Usando Tomoauto: Um Protocolo de métodos de alta capacidade automatizada Cryo-Electron Tomografia

Resumo

Nós apresentamos um protocolo sobre como utilizar de alto rendimento tomografia crio-eletrônica para determinar alta resolução em estruturas in situ de máquinas moleculares. O protocolo permite que grandes quantidades de dados a serem processados, evita gargalos comuns e reduz o tempo de inatividade de recursos, permitindo que o usuário se concentrar em questões biológicas importantes.

Resumo

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

Introdução

Tipo III sistemas de secreção (T3SS) são determinantes de virulência essenciais para muitos patógenos gram-negativas. O injectisome, também conhecido como o complexo de agulha, é a máquina central de T3SS necessária para a translocação directa de proteínas efectoras a partir da bactéria em células hospedeiras eucarióticas ^{1, 2.} A injectisome compreende uma agulha extracelular, uma basal do corpo, e um complexo citoplasmático também conhecida como o complexo de triagem ^3. Estudos anteriores elucidado estruturas 3-D de injectisomes purificadas de Salmonella e Shigella, juntamente com as estruturas atômicas de grandes proteínas do corpo basais ^{4, 5.} Recentes em estruturas in situ de injectisomes de Salmonella, Shigella, e Yersinia foram revelados por crio-ET ^{6 , 7.} No entanto, o complexo citoplasmático, essencial para a selecção efectora e conjunto de agulha, não foi visualizado nessas estruturas.

Cryo-ET é o most técnica adequada para a imagiologia maquinaria molecular na resolução nanometros no seu contexto celular natural (in situ). No entanto, a resolução alcançável por crio-ET é limitado pela espessura da amostra. Para superar o problema, nós fotografada injectisomes intactas em um Shigella flexneri estirpe virulenta que foi geneticamente modificada para produzir minic�ulas finas o suficiente para crio-ET. Outra limitação de crio-ET representa a sensibilidade da amostra para a radiação induzida pelo feixe de electrões, que destrói muito rapidamente a informação de alta resolução na amostra. Como resultado, doses extremamente baixas são utilizados para a inclinação-imagens individuais de modo a que uma dose adequada pode ser distribuído entre a série completa de inclinação. Isto reduz grandemente a proporção de sinal-para-ruído (SNR) na reconstrução final, o que o torna difícil de diferenciar as características estruturais de objecto a partir da grande quantidade de ruído na tomografia e que limita a resolução pode ser conseguida por cryo- ET. Conventional de processamento de imagem tais como Fourier e filtros no espaço real, bem como para baixo de amostragem pode ser utilizado para aumentar o contraste, mas à custa de filtrar a maior parte da informação de alta-resolução. Recentemente, sub-Tomogram média tornou possível aumentar grandemente o SNR e, subsequentemente, a solução final em alguns casos, para níveis sub-nanômetros ^{8, 9.} Uma análise mais detalhada de complexos é possível graças computacionalmente extrair milhares de sub-tomogramas contendo as áreas de interesse dos tomograms originais e, em seguida, alinhando e em média os sub-tomograms para determinar em estruturas complexas in situ com maior SNR e maior resolução. Estes métodos podem ser integrados com abordagens genéticas para fornecer ainda maiores insights sobre montagens macromoleculares e suas conformações dinâmicas no contexto celular nativa.

