Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Özet

Biz, moleküler makinelerin yerinde yapılarında yüksek çözünürlük belirlemek için yüksek verimli cryo-elektron tomografisi yararlanmak için nasıl bir protokol mevcut. Protokol ortak darboğazları önler, büyük miktarda veri işlenecek izin verir ve kullanıcı önemli biyolojik sorulara odaklanmak için izin, kaynak çalışmama süresini azaltır.

Özet

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

Giriş

Tip III salgılama sistemleri (T3SS), birçok Gram-negatif patojenlere için gerekli hastalık oluşturma etkenleridir. Ayrıca, iğne kompleksi olarak bilinen injectisome, ökaryotik konakçı hücreler ^{1, 2} içine bakteri efektör protein doğrudan translokasyon için gerekli olan santral T3SS makinesidir. Injectisome hücre dışı bir iğne, bir taban gövde ve sitoplazmik bir kompleksi içerir, bilinen sıralama kompleks ³ olarak. Daha önceki çalışmalar, önemli bir bazal vücut proteinleri ^{4, 5} atom yapılarla birlikte, Salmonella ve Shigella saflaştırılmış injectisomes 3-D yapılar ortaya çıkarmıştır. Salmonella, Shigella ve Yersinia gelen injectisomes in situ yapıları son-ET kriyo ⁶ ile ortaya çıkarılmıştır ^{, 7.} Bununla birlikte, efektör seçimi ve iğne düzeneğinin için gerekli sitoplazmik kompleks, bu yapılarda görselleştirilmiştir edilmemiştir.

Cryo-ET mos olduğunu(in situ) doğal hücresel kapsamında nanometre çözünürlükte moleküler makineleri görüntüleme için uygun tekniği t. Bununla birlikte, kriyo-ET ile elde çözünürlük numune kalınlığı ile sınırlandırılmıştır. Dezavantajı aşmak için, genetik olarak cryo-ET için yeterince ince minicells üretmek için modifiye edilmiş bir öldürücü Shigella flexneri zorlanma sağlam injectisomes görüntülenmiş. Cryo-ET diğer kısıtlılığı çok hızlı bir şekilde numunede yüksek çözünürlüklü bilgi yok elektron demeti, tarafından uyarılan radyasyona örnek hassasiyetidir. Uygun bir doz, tam eğme serisi arasında dağıtılmasını ve böylece bir sonucu olarak, son derece düşük dozlar ayrı ayrı eğim görüntüler için kullanılır. Bu büyük ölçüde zor tomografisinde gürültü büyük miktarda konunun yapısal özelliklerini farklılaştırmak için hale getirir ve kriyo- elde edilebilir çözünürlüğü sınırlar son yeniden sinyal-gürültü oranı (SNR), düşürür ET. ConventiBöyle Fourier ve gerçek uzay filtreleri olarak yanı sıra örnekleme aşağı Önal görüntü işleme kontrastı artırmak için kullanılan, ancak yüksek çözünürlüklü bilgilerin çoğunu filtreleyerek pahasına yapılabilir. Son zamanlarda, bir alt tomogram ortalama mümkün ölçüde SNR artırmak ve alt nanometre seviyelerinin ^{8, 9,} bazı durumlarda, daha sonra nihai çözünürlük yaptı. Kompleksleri daha ayrıntılı bir analizi, mümkün olmaktadır hesaplama ihtiva eden alt-tomografi binlerce ekstraksiyonuyla hizalayarak ve alt tomogram ortalama özgün tomografi ve ilgi alanları daha SNR ve daha yüksek çözünürlüğe sahip yerinde kompleks yapılara belirlemek için. Bu yöntemler makromoleküler meclisleri ve yerel hücresel bağlamda dinamik konformasyonlarına ilgili daha ayrıntılı bilgi sağlamak için genetik yaklaşımlar ile entegre edilebilir.

