Использование Tomoauto: протокол для высокой пропускной автоматизированной Cryo-электронной томографии

Резюме

Мы представляем протокол о том, как использовать высокой пропускной крио-электронной томографии для определения высокого разрешения в точке, структур молекулярных машин. Протокол позволяет большие объемы данных, подлежащих обработке, избегает общих узких мест и сокращает время простоя ресурсов, позволяя пользователю сосредоточиться на важных биологических вопросов.

Аннотация

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

Введение

Тип III секреции системы (T3SS) являются важнейшими факторами, определяющими вирулентность для многих грамотрицательных микроорганизмов. Injectisome, также известный как иглы комплекса, является центральным T3SS машина требуется для прямого транслокации эффекторных белков из бактерий в эукариотических клетках-хозяевах ^{1, 2.} Injectisome включает внеклеточный иглу, базальный тело, и цитоплазматический комплекс также известен как сортировочного комплекса ^3. Предыдущие исследования выяснены 3-D структуры очищенных injectisomes из Salmonella и Shigella, наряду с атомными структурами крупных базальных белков в организме ^{4, 5.} Последние в точке структур injectisomes из Salmonella, Shigella, и Yersinia выявлены крио-ЭТ ^{6 , 7.} Тем не менее, цитоплазматический комплекс, необходимый для выбора эффекторной и узла иглы, не визуализируются в этих структурах.

Крио-ЕТ МОПт подходящую методику для визуализации молекулярные машины в нанометровым разрешением в пределах своей родной сотовой связи (на месте). Тем не менее, достижимое разрешение от крио-ЭТ ограничивается толщины образца. Чтобы преодолеть недостаток, мы отображаемого нетронутыми injectisomes в опасной Shigella Флекснера штамм, который был генетически модифицированных производить минипосылок достаточно тонкие для крио-ЭТ. Другим ограничением крио-ЭТ является чувствительность образца к радиации, вызванной электронным пучком, который разрушает очень быстро информацию с высоким разрешением в образце. В результате чрезвычайно низкие дозы используются для отдельных наклона-изображений, так что подходящая доза может быть распределена среди полного наклона серии. Это значительно снижает отношение сигнал-шум (SNR) в конечном реконструкции, которая делает его трудно отличить структурные особенности предмета, от большого количества шума в томограмме и ограничивает разрешение, которое может быть достигнуто путем крио ET. CONVENTIнальных обработки изображений, такие как Фурье и в реальном пространстве фильтров, а также вниз выборки могут быть использованы для увеличения контраста, но за счет фильтрации большей части информации с высокой разрешающей способностью. Недавно, к югу от томограмма усреднения позволили значительно увеличить SNR, а затем окончательное решение, в некоторых случаях до уровня суб-нанометровых ^{8, 9.} Более детальный анализ комплексов стало возможным благодаря вычислительно извлечения тысячи суб-томограмм, содержащих в областях, представляющих интерес с оригинальными томограмм и затем выравнивая и среднем суб-томограммы, чтобы определить, в точке сложных структур с высокой SNR и высоким разрешением. Эти методы могут быть интегрированы с генетическими подходов, чтобы обеспечить еще большую способность проникновения в суть высокомолекулярных агрегатов и их динамических конформаций в родном сотовой связи.

В общем, десятки или даже сотни тысяч суб-томограмм должны быть в среднем для того, чтобы определить высокий-Разрешение структуры на месте. Приобретение достаточного количества наклона серии, необходимой для производства этого большое количество суб-томограмм быстро становится узким местом. В результате наклона серии часто страдают от лучевой индуцированных сдвигом, ступени зазора, а также увеличения, вращения и косых дефектов, которые должны быть решены, чтобы принести наклона рядов в соответствие до реконструкции. Серия наклона, как правило, выравнивается отслеживания золотых координатных меток, которые традиционно выбранных вручную через инспекции наклона серии, вызывающих еще один узкое место. Многие программные пакеты были разработаны для автоматизированной приобретения наклона серии через компьютерным управлением электронных микроскопов ^{10, 11, 12,} выравнивание наклона серии и реконструкция ^{13, 14 и} суб-томограмма усреднения ^15-18. Как эти пакеты обработки дискретных операций в рабочий процесс крио-ЭТ, становится желательно построить более высокий уровень абстракции в процессе к SYSTEMAски упорядочить всю схему в одном трубопроводе. Таким образом, мы разработали программное библиотеку оболочки "tomoauto", предназначенный для организации ряда этих пакетов в одной полуавтоматической блока, что позволяет простой операции пользователя, сохраняя полную конфигурацию каждого компонента в централизованном порядке. Библиотека с открытым исходным кодом, хорошо документированы, постоянно развивается и свободно доступны для использования, с учетом развития или дальнейшая интеграция с помощью онлайн-хранилище удаленного источника кода (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).