Em geral, dezenas ou mesmo centenas de milhar de sub-tomogramas precisa ser calculada a média, a fim de determinar alta-Resolução estruturas in situ. A aquisição de um número suficiente de inclinação-série necessária para produzir este grande número de sub-tomogramas rapidamente se torna um gargalo. A série de inclinação resultante são frequentemente afectados pela mudança induzida por feixe, fase folga, bem como ampliação, rotação e defeitos de inclinação, o que deve ser resolvido para trazer a inclinação-alinhamento em série antes da reconstrução. A série de inclinação é tipicamente alinhados por rastreamento marcadores fiduciais de ouro, que tradicionalmente são selecionados manualmente através de inspeção da série tilt, causando ainda um outro gargalo. Muitos pacotes de software têm sido desenvolvidos para aquisição tilt-série automatizada através controlados por computador microscópios eletrônicos de ^{10, 11, 12,} alinhamento tilt-série e reconstrução ^{13, 14 e} sub-tomogram média de ^15-18. Como lidar com estes pacotes operações discretas no fluxo de trabalho de crio-ET, torna-se desejável para construir um nível maior de abstração no processo para systematicamente agilizar todo o esquema em um único pipeline. Por isso, desenvolvemos uma biblioteca wrapper software "tomoauto" projetado para organizar um número destes pacotes em uma única unidade semi-automatizado, permitindo a operação de usuário simples, mantendo a configuração completa de cada componente de forma centralizada. A biblioteca é open-source, bem documentado, continuamente desenvolvido e disponível gratuitamente para uso, desenvolvimento adaptado ou uma maior integração por meio de uma linha fonte remota de código repositório (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).

Este high-throughput crio-ET oleoduto tem sido utilizada para visualizar injectisomes intactos Em S. minic�ulas flexneri. Um total de 1,917 tomogramas foram gerados utilizando este método, revelando uma alta resolução em estrutura situ da máquina intacto, incluindo a plataforma de triagem citoplasmática determinado pelo sub-Tomogram média de ^19. Juntamente com modelação molecular de tipo selvagem e mutant máquinas, a tubagem de alto rendimento fornece um novo caminho para compreender a estrutura e função da injectisome intacta no contexto celular nativo.

Protocolo

1. Preparação Minicell

1. Para fazer com que S. minic�ulas flexneri, transformar 1 ml de plasmídeo pBS58, o que expressa constitutivamente genes divisão celular Escherichia coli ftsQ, FTSA, e FtsZ a partir de um baixo-cópia espectinomicina resistente plasmídeo em 5 jul electrocompetentes Estreptomicina resistente 5a sorotipo (M90T-Sm) células por eletroporação a 2,5 kV para 5 ms em cuvetes de 1 mm.
2. Armazenar minic�ula amostras a -80 ° C em glicerol a 15% em 1,5 ml de um microtubo criogénico. Quando pronto para uso, raspar aproximadamente 5 jul de células a partir do microtubo unthawed utilizando uma ponta de pipeta e suspender as células em 4 ml de caldo de soja tríptico com espectinomicina adicionado a 100 ug / ml de concentração. Cresça O / N a 37 ° C.
3. Pipetar 2 ml da cultura de caldo de soja 1.2 em 200 ml tríptico com espectinomicina novamente adicionados a concentrações de 100 ug / ml. Crescer a 37 ° C até à fase log tardia.
4. Para enriquecer minic�ulas, centrífuga200 ml da cultura a partir de 1,3 a 1000 xg durante 5 min. Verter cuidadosamente a fracção de sobrenadante para um novo tubo de centrífuga e centrifuga-se a 20.000 xg durante 10 min. Verter cuidadosamente e descartar a fracção de sobrenadante, e agitar suavemente o sedimento com o líquido remanescente utilizando uma ponta de pipeta e transferir cerca de 100 uL da mistura de sedimento para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.

