Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル

要約

我々は、分子機械のその場構造で高解像度を決定するために、ハイスループット低温電子断層撮影法を利用する方法のプロトコルを提示します。プロトコルは、処理すべき大量のデータを可能にし、一般的なボトルネックを回避し、ユーザは、重要な生物学的問題に集中することができ、リソースのダウンタイムを減少させます。

要約

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

概要

III型分泌系（T3SS）多くのグラム陰性病原体に不可欠な病原性決定因子です。また、針複合体として知られているinjectisomeは、真核生物の宿主細胞への細菌のエフェクタータンパク質の直接転座^1、2に必要な中央T3SS機である。injectisomeが外針、基礎体温、また既知の細胞質複合体を含みますソート複雑な³など。以前の研究では、主要な基礎体タンパク質^4、5の原子構造とともに、 サルモネラ菌や赤痢菌から精製injectisomesの3次元構造を解明した。 サルモネラ 、 赤痢菌 、およびエルシニアからinjectisomesのその場構造の最近の -ETクライオ⁶によって明らかにされました^7。しかし、エフェクターの選択と針アセンブリのための本質的な細胞質複合体は、それらの構造において可視化されていません。

クライオETはモスです（ その場で ）その本来の細胞のコンテキスト内でナノメートルの分解能で分子機構を画像化するための適切な技術をtは。それにもかかわらず、クライオETによって達成可能な解像度は、試験片の厚さによって制限されます。欠点を克服するために、我々は遺伝的に凍結ETのために十分に薄いミニ細胞を産生するように改変された病原性赤痢菌株でそのままinjectisomesを画像化しました。クライオETの他の制限は、非常に迅速に、サンプル中の高解像度の情報を破棄し、電子ビームによって誘起される放射線に対する試料の感受性です。適切な用量は、完全傾斜シリーズ間で分散することができるように、その結​​果、非常に低い用量は、個々の傾斜画像に使用されます。これは、非常に困難なことは断層像のノイズの大量から被写体の構造的特徴を区別することを可能にすると冷凍のことで達成できる解像度を制限し、最終的な再構成における信号対雑音比（SNR）を低下させますET。 Conventiこのようなフーリエ変換し、実空間フィルタなど、ならびにダウンサンプリングonal画像処理、コントラストを高めるために使用されるが、高解像度の情報の多くをフィルタリングを犠牲にすることができます。最近、副断層像の平均を大幅にサブナノメートルレベル^8,9にSNR、その後いくつかのケースでは、最終的な解像度を増加させることが可能となった。複合体のより詳細な分析は、計算含むサブ断層像の数千を抽出することによって可能となりますより高いSNRと高分解能でその場複雑な構造で決定するために、サブ断層像を位置合わせし、平均化し、元の断層像からの関心のある分野。これらの方法は、高分子集合体とネイティブ細胞環境での動的なコンフォメーションにさらに大きな洞察を提供するために、遺伝的アプローチと統合することができます。

一般的には、数十または数千のサブ断層像の何百もの高い決定するために平均化される必要がありますその場での -resolution構造。サブ断層像のこの大量生産するために必要なチルト系列の十分な数の取得が迅速にボトルネックとなります。その結果、チルトシリーズは、多くの場合、再構成の前に整列するようにチルトシリーズをもたらすために解決しなければならないビーム誘起シフト、ステージバックラッシュだけでなく、拡大、回転、スキュー欠陥の影響を受けています。チルトシリーズは、一般的に、伝統的にまだ別のボトルネックを引き起こし、チルトシリーズの検査によって手動で選択されている金基準マーカを、追跡することによって整列されます。多くのソフトウェアパッケージは^、コンピュータ制御の電子顕微鏡^{10を介して}自動化された傾斜シリーズ取得のために開発された^11,12、傾斜シリーズのアライメントおよび再建^13、14及びサブ断層像は^{、15-18を平均化}されています。これらのパッケージは、クライオETのワークフローの個別の操作を処理するように、システムAのプロセスに抽象度の高いを構築することが望ましくなりますtically単一のパイプラインに全体のスキームを効率化します。したがって、我々は集中的に各コンポーネントの完全な設定を維持しながら、簡単なユーザ操作を可能にする、単一の半自動化されたユニットにこれらのパッケージの数を整理するために設計されたソフトウェアのラッパー・ライブラリー」tomoauto」を開発しました。ライブラリは、オープンソースは、よくオンラインリモートソースコードリポジトリ（http://github.com/DustinMorado/tomoauto）によって開発やさらなる統合を合わせて、継続的に開発され、使用のために自由に利用できる、文書化されています。

