In-House Glow Discharge Device
High-Frequency Generator	Electro-Technic Products	BD-10A	Used in In-House Glow Discharge Device.  CAUTION: This device generates high voltages.
Centrifuge
Forceps	Dumont (Electron Microscopy Sciences)	72705-D	Style 5 Anti-magnetic
Colliodal Gold	Aurion		BSA 10nm
Filter Paper	Whatman		#2
Ethane	Matheson Tri-Gas	UN1035
Nitrogen	Matheson Tri-Gas	UN1977
Plunger Device	In-House		Commercial Alternative Available
Cryogenic Grid Storage Box	Electron Microscopy Sciences	71166-30
Transmission Electron Microscope	FEI		Tecnai Polara F30 (300 KeV)
Direct Detection Device Camera	Gatan		K2 Summit
Tomogram Acquisiton Software	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography
Beam-induced Motion Correction Software	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU
Tilt-Series Alignment Software	IMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo
Automatic Fiducial Marker Modelling Software	IMOD		Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto)
CTF Determination Software	IMOD		Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto)
Tilt-Series Reconstruction Software	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo
Tilt-Series Automated Processing Software	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
Particle Picking Software	i3		http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD
Subvolume Averaging Software	i3		Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org