Genel olarak, on ya da bin alt tomografi hatta yüzlerce yüksek belirlemek için ortalama gerekenin situ -resolution yapılar. Tilt-serisi yeterli sayıda edinimi alt tomogram bu sayıda hızlı bir darboğaz haline üretmek için gerekli. Elde edilen eğim serisi genellikle yeniden önce hizaya tilt-serisi getirmek için çözülmesi gereken ışın kaynaklı kayma, sahne tepki yanı sıra büyütme, rotasyon ve çarpık kusurları, etkilenir. Tilt serisi genellikle başka darboğaz neden geleneksel el tilt-serisinin denetim yoluyla seçilen izleme altın referans belirteçler, tarafından hizalanmış. Birçok yazılım paketleri ^{11, 12,} tilt serisi uyum ve yeniden ^{13, 14} ve alt tomogram ^15-18 ortalama bilgisayar kontrollü elektron mikroskopları ^{10 aracılığıyla} otomatik eğim serisi edinimi için geliştirilmiştir. Bu paketler cryo-ET iş akışında ayrı operasyonlar ele gibi, Systema'nın sürecin içine daha yüksek bir soyutlama düzeyini oluşturmak için arzu olurola- rak tek bir boru hattı içine tüm düzeni düzene. Bu nedenle, biz merkezi bir şekilde her bir bileşenin tam yapılandırmasını korurken basit kullanıcı işlemi için izin veren bir tek yarı otomatik birimine bu paketlerin bir dizi düzenlemek için tasarlanmış "tomoauto" bir yazılım sarıcı kütüphane geliştirdi. Kütüphane bir online uzaktan kaynak kod depo (http://github.com/DustinMorado/tomoauto) vasıtasıyla açık kaynak, kuyu, belgelenmiş sürekli geliştirilen ve kullanıma serbestçe kullanılabilir, özel kalkınma ya da daha fazla bütünleşmesidir.

Bu yüksek verimli cryo-ET boru S. sağlam injectisomes görselleştirmek için kullanılmıştır flexneri minicells. 1917 tomografi toplam alt tomogram ¹⁹ ortalaması alınarak saptanması sitoplazmik sıralama platformu içeren sağlam makinenin in situ yapısında yüksek çözünürlük göstererek, bu yöntem kullanılarak elde edilmiştir. Birlikte yabani tip ve m moleküler modelleme ileutant makineleri, bizim yüksek verimli boru hattı doğal hücresel bağlamda bozulmamış injectisome yapısını ve işlevini anlamak için yeni bir yol sağlar.

Protokol

1. Minicell Hazırlık

1. S. yapmak flexneri minicells, yapısal olarak spektinomisin dayanıklı plazmid, 5 | il elektro Streptomisin dayanıklı serotip 5a (M90T-Sm) elektroporasyon ile hücrelere düşük kopya Escherichia coli hücre bölünmesi genleri ftsQ, ftsA ve ftsZ ifade plazmidi pBS58, 1 ul dönüşümü 1 mm küvetler 5 ms için 2.5 kV.
2. 1.5 ml kriyojenik mikrotüp% 15 gliserol içinde -80 ° C'de mağazanın Minicell örnekleri. Kullanılmak üzere, 4 ml hücreleri bir pipet kullanarak unthawed mikrotüpünden hücrelerin yaklaşık 5 ul kazıyın ve askıya hazır olduğunda spectinomycin ile triptik soy broth / ml konsantrasyonu 100 ug ekledi. 37 ° C 'de O / N büyütün.
3. Pipet daha 100 ug / ml konsantrasyonlara eklenmiştir spectinomycin 1.2 200 içine mi triptik soya suyu kültür 2 mi. Eski kütük fazı 37 ° C'de büyür.
4. Minicells, santrifüj zenginleştirmek5 dakika boyunca 1000 x g'de 1.3 ile kültür 200 mi. Dikkatle 10 dakika boyunca 20.000 x g'de yeni bir santrifüj tüpüne ve santrifüj içine süpernatan fraksiyonu dökün. Dikkatlice dökün ve süpernatan fraksiyonu atmak ve hafifçe bir pipet kullanılarak geri kalan sıvı ile pelet karıştırın ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne topak karışımı, yaklaşık olarak 100 ul aktarma.