この高スループットクライオETパイプラインは 、Sにおける無傷injectisomesを可視化するために利用されていますフレクスナーミニセル。 1917断層像の合計は、サブ断層像^{19を平均することによって}決定した細胞質ソーティングプラットフォームを含むインタクト機の現場構造における高分解能を明らかに、この方法を使用して生成されました。一緒に野生型およびMの分子モデリングとutantマシンは、当社の高スループットパイプラインは、ネイティブの細胞状況にそのままinjectisomeの構造と機能を理解するための新しい道を提供します。

プロトコル

1.ミニ細胞の準備

1. S.を作成するにはフレクスナーミニ細胞は、構成的にスペクチノマイシン耐性プラスミド5μlのエレクトロストレプトマイシン耐性血清型5aの（M90T-SM）、エレクトロポレーションによって細胞に低コピーから大腸菌細胞分裂遺伝子ftsQ、ftsA、とのFtsZを発現するプラスミドpBS58、1μlのを変換します1ミリメートルのキュベット中で5ミリ秒のために2.5 kVの時。
2. 1.5ミリリットル極低温マイクロチューブ中で15％グリセロール中で-80℃で保存するミニ細胞のサンプル。スペクチノマイシンとするとき使用するための準備ができて、ピペットチップを使用して解凍していないマイクロチューブからの細胞の約5μLをこすりし、4ミリリットル中に細胞を懸濁トリプシン大豆ブロスを、100μg/ mlの濃度に加えました。 37℃でO / Nを成長させます。
3. ピペット再び100μg/ mlの濃度になるように追加されたスペクチノマイシンと1.2 200ミリリットルにトリプシン大豆ブロスからの培養の2ミリリットル。後期対数期に37℃で成長します。
4. ミニセル、遠心分離機を豊かにします5分1,000×gで1.3からの培養の200ミリリットル。慎重に10分間20,000×gで新しい遠心チューブと遠心分離機に上清画分を注ぎます。慎重にオフ注ぎ、上清画分を廃棄し、静かにピペットチップを使用して残りの液体とペレットを混合し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブにペレット混合物の約100μlのを転送します。

2. EMグリッドの準備

1. スライドガラス上にR2 / 2穴あきカーボン膜200メッシュ銅グリッドの炭素側を上に置きます。
   注：R2 / 2 200メッシュのグリッドは、依然として試料を支持し、カメラの視野内に炭素膜の端部を配置しながら、単一のグリッド正方形で取得するように設定することができ、チルト系列の数を最大化するように選択されます所望の倍率で。細かいグリッドは、メッシュや、R1.2 / 1.3 400メッシュのような小さい穴あきカーボンフィルムは、より高い倍率で撮像されたサンプルのために使用することができます。このようR3.5のような大きな穴あき炭素膜/ 1 200メッシュを使用することができますサンプルについてのdは低倍率で撮像または顕微鏡写真は、R1のようなより大きな間隔を有する炭素エッジとホーリーカーボン膜を含むべきではない場合は、/ 4、200メッシュの関心領域にステージを揃えるから地域を保護を支援するために使用することができます露出オーバーのルーチンをフォーカス及びトラッキングインチ
2. グロー放電装置におけるプラットフォーム上でスライドを置きます。
   注：私たちは、陽極とプラットフォームは、真空デシケーター内に機械加工されており、高周波発生器によって供給されている社内のデバイスを使用しています。真空を作成した後、グリッドをグロー放電する1分間のプローブのアノードと電源に高周波発生器のプローブを接続します。グリッドをグロー放電に必要な時間は数秒から分の範囲とすることができます。グロー放電時間を変化させることのないガラス質氷で乾燥現れる検体濃度およびグリッドの問題を診断するために使用することができます。
3. ピンセットのセットでグリッドを削除し、鉗子が弾性Bで閉鎖ロックそして。
4. 1.4で製造したミニ細胞をマイクロ遠心チューブに10nmの金コロイド溶液100μlを加え、穏やかに指でチューブをフリックすることによって混合します。 2.2で製造したグリッド上の混合物の新しいピペット場所4μlの。
   注：金コロイドは、サイズやケアの様々な利用可能ですが不明瞭な機能には大きすぎるものではないが、金の大きさは、取得した倍率で処理される顕微鏡写真のピクセルサイズ与えられた5ピクセル以上であることに注意しなければなりません興味を持っている。
5. プランジ​​凍結装置を準備します。液体窒素で凍結外側の容器を満たす、次に液体エタンと内側室を埋めます。プランジ​​ャロッドにグリッドに鉗子を接続し、上昇位置にプランジャロッドをロックします。
   注：商業プランジ凍結装置の使用を記載するプロトコルにイアンクら ^20を参照してください。
6. 注意深くtに濾紙片に触れることによって、グリッドをブロット彼はその後すぐにグリッドを凍結、プランジャロッドを解放し、グリッドとろ紙分離して停止したろ紙上に吸い上げ間のメニスカスまでサンプルのドロップします。慎重にプランジャロッドから鉗子を除去し、グリッドホルダーにグリッドを配置します。
7. 液体窒素でローディングエリアと吸収ポンプ容器に充填することによりクライオEM転送ステーションを準備します。ローディングエリア一旦液体窒素温度の場所でグリッドホルダとローディングエリアにおける顕微鏡標本カートリッジです。
8. 慎重以前Polara顕微鏡以降のモデルでは、Cスタイルのクリップリング上の小さなネジ付きロックリングのいずれかであるロックリングを取り外します。鉗子を使用してカートリッジへのEMグリッドを配置し、静かにグリッドを確保カートリッジに戻ってロックリングを再接続します。
9. 顕微鏡からの複数の試料ホルダーを外し、搬送ステーションに接続します。カートリッジ鉗子使用してホルダーに試料カートリッジを置きますローディングエリアからホルダーを撤回し、顕微鏡に戻って、複数の試料ホルダーを転送dは。
   注：Chenら²¹ 2.1から2.9の詳細を視覚的プロトコルを参照してください。