2. EM grade Preparação

1. Coloque um lado filme de carbono de 200 mesh malha de cobre de carbono R2 / 2 holey-se em uma lâmina de vidro.
   NOTA: A / 2 grade de malha 200 R2 é seleccionado para maximizar o número de inclinação da série que pode ser configurado para adquirir num quadrado de grade, enquanto ainda apoiar o espécime e colocando o bordo do filme de carbono no campo da câmara com a ampliação desejada. Redes de malha mais fina e mais pequenos filmes de carbono, tais como furados R1.2 / 1.3 400 de malha podem ser usados ​​para amostras fotografado de maior ampliação; maiores filmes de carbono holey como R3.5 / 1 200-mesh podem ser utilizadosd para amostras fotografada com menor ampliação ou se a micrografia não deve conter a borda de carbono e filmes furados de carbono com um espaçamento maior, tal como R 1/4 de malha 200 pode ser utilizada para auxiliar no alinhamento do palco para a área de interesse e proteger as áreas de sobre-exposição em foco e monitoramento rotinas.
2. Coloque o slide na plataforma em um dispositivo de descarga luminescente.
   NOTA: Usamos um dispositivo interno no qual um ânodo e plataforma foi maquinada num exsicador de vácuo e é alimentado por um gerador de alta frequência. Depois de criar um vácuo, anexar a sonda gerador de alta frequência para o ânodo e ligue a sonda de 1 min a brilhar descarregar a grade. O tempo necessário para a descarga luminescente da grelha pode variar de alguns segundos a um minuto. Variando o tempo de descarga luminescente pode ser utilizado para diagnosticar problemas com a concentração de amostra e grades que aparecem com gelo seco vítreo.
3. Retire a grelha com um conjunto de pinças, e travar as pinças fechado com um elástico be.
4. Adicionar 100 ul de 10 nm solução coloidal de ouro para o tubo de microcentrífuga com as minic�ulas preparadas em 1.4 e misture suavemente flicking o tubo com um dedo. Com um novo lugar pipeta 4 ul da mistura da grelha preparado em 2.2.
   NOTA: O ouro coloidal está disponível numa variedade de tamanhos e deve ser tomado cuidado de que o tamanho do ouro é maior do que 5 pixels determinado o tamanho do pixel de as micrografias a serem processados ​​com a ampliação adquirida, apesar de não ser demasiado grande para características obscuras de interesse.
5. Prepara-se o aparelho de êmbolo mergulhador de congelamento; encher o recipiente de congelamento exterior com nitrogênio líquido e, em seguida, encher a câmara interna com etano líquido. Fixar a pinça com a rede à haste de êmbolo e bloquear a haste do êmbolo para a posição elevada.
   NOTA: Ver lancu et al ^{20 para} um protocolo descrevendo o uso de um aparelho de imersão por congelação comerciais..
6. Blot a grade cuidadosamente tocando numa peça de papel de filtro para tele gota de amostra até o menisco entre a grade e de papel de filtro se separa e a absorção no papel de filtro pára, em seguida, libertar imediatamente a haste de êmbolo, o congelamento da grade. Cuidadosamente remover a pinça a partir da haste do êmbolo e colocar a grelha para um suporte de grelha.
7. Prepare a estação de transferência de crio-EM, enchendo o recipiente bomba área de carga e absorção com nitrogênio líquido. Uma vez que a área de carga é a temperatura do azoto líquido lugar o suporte da grelha e um cartucho de espécime microscópio na zona de carga.
8. Retire cuidadosamente o anel de bloqueio, isto é, um pequeno anel de fecho roscado em microscópios Polara anteriores ou um anel de clip-estilo C em modelos posteriores; coloque a grelha EM dentro do cartucho usando uma pinça e volte suavemente o anel de trava de volta para o cartucho de garantir a grade.
9. Remova o suporte de amostra múltipla do microscópio e anexá-lo para a estação de transferência. Coloque o cartucho de amostra no suporte usando uma pinça de cartucho de umd retrair o suporte da área de carga e transferir o suporte de amostra múltipla de volta para o microscópio.
   NOTA: Ver Chen et al ^{21 para} um protocolo visuais detalhando 2,1-2,9..