2. EM Izgara Hazırlık

1. Bir bardak slayt R2 / 2 holey karbon film 200 örgü bakır ızgara karbon tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
   NOT: R2 / 2 200 ızgaralı hala numune desteklemek ve kamera alanında karbon film kenarına yerleştirerek, tek bir ızgara meydanında elde etmek için ayarlanabilir eğim-serisi sayısını arttırmak için seçilir İstediğiniz büyütme. Daha ince ağlar ızgaraları ve R1.2 gibi daha küçük Delikli C film / 1,3 400 gözenekli yüksek büyütmede görüntülü örnekler için de kullanılabilir; Böyle R3.5 gibi büyük holey karbon filmler / 1 200 örgü kullanmak olabilirörnekleri d düşük büyütmede görüntülü ya mikrografı örneğin R1 ile daha büyük bir mesafe ile C-kenar ve Delikli C filmleri içermez gerekir / 4 200 gözenekli ilgi alanına aşamasını hizalayarak ve gelen alanların korunması ile yardım için kullanılabilir aşırı maruz kalma rutinleri odaklama ve izleme.
2. Bir kızdırma deşarj cihazında platformda slayt yerleştirin.
   NOT: bir anod ve platform, bir vakum desikatörde içine makine ile işlenir ve yüksek frekanslı bir jeneratör tarafından güçlendirilmiş olan bir içi cihazı kullanın. Bir vakum oluşturduktan sonra, ızgara taburcu kızdırma 1 dakika süreyle prob üzerindeki anot ve güç yüksek frekans jeneratörü probu takın. Gerekli zaman ızgara bir dakika için birkaç saniye arasında olabilir deşarj kızdırma. Kızdırma deşarj süresi değişen numune konsantrasyonu ve hiçbir vitreus buz ile kuru görünen ızgaraları ile ilgili sorunları teşhis etmek için kullanılabilir.
3. Forseps bir dizi ile ızgara kaldırın ve forseps elastik b kapalı kilitve.
4. 1.4 hazırlanan minicells ile mikrosantrifüj tüp 10 nm koloidal altın çözeltisinin 100 ul ekleyin ve hafifçe parmağınızla tüp hafifçe vurarak karıştırın. 2.2 hazırlanan ızgara üzerine karışımın yeni pipet yer 4 ul.
   Not: kolloidal altın boyutları ve bakım çeşitli mevcuttur altın büyüklüğü, elde edilen büyütülmüş işlenecek mikrograflar piksel boyutu göz önüne alındığında daha büyük 5 piksel olduğuna dikkat edilmelidir belirsiz özellikler için çok büyük olmamakla birlikte ilgi.
5. Dalma-friz aparatı hazırlayın; sıvı nitrojen ile dış donma kabın doldurulması ve daha sonra sıvı etan iç bölmeyi doldurun. Dalgıç çubuğa ızgara ile forseps takın ve yükseltilmiş pozisyona piston çubuğunu kilitleyin.
   NOT: Daha Iancu ve ark ²⁰ ticari bir dalma-donma cihazının kullanımını anlatan bir protokol için..
6. Dikkatli t filtre kağıdı bir parçasına dokunarak ızgara Bloto da hemen ızgara dondurma, dalgıç çubuk bırakın, ızgara ve filtre kağıdı ayrıldığı ve durur filtre kağıdı üzerinde esneklik arasındaki menisküs kadar örnek bırakın. Dikkatle dalgıç çubuk forseps çıkarın ve ızgara tutucu içine ızgara yerleştirin.
7. Sıvı azot ile yükleme alanı ve emme pompası kabı doldurarak cryo-EM transfer istasyonu hazırlayın. Yükleme alanı grid tutucu ve yükleme alanında bir mikroskop numune kartuş sıvı azot sıcaklığı yerinde olduğunu bir kez.
8. Dikkatle önceki Polara mikroskopları veya sonraki modellerde bir C tarzı klip halkası üzerinde küçük bir yivli kilit halkası ya olan kilit halkasını, kaldırmak; forseps kullanarak kartuş içine EM ızgara yerleştirin ve yavaşça ızgara güvence kartuş üzerine geri kilit halkasını takın.
9. Mikroskop birden numune tutucu çıkarın ve aktarma istasyonuna takın. Kartuş forseps bir kullanarak tutucu içine numune kartuşunu yerleştirinyükleme alanından tutucu geri ve mikroskop geri çoklu numune tutucu transferi d.
   NOT: Chen ve diğ. ²¹ 2.1-2.9 ayrıntılı görsel protokol için bkz.