3.ハイスループット自動チルトシリーズコレクション

1. 低倍率マップのコレクション
   1. SerialEM ¹⁰の「ナビゲータ」メニュー（http://bio3d.colorado.edu/SerialEM）の「開く」をクリックして、新しいNavigatorウィンドウを開きます。
   2. 許容可能な撮像条件が含まれているグリッドの正方形を探す（ すなわち、薄い氷、無汚染、関心の対象）は、低倍率で蛍光スクリーンを使用して（〜2,300Xミニ細胞標本用）。
      注：[ オプション：このステップは、グリッド全体をモンタージュによってSerialEMで自動化することができます、しかし、それは単に手動でいくつかの領域を選択するために、高速になります。]
   3. その後、調整し50℃に試料ホルダーを傾けることによってユーセントリックの高さにステージを調整しますステージのxy翻訳までZ高さは、傾斜と非傾斜ビュー間の最小です。
   4. グリッドの正方形の中央に移動し、現在のステージ位置を保存するためにナビゲータウィンドウで「追加ステージ順位」ボタンをクリックします。
   5. すべての許容可能なグリッドの正方形のステージ位置が保存されるまで、上記の手順3.1.1-4を続行します。
   6. 「ファイル」メニューの「新しいモンタージュ」をクリックして、新しいモンタージュMRCファイルを開きます。開くモンタージュ設定ダイアログでは、全グリッドの正方形（標準200メッシュグリッドのための例えば、10×10）を取得しますXとYにおけるピースの数を選択します。このような8の高ビニングを使用し、「画像をシフトさせる代わりにステージを移動して「ラジオボタン」の作品整列させるために使用相関スキップ」を選択します。
   7. ナビゲータウィンドウで最初のステージの位置をクリックして、「獲得」のチェックボックスをチェックして取得するように設定します。ナビゲータウィンドウの各ステージ位置のためにこれを繰り返します。
   8. ナビゲーターは、「ナビゲータ」メニューの「ポイントで取得」をクリックしてダイアログを取得開きます。 「獲得マップ画像」と「ラフeucentricity」チェックボックスをチェックし、他のすべてのチェックボックスがオフであることを確認してください。各ステージ位置でのモンタージュを収集するために、「進む」をクリックします。
2. チルトシリーズの取得
   1. ナビゲータウィンドウで獲得したマップのいずれかを選択し、「ロードマップ」ボタンをクリックします。
   2. ナビゲータウィンドウでチルトシリーズの取得をする時にマップ内のボタン「ポイントの追加」を選択しポイントをクリックします。その後、ボタン「ポイントの追加の停止」をクリックします。収集された各マップの繰り返し。
   3. カメラメニューで「パラメータ」を選択し、フォーカス、裁判、および録音モードのパラメータを定義します。 [ オプション：用量分画したデータは、記録モードのパラメータで指定することができます。]
   4. ナビゲータウィンドウでポイントを選択し、「チルトシリーズをチェック9;チェックボックスをオンにします。チルトシリーズのコレクションのために必要なパラメータを選択し開きチルトシリーズの設定]ダイアログウィンドウで。 Navigatorウィンドウで選択されたポイントの残りのために繰り返しますが、マップを選択しないでください。
   5. ナビゲーターメニューで再び「ポイントで取得」を選択します。ナビゲータでダイアログを取得選択し、オートフォーカス」を項目に再調整 ''と 'ラフeucentricityの予備的作業として、選択し「ときにすべての列を閉じるには「チルトシリーズの取得」プライマリタスクとして、および選択'末端に閉じる列バルブを点の収集されました。チルトシリーズを進むと、各マップの各ポイントで収集されます。