Эта высокая пропускная крио-ЭТ трубопровод был использован для визуализации нетронутыми injectisomes в S. Флекснера минипосылки. В общей сложности 1,917 томограмм были получены с использованием этого метода, выявление высокого разрешения в структуре месте интактного машины включая цитоплазматической сортировки платформы определяется суб-томограмма усреднения ^19. Вместе с молекулярного моделирования дикого типа и мutant машины, наша высокой пропускной трубопровод обеспечивает новые возможности для понимания структуры и функции неповрежденной injectisome в родном сотовой связи.

протокол

1. Подготовка Minicell

1. Для того, чтобы S. Флекснера минипосылки, преобразования 1 мкл плазмиды pBS58, которые конструктивно выражает гены деление кишечная палочка клеток ftsQ, ftsA и FtsZ от низкого копии спектиномицин устойчивостью плазмиды в 5 мкл Электрокомпетентные стрептомицинустойчивых серотип 5а (M90T-Sm) клеток путем электропорации 2,5 кВ в течение 5 мс в 1 мм кювет.
2. Храните образцы Minicell при -80 ° С в 15% глицерине в 1,5 мл микропробирок. Криогенной Готовое, очистить приблизительно 5 мкл клеток от unthawed микропробирок с помощью пипетки и суспендирования клеток в 4 мл трипсином соевый бульон с спектиномицином добавлены 100 мкг / мл концентрации. Выращивают O / N при 37 ° С.
3. Пипетка 2 мл культуры из 1,2 в 200 мл трипсинового соевого бульона с спектиномицином снова добавляли к 100 мкг / мл концентрации. Выращивают при температуре 37 ° С до поздней лог-фазы.
4. Для обогащения минипосылок, центрифуги200 мл культуры с 1,3 в 1000 мкг в течение 5 мин. Осторожно залить фракции супернатанта в новую центрифужную пробирку и центрифугируют при 20000 х г в течение 10 мин. Тщательно слейте и отбросить фракцию супернатанта, а осторожно перемешать осадок с оставшейся жидкости с использованием пипетки и передачи приблизительно 100 мкл гранул смеси до 1,5 мл микроцентрифужных трубки.

2. М. Сетка Подготовка

1. Поставьте R2 / 2 дырявый углеродная пленка 200-сетка Медная сетка углерода стороной вверх на стекле.
   Примечание: а R2 / 2 200-меш сетки выбран чтобы максимизировать количество наклона серии, которые могут быть установлены, чтобы приобрести в одном квадрате сетки в то же время поддерживая образец и размещение край углеродной пленки в области камеры при желаемой увеличением. Более мелкие сетки сетки и меньшие дырявые углеродных пленок, таких как R1.2 / 1,3 400 меш могут быть использованы для образцов отображаемого при большем увеличении; крупные дырявые углерода такие фильмы, как R3.5 / 1 200-сетка может быть использованиеd для образцов отображаемого на низком увеличении, или если микрофотография не должны содержать край углерода и дырчатые углеродные пленки с большей расстояния, такие как R1 / 4 200 меш может быть использован, чтобы помочь с выравнивание этап к интересующей области и защиты области от чрезмерного воздействия в фокусировки и трекинга процедуры.
2. Поместите слайд на платформе в тлеющего разряда устройства.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовать устройство в доме, в котором анод и платформа была механической обработке в вакуумном эксикаторе и питается от генератора высокой частоты. После создания вакуума, приложите зонд высокочастотный генератор к аноду и власти на зонде в течение 1 мин, чтобы тлеющего разряда сетки. Время, необходимое для тлеющего разряда сетки может варьироваться от нескольких секунд до минуты. Изменение времени тлеющего разряда может быть использован для диагностики проблем с концентрацией образца и сеток, которые появляются сухой не стекловидного льда.
3. Удалить сетку с набором щипцов и зафиксировать щипцы закрыты эластичным ба также.
4. Добавить 100 мкл 10 нм коллоидного раствора золота в микроцентрифужных трубки с минипосылок, подготовленной в 1,4 и перемешать аккуратно стряхивая трубку с пальцем. С новым пипетки место 4 мкл смеси на сетке, полученной в 2.2.
   Примечание: Коллоидный золота доступен в различных размеров и следует соблюдать осторожность, чтобы размер золота больше, чем 5 пикселей, учитывая размер пиксела микрофотографий, подлежащие обработке в приобретенной увеличением, не будучи слишком большим, чтобы скрыть особенности представляет интерес.
5. Подготовка окунуться заморозки аппарат; заполнить внешний контейнер замораживания с жидким азотом, а затем заполнить внутреннюю камеру с жидким этана. Прикрепите щипцы с решеткой на штока поршня и зафиксировать стержень поршня в поднятом положении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: См Янку др ²⁰ для протокола, описывающей использование коммерческого аппарата окунуться заморозки..
6. Пятно сетку тщательно касаясь кусок фильтровальной бумаги Тон не упасть образца до мениска между сеткой и фильтровальной бумаги отделяет и впитывающее на фильтровальной бумаге останавливается, то немедленно освободить стержень поршня, замораживание сетку. Осторожно снимите пинцетом из поршневого штока и поместите сетку в держатель сетки.
7. Подготовка крио-ЭМ передачи станции, заполнив зоне погрузки и поглощения насоса контейнер с жидким азотом. После того, как загрузка площадь в жидком месте при температуре жидкого азота держатель сетки и микроскоп образец картридж в зоне погрузки.
8. Осторожно снимите стопорное кольцо, которое либо небольшой резьбовое стопорное кольцо на ранних микроскопов Polara или клипа кольца С-стиля на более поздних моделях; разместить сетку EM в картридж с помощью щипцов, а затем аккуратно прикрепить стопорное кольцо обратно на картридже крепит сетку.
9. Снимите несколько держатель образца с микроскопом и приложите его к передаточной станции. Поместите образец картридж в держатель картриджа с использованием щипцовD убрать держатель из зоны загрузки и передачи несколько держатель образца обратно в микроскоп.
   ПРИМЕЧАНИЕ: См Чен и др ²¹ для визуального детализации протокола 2.1-2.9..