3. Yüksek verim Otomatik Tilt-serisi Koleksiyonu

1. Düşük büyütme Haritalar Koleksiyonu
   1. SerialEM ¹⁰ 'Navigator' menüsünden 'Aç' tıklayarak yeni Navigator penceresi açın (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
   2. Kabul edilebilir görüntüleme koşulları içermesi ızgara kareler bul (yani, ince buz, hiçbir kirlilik, ilgi konusu), düşük büyütme floresan ekranı kullanarak (~ 2,300X Minicell numune için).
      NOT: [Opsiyonel:. Bu adım, tüm ızgara montaging tarafından SerialEM ile otomatik hale getirilebilir, ancak sadece elle birkaç alanları seçmek için daha hızlı olabilir]
   3. Daha sonra ayarlamak 50 ° numune tutucu eğerek eucentric yüksekliğe ayarlayın sahnesahnenin xy çeviri kadar z-boy eğik ve untilted görünümler arasında düzeydedir.
   4. Izgara meydanın ortasına taşıyın ve Gelinen aşamada pozisyonunu saklamak için Navigator penceresinde 'Ekle Sahne Pos' düğmesine tıklayın.
   5. Tüm kabul edilebilir ızgara kareler sahne pozisyonları kaydedildi kadar yukarıdaki adımları 3.1.1-4 devam edin.
   6. 'Dosya' menüsünden 'Yeni montaj' tıklayarak yeni montaj MRC dosyasını açın. Açılır Montaj Kurulum Dialog, tüm ızgara kare (standart 200 meş ızgara örneğin, 10 x 10) kazanacaklardır X ve Y parçalarının bir numara seçin. 'Yerine Görüntü Kaydırma ve Sahne Taşı' ve radyo düğmeleri "parçalar hizalamak için kullanılan korelasyonlar atla '8 gibi yüksek bir binning kullanın ve seçin.
   7. Navigator penceresinde ilk aşama konumunu tıklayın ve 'Edinme' onay kutusunu işaretleyerek elde edilecek ayarlayın. Navigator penceresinde her aşamasında pozisyon için bu işlemi tekrarlayın.
   8. Navigator 'Navigator' menüsünden 'Noktalarında Edinme' tıklayarak Dialog Edinme açın. 'Edinme harita görüntüsünü' ve 'Kaba eucentricity' onay kutusunu işaretleyin ve diğer tüm onay kutularını işaretli olduğundan emin olun. Her aşama pozisyonunda bir montaj toplamak için 'Devam' düğmesini tıklayın.
2. Tilt-serisi Edinme
   1. Navigator penceresinde edinilen haritalardan birini seçin ve 'Load haritası' düğmesine tıklayın.
   2. Navigator penceresinde bir tilt serisi elde etmek için hangi harita düğmesini 'Puanları Ekle' seçeneğini noktaları tıklatın. Ardından düğmeye 'Puanları ekleme Dur' tıklayın. Toplanan her harita için tekrarlayın.
   3. Kamera menüsünde 'parametreleri' seçin ve Odak, Deneme ve Kayıt modları için parametreleri tanımlayın. [Opsiyonel:. Veri Kayıt modu için parametreleri belirtilebilir Doz fraksiyone]
   4. Navigator penceresinde bir nokta seçin ve 'Tilt-Serisi kontrol9; onay kutusunu işaretleyin. Parametrelerini seçmek açılır Tilt-Serisi Ayarı iletişim penceresinde tilt serisi koleksiyonu için istenen. Navigator penceresinde seçilen noktaların geri kalanı için yineleyin, ancak haritalar seçmeyin.
   5. Navigator menüsünde yine 'Noktalarında Edinme' seçeneğini seçin. Navigator iletişim seçmek 'öğeye yeniden hizalayın' Otofokus 've' Kaba eucentricity Edinme 'Ön görevler gibi, ve' tilt serisi Edinme 'Birincil görev olarak, ve' zaman tüm sütunu kapatmak için 'ucunda Kapat kolon vanaları Puan toplanmıştır. Bir tilt serisi geçmeden üzerine her haritada her noktada tahsil edilecektir.