Tomoautoを使用4.ハイスループット自動チルトシリーズの処理と復興

1. 線量分画データでビーム誘起運動の補正[オプション]
   注：TomoautoがMOTIONCORR ^{22を使用しています} （http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.htミリリットル）、用量分画し顕微鏡写真からビーム誘起運動を削除します。 NOTIONCORR ^{16は、システム}にインストールする必要があります。
   1. オリジナルのチルトシリーズとSerialEM ¹⁰およびすべての現在の作業ディレクトリ内の個々の用量分画した画像から、出力ログ、端末内のコマンドを実行します。
      dose_fractioned_to_stack
      プロセスにチルト系列の名前です。
2. チルトシリーズのアライメント・復興
   注：デフォルトでTomoautoチルトシリーズの自動化基準モデル生成、配置、コントラスト伝達関数（CTF）、CTF補正^23、の決意を処理するために（http://bio3d.colorado.edu/imod/）IMOD ^{13を使用し、}再建。あるいは、ユーザーは、自動化された基準モデル生成、CTFのために（IMODに含まれる）RAPTOR ^{24を使用するには} tomoautoでオプションを持っていますCTFを決定するFIND4 ^{25（http://grigoriefflab.janelia.org/ctf）、}および再構成のためかによるソフトウェアパッケージの任意の組み合わせで^{（https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d）26} tomo3d設定。各パッケージで利用可能なこの構成だけでなく、パラメータは、ローカル設定ファイルは、特定の検体に使用する詳細パラメータ、コレクションに作成することができる一方で、最も一般的に研究室で使用される値に合わせて編集することができ、グローバルコンフィギュレーション・ファイルによって処理されますセットまたは個々のチルトシリーズ。使用することを希望するすべてのパッケージがシステムにインストールする必要があります。
   1. 現在の作業ディレクトリにチルトシリーズでは、ターミナルでコマンドを実行
      tomoauto --CTF --mode =揃える
      チルトシリーズが処理されるとはディアメですナノメートル単位の基準マーカーのター。このコマンドは、自動的にチルトシリーズのCTFを揃えると推定されます。これは、コマンドからの--CTFオプションを除去することによって、CTF処理をスキップすることが可能です。
   2. アライメント処理の任意の明白なエラーを視覚的に整列チルトシリーズを検査し、コマンドを実行することにより、推定CTFを調べます：
      3dmod <ファイル名> .ali
      submfg <ファイル名> _ctfplotter.com
      それぞれ、 ここで、< ファイル名>は接尾辞なしチルトシリーズの名前です。また、アライメント品質の定量的統計で整列によって生成された平均残留誤差を、見るためにtomoautoコマンドの出力を確認してください。
   3. 許容可能なアライメント与えられたコマンドを実行して処理を続行します：
      tomoau--CTF --mode =に 再構築
      4.2.1と同様に、ユーザ置換を伴います。このコマンドは、CTFを修正チルトシリーズの基準マーカーが消去され、再構築を計算します。ここでもCTF処理は4.2.1のように省略することができます。
   4. 目視検査手順をスキップし、完全にコマンドを実行し、処理し、再構築を自動化するには、[オプション]
      tomoauto --CTF
   5. [オプション]ローカル設定ファイルを生成する方法についてtomoautoのドキュメントを参照して、特定のローカル構成を使用して、コマンドを実行するには
      tomoauto [オプション] -L
      ここで、は、ローカルのconfの名前です。igurationファイル。

5.サブ断層アベレージ

注：我々は、サブ断層像の平均化実験を処理するために（http://www.electrontomography.org/）i3の^{パッケージ} 15 ^を使用し 、しかし、プロトコルは説明最も利用可能なサブ断層平均ソフトウェアpackages16toプロセスサブ断層像の平均化実験、一般的に適用され、しかし、このプロトコルは、ほとんどの利用可能なサブ断層の平均化ソフトウェアパッケージ^16-18に、一般的に適用される説明しました。