3. Высокая пропускная способность Автоматизированная наклона серии Коллекция

1. Коллекция Низкий увеличений Карты
   1. Откройте новое окно Navigator, нажав "Открыть" в меню "Навигатор" в SerialEM ¹⁰ (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
   2. Найти сетки квадратов, которые содержат приемлемые условия обработки изображений (т.е., тонкий лед, нет загрязнения, предметом интереса) с помощью флуоресцентного экрана на низком увеличении (~ 2,300X для Minicell образца).
      ПРИМЕЧАНИЕ: [Дополнительно:. Этот шаг может быть автоматизирован с помощью SerialEM montaging всю сетку, однако это может быть быстрее просто выбрать несколько областей вручную]
   3. Отрегулируйте этап в eucentric высоты при наклоне держателя образца до 50 ° а затем настроитьZ-высота до ху перевода этапе минимальна между наклонными и Untilted видом.
   4. Переместить в центре квадрата сетки и нажмите кнопку "Добавить этап POS 'кнопку в окне Navigator, чтобы сохранить текущее положение ступени.
   5. Продолжить шаги 3.1.1-4 выше, пока все приемлемые этап сетки квадратов позиции не были сохранены.
   6. Откройте новый файл монтаж MRC, нажав «Новый монтаж» в меню "Файл". В Setup Montage Диалог, который открывается, выберите количество штук в X и Y, которые будут приобретать все сетки площадь (например, 10 х 10 для стандартного сетки 200 меш). Используйте высокую биннинга такой как 8 и выберите "Переместить Стадия Вместо Сдвиг изображения" и "Пропустить корреляции, используемые для выравнивания куски" радио-кнопки.
   7. В окне Navigator щелкните первую позицию ступени и установить его на быть приобретены путем проверки "Acquire" флажок. Повторите эту процедуру для каждой позиции этап в окне Навигатора,
   8. Откройте Навигатор приобрести диалог, нажав "Приобретать в точках 'в меню' Навигатор '. Проверьте 'Acquire изображение карты' и '' Грубый eucentricity флажок и убедитесь, что все остальные флажки сняты,. Нажмите кнопку "Продолжить", чтобы собрать монтаж на каждой позиции стадии.
2. Приобретение наклона серии
   1. В окне Navigator выберите одну из приобретенных карт и нажмите кнопку "Загрузить карту».
   2. В окне Navigator нажмите "Добавить Points" кнопку и выберите пункты на карте, в которой на приобретение наклона рядов. Затем нажмите кнопку "Стоп" Добавление Points кнопку. Повторите для каждой карты, собранной.
   3. В меню камеры выберите "Параметры" и определить параметры для режимов фокусировки, судебных и запись. [Дополнительно:. Доза на фракции данные могут быть указаны в параметрах для режима записи]
   4. Выберите точку в окне Navigator и проверить 'Tilt-Series9; флажок. В диалоговом окне Настройка Tilt-Series, что открывшемся меню выберите параметры, желательные для сбора наклона серии. Повторите для остальных выбранных точек в окне Navigator, но не выбрать карты.
   5. В меню Navigator снова выберите "приобрести в точках. В навигаторе приобрести диалоговое выберите "Выровняйте пункту", Автофокус "и" Rough eucentricity "как предварительные задач, и выберите пункт" Приобретать наклона серии "в качестве основной задачи, и выберите" Закрыть столбцов клапаны в конце ", чтобы закрыть столбец, когда все точек были собраны. По исходя наклона рядов будут собраны в каждой точке каждой карте.