4. Yüksek verim Otomatik Tilt-serisi İşleme ve İmar Tomoauto kullanma

1. Doz-fraksiyone verilerin Işın kaynaklı Hareket Düzeltme [isteğe bağlı]
   NOT: Tomoauto MOTIONCORR ²² (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.ht kullanırml) doz fraksiyone mikrografiklerinden ışın kaynaklı hareket kaldırın. NOTIONCORR ¹⁶ sisteminizde yüklü olması gerekmektedir.
   1. Komutu çalıştırmak bir terminal orijinal tilt-serisi, geçerli çalışma dizini SerialEM ¹⁰ den çıktı günlüğüne ve bireysel doz fraksiyonlara görüntüler tüm With:
      dose_fractioned_to_stack
      işlemek için tilt-serisinin adıdır.
2. Tilt-serisi Uyum ve İmar
   NOT: Varsayılan olarak Tomoauto tilt serisi otomatik referans modeli oluşturma, hizalama, kontrast transfer fonksiyonu (CTF), CTF-düzeltme ²³ belirlenmesini işlemek için (http://bio3d.colorado.edu/imod/) iMod ¹³ kullanır ve rekonstrüksiyon. Alternatif kullanıcıların otomatik referans modeli nesil, CTF için (iMod dahil) RAPTOR ^{24 kullanımı} tomoauto seçeneği varFIND4 ²⁵ (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) CTF belirlemek ve tomo3d ²⁶ (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) yeniden inşası için veya yazılım paketleri herhangi bir kombinasyonu tarafından yapılandırması. Her pakette mevcuttur Bu yapılandırma yanı sıra parametreler yerel yapılandırma dosyaları da belirli bir numune için kullanılan detay parametreleri, toplama oluşturulabilir ise en yaygın bir laboratuarda kullanılan değerleri uygun düzenlenebilir Global bir yapılandırma dosyası tarafından ele alınır ayarlamak veya bireysel tilt serisi. Kullanılacak isteyen tüm paketler sisteminizde yüklü olması gerekmektedir.
   1. Geçerli çalışma dizininde tilt-serisi ile, bir terminalde komutu çalıştırmak
      tomoauto --CTF --mode = hizalamak
      işlenecek eğim-serisi ve diame olduğununanometre fiducial belirteçlerin ter. Bu komut hizalamak ve otomatik eğim serisi CTF tahmin eder. Bu komut --CTF seçeneği kaldırarak CTF işleme atlamak mümkündür.
   2. Hizalama işleme herhangi göze batan hataları görsel hizalanmış tilt-serisi kontrol edin ve komutlarla tahmin CTF inceleyin:
      3dmod .ali
      submfg _ctfplotter.com
      sırasıyla burada eki olmadan tilt-serisinin adıdır. Ayrıca hizalama kalitesinin kantitatif istatistik uyum, tarafından üretilen ortalama kalıntı hatayı görmek için tomoauto komutunun çıktısını kontrol edin.
   3. Kabul edilebilir bir hizalama Verilen komutu çalıştırarak işleme devam edin:
      tomoauiçin --CTF --mode = yeniden Yapılandırma
      4.2.1'deki aynı kullanıcı ikameleri ile. Bu komut, CTF düzeltmek tilt-serisi fiducial işaretleri silmek ve yeniden hesaplamak. Yine CTF işleme 4.2.1 gibi atlanabilir.
   4. [isteğe bağlı] görsel denetim adımı atlayın ve tamamen işleme ve yeniden komutu yürütmek otomatikleştirmek için
      tomoauto --CTF
   5. [isteğe bağlı] bir yerel yapılandırma dosyası oluşturmak için nasıl tomoauto belgelerine bakın Belirli bir yerel yapılandırmasını kullanın ve sonra komutu çalıştırmak için
      tomoauto [seçenekler] -L
      burada yerel conf adıdıriguration dosyası.

5. Alt tomogram Ortalaması

NOT: ¹⁵ (http://www.electrontomography.org/) alt tomogram ortalama deneyleri işlemek için, ancak protokol açıklanan i3 paketini kullanmak en uygun alt tomogram ortalama yazılımı packages16to süreci alt tomogram ortalama deneyler genellikle geçerlidir, Ancak protokol çoğu mevcut alt tomogram ortalama yazılım paketleri ^16-18 genellikle geçerlidir nitelendirdi.