1. 現在の作業ディレクトリに復元された断層像でコマンドを実行することによって粒子ピッキングのための断層像を開きます：
   tomopick <ファイル名> .rec
   ここで、<ファイル名>は4.2.2のようになります。 injectisomeを選択し、tomograのスライスを通してリフには、上下矢印キーを使用して最初の基礎体温、その後、針の先端を上にクリックし、マウスの左ボタンを使用して表示されるウィンドウでメートル。このようにすべての可視injectisomesを選択します。これは、テキストフ​​ァイル内の座標は構造物の長軸を定義するだけでなく、構造体の向きを記述3オイラー角の2を推定格納します。
2. 計算上のコマンドを実行して定義された長軸の中点を中心とする断層像から400 ³ボクセルの立方体を抽出します。
   クリップサイズ変更-CX -cy -cz -ix 400 -iy 400 -iz 400
   <ファイル名> .rec <ファイル名> _001.mrc
   ここで、は、を、構造の中点座標があり、<ファイル名>は4.2.2のようになります。抽出された立方体の大きさは、構造によって変化すべきであると倍率が使用され、適切にこのサンプルの400 ³ボクセルで関心のある構造を、同封するのに十分な大きさでなければなりません。
3. ダウンサンプル（ビン）コマンドを実行することにより、初期位置合わせのための計算時間を削減する4倍サブ断層。
   binvol -b 4 <ファイル名> _001.mrc <ファイル名> _001.bin4.mrc
   ここで、<ファイル名>は5.2のようになります。
4. 決定オイラーサブ断層像に角度適用し、コマンドを実行することにより、初期テンプレートを生成するために世界の平均を計算します。
   I3totsum.sh
5. 合わせて、細胞質領域のバイナリ分類マスクを使用して、ダウンサンプリングされたサブ断層像を分類します。断層の特徴欠落しているウェッジアーティファクトを最小限にするために、フーリエ空間でサブ断層像の平均化を実行します。 4データをビニングするために、SAMPFACT = "4 4 4」を使用してください。
   i3mramsacls.sh
6. ダウンサンプリング係数2でサブ断層像を使って手順を繰り返し5.5（= SAMPFACT＆＃34; 2 2 2」）ともう一度、元のデータと（SAMPFACT = "1 1 1」）。
   i3mramsacls.sh

結果

ミニ細胞Sのサンプルフレクスナーを回収し、 図2に詳述され、パイプラインを使用して、次のtomoauto概略図を図1に示したように処理しました。 傾斜シリーズは、低倍率のモンタージュマップ上でユーザにより指定されたポイントでの高スループット傾斜シリーズ取得を可能SerialEM ^10（ 図3）を用...

ディスカッション

ここで説明するハイスループット法は、1917クライオチルトシリーズを処理し、そのままSの 4,500を超えるサブ断層像を生成することができましたフレクスナー injectisome ^19は、収集されたデータは、複雑なソート細胞質を含め、 その場 injectisome での詳細な特性評価につながりました。この方法はまた、injectisomeの選別プラットフォームの組成を解明す?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Tyrptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S0692
Electroporation Apparatus	Bio-rad	165-2100
1 mm Cuvette	BTX	45-0124
1.5 ml Cryogenic Tube	Thermoscientific	5000-1020
1.5 ml Microcentrifuge Tube	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey Carbon Grids	Quantifoil (Electron Microscopy Sciences)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
Glow Discharge Device	In-House		Commercial Alternative Available
Vacuum Desiccator	Sigma-Aldrich	Z119016	Used in In-House Glow Discharge Device
High-Frequency Generator	Electro-Technic Products	BD-10A	Used in In-House Glow Discharge Device.  CAUTION: This device generates high voltages.
Centrifuge
Forceps	Dumont (Electron Microscopy Sciences)	72705-D	Style 5 Anti-magnetic
Colliodal Gold	Aurion		BSA 10nm
Filter Paper	Whatman		#2
Ethane	Matheson Tri-Gas	UN1035
Nitrogen	Matheson Tri-Gas	UN1977
Plunger Device	In-House		Commercial Alternative Available
Cryogenic Grid Storage Box	Electron Microscopy Sciences	71166-30
Transmission Electron Microscope	FEI		Tecnai Polara F30 (300 KeV)
Direct Detection Device Camera	Gatan		K2 Summit
Tomogram Acquisiton Software	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography
Beam-induced Motion Correction Software	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU
Tilt-Series Alignment Software	IMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo
Automatic Fiducial Marker Modelling Software	IMOD		Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto)
CTF Determination Software	IMOD		Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto)
Tilt-Series Reconstruction Software	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo
Tilt-Series Automated Processing Software	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
Particle Picking Software	i3		http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD
Subvolume Averaging Software	i3		Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org