4. Высокая пропускная Автоматизированная наклона серии Обработка и реконструкция Использование Tomoauto

1. Коррекция Луч-индуцированного движения в доза-фракционированных данных [необязательно]
   ПРИМЕЧАНИЕ: Tomoauto использует MOTIONCORR ^{22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.ht~~HEAD=dobj}мл), чтобы удалить движение луча, вызванного из доз на фракции микрофотографии. NOTIONCORR ¹⁶ должен быть установлен в системе.
   1. С оригинальной наклона серии, выходной журнале от ¹⁰ SerialEM и отдельных доз фракционированы изображений всех в текущем рабочем каталоге, в терминале выполнить команду:
      dose_fractioned_to_stack
      это имя наклона серии, чтобы обработать.
2. Выравнивание и реконструкция Tilt-серии
   ПРИМЕЧАНИЕ: Tomoauto по умолчанию использует ИМУ ¹³ (http://bio3d.colorado.edu/imod/) для обработки наклона серии автоматической генерации доверительное модели, выравнивание, определение функции передачи контраста (CTF), CTF-коррекция ^23, и реконструкция. В качестве альтернативы пользователи имеют возможность в tomoauto использовать RAPTOR ²⁴ (входит в УПМ) для автоматизированного фидуциального поколения модели, CTFFIND4 ²⁵ (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf), чтобы определить CTF, и tomo3d ²⁶ (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) для реконструкции или в любой комбинации программных пакетов по Конфигурация. Эта конфигурация, а также параметры, доступные в каждой упаковке обрабатывается глобальном файле конфигурации, которые могут быть отредактированы, чтобы удовлетворить значения наиболее часто используемых в лаборатории в то время как локальные файлы конфигурации также могут быть созданы для параметров подробно, используемых для конкретного экземпляра, сбор установить или индивидуального наклона серии. Все пакеты, которые желают использовать должен быть установлен в системе.
   1. С наклона серии в текущем рабочем каталоге, в терминале выполнить команду
      tomoauto --CTF --mode = выравнивание
      является наклон серии должны быть обработаны и является диатер исходных точек маркеров в нанометрах. Эта команда будет выровнять и оценить CTF из наклона серии автоматически. Можно пропустить обработку CTF путем удаления --CTF опцию из команды.
   2. Осмотрите выровненный наклона рядов визуально каких-либо вопиющих ошибок в обработке выравнивания и проверить расчетную CTF, выполнив команды:
      3dmod <имя файла> .ali
      submfg <имя файла> _ctfplotter.com
      соответственно, где <имя файла> является именем наклона серии без суффикса. Кроме того, проверьте вывод команды tomoauto, чтобы увидеть среднюю остаточную ошибку, порожденную выравнивания, которая является количественной статистики качества выравнивания.
   3. Учитывая приемлемым выравнивание приступить обработку, выполнив команду:
      tomoauчтобы --CTF --mode = реконструировать
      с теми же заменами пользователей, как и в 4.2.1. Эта команда будет исправить CTF, стереть координатных маркеров от наклона серии и вычислить реконструкции. Опять CTF обработки может быть пропущен, как в 4.2.1.
   4. [опционально] Для пропуска визуальный осмотр и шаг полностью автоматизировать обработку и реконструкция выполнить команду
      tomoauto --CTF
   5. [опционально] Для использования конкретного локальную конфигурацию, обратитесь к документации по tomoauto как генерировать локальный файл конфигурации, а затем выполнить команду
      tomoauto [опции] -L <> fid_diam
      где это имя местного конфiguration файл.

5. Суб-томограмма усреднения

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем i3 пакет ¹⁵ (http://www.electrontomography.org/) для обработки суб-томограмма усреднения эксперименты, однако, описанный протокол применяется в основном к наиболее доступным суб-томограмме экспериментов процесс усреднения программное обеспечение packages16to суб-томограмма усреднения, Однако протокол, описанный относится в основном к наиболее доступным суб-томограмме усреднение программных пакетов ^16-18.