1. Geçerli çalışma dizininde yeniden tomografi ile komutu çalıştırarak parçacık toplama için tomogram açmak:
   tomopick REC
   4.2.2 gibidir. Bir injectisome seçin ve tomogra dilimleri ile riff için yukarı ve aşağı ok tuşlarını kullanmak için öncelikle bazal vücut ve ardından iğne ucu tıklayın sol fare düğmesini kullanın Açılan penceredem. Bu şekilde tüm görünür injectisomes seçin. Bu yapının uzun ekseni tanımlayan yanı sıra üç Euler iki yapının yönünü anlatan açıları tahmin bir metin dosyasında koordinatları saklar.
2. Hesaplama extract komutunu yürüterek tanımlanan uzun ekseninin orta noktası merkezli tomografi 400 ³ voksel küpleri:
   klibi yeniden boyutlandırmak Cx -cy -CZ -ix 400 -iy 400 -IZ 400
   REC _001.mrc
   Burada , , yapının orta koordinatları ve 4.2.2 gibidir. Ekstre küp boyutu yapısı ve kullanılan büyütme göre değişebilir gerektiğini ve yeterince bu örnek için 400 ³ vokselden olan ilgi yapısını içine kadar büyük olmalıdır.
3. Aşağı numune (bin) komutu yürüterek ilk hizalama için hesaplama süresini azaltmak için dört bir faktör tarafından alt tomogram:
   binvol -b 4 _001.mrc _001.bin4.mrc
   5.2 olduğu gibi.
4. Belirlenen Euler alt tomogram için açıları uygulayın ve komutu yürüterek ilk şablonu üretmek için küresel ortalama hesaplamak.
   I3totsum.sh
5. Hizalayın ve sitoplazmik alan ikili bir sınıflandırma maskesi kullanarak aşağı örneklenmiş alt tomogram sınıflandırır. Tomografi karakteristik eksik kama eserler en aza indirmek için Fourier uzayında alt tomogram ortalamasının gerçekleştirin. 4 veri binning için SAMPFACT = "4 4 4" kullanın lütfen.
   i3mramsacls.sh
6. Adımı yineleyin 5.5 kullanıyorsanız alt tomografi iki (SAMPFACT = & çarpanı ile aşağı-örneklenmiş# 34; 2 2 2 ") ve bir kez daha orijinal veri ile (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
   i3mramsacls.sh

Sonuçlar

Minicells S. numuneleri flexneri toplandı ve Şekil 2'de ayrıntılı olarak boru hattı, aşağıdaki tomoauto kullanılarak şeması, Şekil 1 'de gösterdiği gibi işlenmiştir. Tilt-serisi düşük büyütmeli montaj haritalar üzerinde kullanıcı tarafından belirlenen noktalarda yüksek verimlilik tilt serisi edinimi için izin veren SerialEM ^10, (Şekil 3)...

Tartışmalar

Burada açıklanan yüksek verim yöntemi 1917 cryo tilt-serisi işlemek ve bozulmamış S. 4500 üzerinde alt tomogram üretmek için etkin flexneri ¹⁹ injectisome. Toplanan veriler kompleksi sıralama sitoplazmik dahil in situ injectisome içinde detaylı karakterizasyonu, yol açtı. Yöntem ayrıca injectisome sıralama platformun bileşimi aydınlatmak yardımcı varsayılan protein bileşenlerinin belirli bir silinmesi, birkaç mutant hücreleri görselleşti...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Tyrptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S0692
Electroporation Apparatus	Bio-rad	165-2100
1 mm Cuvette	BTX	45-0124
1.5 ml Cryogenic Tube	Thermoscientific	5000-1020
1.5 ml Microcentrifuge Tube	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey Carbon Grids	Quantifoil (Electron Microscopy Sciences)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
Glow Discharge Device	In-House		Commercial Alternative Available
Vacuum Desiccator	Sigma-Aldrich	Z119016	Used in In-House Glow Discharge Device
High-Frequency Generator	Electro-Technic Products	BD-10A	Used in In-House Glow Discharge Device.  CAUTION: This device generates high voltages.
Centrifuge
Forceps	Dumont (Electron Microscopy Sciences)	72705-D	Style 5 Anti-magnetic
Colliodal Gold	Aurion		BSA 10nm
Filter Paper	Whatman		#2
Ethane	Matheson Tri-Gas	UN1035
Nitrogen	Matheson Tri-Gas	UN1977
Plunger Device	In-House		Commercial Alternative Available
Cryogenic Grid Storage Box	Electron Microscopy Sciences	71166-30
Transmission Electron Microscope	FEI		Tecnai Polara F30 (300 KeV)
Direct Detection Device Camera	Gatan		K2 Summit
Tomogram Acquisiton Software	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography
Beam-induced Motion Correction Software	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU
Tilt-Series Alignment Software	IMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo
Automatic Fiducial Marker Modelling Software	IMOD		Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto)
CTF Determination Software	IMOD		Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto)
Tilt-Series Reconstruction Software	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo
Tilt-Series Automated Processing Software	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
Particle Picking Software	i3		http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD
Subvolume Averaging Software	i3		Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org