3. alta taxa de transferência Collection-série Tilt automatizada

1. Coleção de baixa ampliação Mapas
   1. Abra uma nova janela Navigator, clicando em 'Abrir' no menu 'Navigator' de SerialEM ¹⁰ (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
   2. Encontre quadrículas que contêm as condições de obtenção de imagens aceitáveis ​​(isto é, gelo fino, sem contaminação, assunto de interesse) utilizando a tela fluorescente em baixa ampliação (~ 2,300X para o espécime minic�ula).
      NOTA: [Opcional:. Este passo pode ser automatizado com SerialEM por montaging toda a grade, no entanto, pode ser mais rápido do que simplesmente selecionar algumas áreas manualmente]
   3. Ajuste o estágio de altura eucentric inclinando o suporte da amostra a 50 ° e ajustez-altura até que a tradução xy do palco é mínima entre os pontos de vista inclinados e não inclinado.
   4. Mover-se para o centro da praça grade e clique no botão "Adicionar Stage Pos 'na janela Navegador para armazenar a posição atual estágio.
   5. Continue passos 3.1.1-4 acima até todas as posições de estágio quadrículas aceitáveis ​​foram salvas.
   6. Abra um novo arquivo de montagem MRC, clicando em 'New montage' no menu 'File'. No Setup Montagem de diálogo que se abre, selecione um número de peças em X e Y que irá adquirir a totalidade do quadrado da grade (por exemplo, 10 x 10 para uma grade de malha 200 standard). Use uma alta binning como 8 e selecione a opção 'Mover Stage Em vez de deslocamento da imagem' e 'Ir correlações utilizadas para alinhar peças' botões de rádio.
   7. Na janela Navegador, clique na primeira posição palco e configurá-lo para ser adquirido por verificando a caixa de seleção 'Acquire'. Repita esse procedimento para cada posição estágio na janela Navegador.
   8. Abra o Navegador Adquirir diálogo clicando em "Adquirir em Pontos" no menu 'Navigator'. Verifique a "imagem mapa Acquire 'e caixa de seleção" eucentricity áspero' e certifique-se que todas as outras caixas de seleção estão desmarcadas. Clique em 'Continuar' para coletar uma montagem em cada posição palco.
2. Tilt-série Acquisition
   1. Na janela Navegador, selecione um dos mapas adquiridos e clique no botão 'Load mapa'.
   2. Na janela Navegador, clique em "Adicionar Points 'botão e selecionar pontos no mapa em que adquirir uma série de inclinação. Em seguida, clique no botão "Parar de adicionar Points 'botão. Repita o procedimento para cada mapa recolhidos.
   3. No menu Câmara selecionar 'Parâmetros' e definir os parâmetros para os modos de foco, experimentação, e Record. [Opcional:. Dose-fracionada dados podem ser especificados em parâmetros para o modo Record]
   4. Selecione um ponto na janela Navigator e verifique o "Tilt-Series9; caixa de seleção. Na janela de diálogo Setup Tilt-Series que se abre, selecione os parâmetros desejados para a recolha tilt-série. Repita o procedimento para o resto dos pontos selecionados na janela do navegador, mas não selecionar os mapas.
   5. No menu Navigator novamente selecione a opção "Adquirir nos Pontos '. No Navigator Adquirir diálogo escolher "realinhar o item ', focagem automática' e 'eucentricity áspera", como tarefas preliminares, e selecione' Adquirir série tilt 'como a principal tarefa, e selecione' Feche as válvulas de colunas no final 'para fechar a coluna, quando tudo dos pontos foram recolhidos. Após proceder uma série de inclinação serão coletados em cada ponto em cada mapa.

4. alta taxa de transferência da série Tilt automatizadas de processamento e Reconstrução Usando Tomoauto