1. С реконструированного томограммы в текущем рабочем каталоге открыть томограмму для сбора частиц, выполнив команду:
   tomopick <имя файла> .rec
   где <имя файла> как в 4.2.2. В открывшемся окне используйте левую кнопку мыши, чтобы нажать на первый базальный тело, а затем кончик иглы, чтобы выбрать injectisome и использовать стрелки вверх и вниз клавиши для-рифф через срезов tomograм. Выберите все видимые injectisomes в этой манере. Это сохраняет координаты в текстовом файле, определяющие продольную ось структуры, а также оценивающие два из трех углов Эйлера, описывающая ориентацию структуры.
2. В вычислительном экстракт 400 ³ воксельных кубики из томограммы с центром в средней точке, определенной длинной оси, выполнив команду:
   клип изменения размера -CX <х> -CY -cz <г> -ix 400 -iy 400 -iz 400
   <имя файла> .rec <имя файла> _001.mrc
   где <х>, <у>, <г> являются средняя точка координаты структуры и <имя файла> как в 4.2.2. Размер извлеченного куба должна варьироваться в зависимости от структуры и увеличении используемого, и должно быть достаточно большим, чтобы надлежащим образом заключить интересующую структуру, которая в данном примере составляет 400 ³ вокселов.
3. Вниз выборки (BIN) суб-томограмма по четыре раза сократить время вычислений для начальной синхронизации, выполнив команду:
   binvol -b 4 <имя файла> _001.mrc <имя файла> _001.bin4.mrc
   где <имя файла> как в 5.2.
4. Применить определяется углами Эйлера для суб-томограмм и вычислить средний мировой производить начальную шаблон, выполнив команду.
   I3totsum.sh
5. Выравнивание и классифицировать вниз, отобранных суб-томограммы с помощью двоичного классификации маску цитоплазматической области. Выполните суб-томограмма усреднения в пространстве Фурье, чтобы минимизировать недостающие клин артефакты, характерные томографии. Для биннинга 4 данные, пожалуйста, используйте SAMPFACT = "4 4 4".
   i3mramsacls.sh
6. Повторите шаг 5,5, используя суб-томограммы с пониженной частотой дискретизации с коэффициентом два (SAMPFACT = &# 34; 2 2 2 ") и еще раз с исходными данными (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
   i3mramsacls.sh

Результаты

Образцы минипосылок S. Флекснера были собраны и обработаны, как показано на схематическом рисунке 1, используя следующие tomoauto трубопровода, изображенной на рисунке 2. Tilt-серии были собраны с помощью SerialEM ^10, что позволяет ?...

Обсуждение

Метод высокой пропускной описано здесь позволило нам обрабатывать 1,917 крио наклона рядов и производят более 4500 суб-томограммы неповрежденной S. Флекснера injectisome ^19. Собранные данные привели к подробной характеристике в месте injectisome, в том числе цитоплазматических со...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Tyrptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S0692
Electroporation Apparatus	Bio-rad	165-2100
1 mm Cuvette	BTX	45-0124
1.5 ml Cryogenic Tube	Thermoscientific	5000-1020
1.5 ml Microcentrifuge Tube	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey Carbon Grids	Quantifoil (Electron Microscopy Sciences)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
Glow Discharge Device	In-House		Commercial Alternative Available
Vacuum Desiccator	Sigma-Aldrich	Z119016	Used in In-House Glow Discharge Device
High-Frequency Generator	Electro-Technic Products	BD-10A	Used in In-House Glow Discharge Device.  CAUTION: This device generates high voltages.
Centrifuge
Forceps	Dumont (Electron Microscopy Sciences)	72705-D	Style 5 Anti-magnetic
Colliodal Gold	Aurion		BSA 10nm
Filter Paper	Whatman		#2
Ethane	Matheson Tri-Gas	UN1035
Nitrogen	Matheson Tri-Gas	UN1977
Plunger Device	In-House		Commercial Alternative Available
Cryogenic Grid Storage Box	Electron Microscopy Sciences	71166-30
Transmission Electron Microscope	FEI		Tecnai Polara F30 (300 KeV)
Direct Detection Device Camera	Gatan		K2 Summit
Tomogram Acquisiton Software	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography
Beam-induced Motion Correction Software	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU
Tilt-Series Alignment Software	IMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo
Automatic Fiducial Marker Modelling Software	IMOD		Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto)
CTF Determination Software	IMOD		Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto)
Tilt-Series Reconstruction Software	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo
Tilt-Series Automated Processing Software	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
Particle Picking Software	i3		http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD
Subvolume Averaging Software	i3		Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org