1. Correcção de Movimento induzida-Beam em dados de dose-fracionada [opcional]
   NOTA: Tomoauto usa MOTIONCORR ^{22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.ht}ml) para remover o movimento induzido por feixe de micrografias fraccionou-dose. NOTIONCORR ¹⁶ deve ser instalado no sistema.
   1. Com a série de inclinação original, o registro de saída do SerialEM ^{10 e} as imagens individuais de doses fraccionadas todos no diretório de trabalho atual, em um terminal execute o comando:
      dose_fractioned_to_stack
      é o nome da série de inclinação para processar.
2. Alinhamento e Reconstrução de Tilt-série
   NOTA: Tomoauto por padrão usa IMOD ¹³ (http://bio3d.colorado.edu/imod/) para lidar com tilt-série automatizado de geração do modelo fiducial, o alinhamento, a determinação da função de transferência de contraste (CTF), CTF-correção ^{23, e} reconstrução. Alternativamente os usuários têm a opção de usar em tomoauto RAPTOR ²⁴ (incluído no IMOD) para a geração de modelo fiducial automatizado, CTFFIND4 ^{25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf)} para determinar o CTF, e tomo3d ^{26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d)} para a reconstrução ou em qualquer combinação de pacotes de software por configuração. Esta configuração, bem como os parâmetros disponíveis em cada pacote é tratado por um arquivo de configuração global que pode ser editado para se adequar os valores mais comumente utilizados em um laboratório enquanto os arquivos de configuração locais também podem ser criados para parâmetros detalhe usado para uma amostra específica, coleção definir ou tilt-série individual. Todos os pacotes que deseja utilizar deve ser instalado no sistema.
   1. Com a série de inclinação no diretório de trabalho atual, em um terminal de executar o comando
      tomoauto --CTF --mode = align
      é a série de inclinação para ser processado e é o Diameter um dos marcadores de referência no nanômetros. Este comando irá alinhar e estimar o CTF da série tilt automaticamente. É possível ignorar o processamento CTF removendo a opção --CTF do comando.
   2. Inspecione a série de inclinação alinhado visualmente por quaisquer erros gritantes no processamento de alinhamento e fiscalizar a CTF estimado por executar os comandos:
      3dmod .ali
      submfg _ctfplotter.com
      respectivamente, onde é o nome da série tilt sem sufixo. Também verificar a saída do comando tomoauto ver o erro residual significativo gerado pelo alinhamento, que é uma estatística quantitativa da qualidade do alinhamento.
   3. Dado um alinhamento aceitável proceder processamento executando o comando:
      tomoaupara --CTF --mode = reconstruir
      com as mesmas substituições de usuário como em 4.2.1. Este comando irá corrigir o CTF, apagar os marcadores fiduciais da série tilt e calcular a reconstrução. Novamente processamento CTF pode ser ignorada como em 4.2.1.
   4. [opcional] Para pular a etapa de inspeção visual e automatizar completamente o processamento e reconstrução executar o comando
      tomoauto --CTF
   5. [opcional] Para usar uma configuração local específico, consulte a documentação tomoauto sobre como gerar um arquivo de configuração local, e em seguida, executar o comando
      tomoauto [opções] -L
      onde é o nome do local, configuration arquivo.

5. Sub-tomogram Média

NOTA: Nós usamos o pacote i3 ¹⁵ (http://www.electrontomography.org/) para processar experiências de média sub-tomogram, no entanto, o protocolo descrito aplica-se geralmente a maioria disponível sub-tomogram experimentos processo packages16to software da média sub-tomogram de média, no entanto, o protocolo descrito aplica-se geralmente a maioria disponível sub-tomogram pacotes de software de média ^16-18.

1. Com o tomogram reconstruída no diretório de trabalho atual abrir o tomogram por partículas picking executando o comando:
   tomopick .rec
   onde é como em 4.2.2. Na janela que se abre usar o botão esquerdo do mouse para clicar sobre o primeiro corpo basal e, em seguida, a ponta da agulha para selecionar um injectisome e usar a seta teclas para cima e para baixo para riff através das fatias do tomogram. Selecione todas as injectisomes visíveis dessa maneira. Este armazena as coordenadas de um ficheiro de texto que definem o eixo do comprimento da estrutura, bem como a estimativa de dois dos três ângulos de Euler que descreve a orientação da estrutura.
2. Extracto computacionalmente 400 ³ cubos de voxel da tomografia centrado no ponto médio do eixo longitudinal definido pela execução do comando:
   grampo redimensionamento Cx -Cy -CZ -ix 400 -iy 400 -iz 400
   .rec _001.mrc
   onde , , as coordenadas do ponto médio da estrutura e é como em 4.2.2. O tamanho do cubo extraído deve variar de acordo com a estrutura e a ampliação usada, e deve ser suficientemente grande para envolver adequadamente a estrutura de interesse, que para este exemplo é de 400 ³ voxels.
3. Baixo-amostra (compartimento) do sub-tomograma por um factor de quatro para reduzir o tempo de computação para o alinhamento inicial, executando o comando:
   binvol -b 4 _001.mrc _001.bin4.mrc
   onde é como em 5.2.
4. Aplique a determinados ângulos de Euler de sub-tomograms e calcular a média global para produzir o modelo inicial executando o comando.
   I3totsum.sh
5. Alinhe e classificar-se-amostradas sub-tomograms usando uma máscara binária classificação da área citoplasmática. Executar sub-tomogram média no espaço Fourier para minimizar os artefatos desaparecidos cunha característicos da tomografia. Para binning 4 de dados, utilize o SAMPFACT = "4 4 4".
   i3mramsacls.sh
6. Repita o passo 5,5 utilizando sub-amostradas tomograms-down por um fator de dois (SAMPFACT = &# 34; 2 2 2 ") e mais uma vez com os dados originais (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
   i3mramsacls.sh

Resultados

Amostras de S. minic�ulas flexneri foram coletadas e processadas conforme mostrado na Figura 1 esquema usando tomoauto seguindo o gasoduto detalhado na Figura 2. Tilt-série foram coletados por meio SerialEM ^10, que permite a aquisição de alto rendimento tilt-série em pontos designados pelo utilizador em mapas de montagem de baixa ampliação (Figura 3). As microgra...

Discussão

O método de alto rendimento descrito aqui nos permitiu processar 1.917 crio tilt-série e produzir mais de 4.500 sub-tomograms do S. intacta flexneri injectisome ^19. Os dados recolhidos conduziu à caracterização detalhada de injectisome em situ, incluindo o complexo citoplasmático triagem. O método também foi utilizado para visualizar várias células mutantes com deleção específica de componentes de proteína putativos, o que ajudou a elucidar a composição da p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Tyrptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S0692
Electroporation Apparatus	Bio-rad	165-2100
1 mm Cuvette	BTX	45-0124
1.5 ml Cryogenic Tube	Thermoscientific	5000-1020
1.5 ml Microcentrifuge Tube	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey Carbon Grids	Quantifoil (Electron Microscopy Sciences)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
Glow Discharge Device	In-House		Commercial Alternative Available
Vacuum Desiccator	Sigma-Aldrich	Z119016	Used in In-House Glow Discharge Device
High-Frequency Generator	Electro-Technic Products	BD-10A	Used in In-House Glow Discharge Device.  CAUTION: This device generates high voltages.
Centrifuge
Forceps	Dumont (Electron Microscopy Sciences)	72705-D	Style 5 Anti-magnetic
Colliodal Gold	Aurion		BSA 10nm
Filter Paper	Whatman		#2
Ethane	Matheson Tri-Gas	UN1035
Nitrogen	Matheson Tri-Gas	UN1977
Plunger Device	In-House		Commercial Alternative Available
Cryogenic Grid Storage Box	Electron Microscopy Sciences	71166-30
Transmission Electron Microscope	FEI		Tecnai Polara F30 (300 KeV)
Direct Detection Device Camera	Gatan		K2 Summit
Tomogram Acquisiton Software	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography
Beam-induced Motion Correction Software	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU
Tilt-Series Alignment Software	IMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo
Automatic Fiducial Marker Modelling Software	IMOD		Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto)
CTF Determination Software	IMOD		Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto)
Tilt-Series Reconstruction Software	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo
Tilt-Series Automated Processing Software	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
Particle Picking Software	i3		http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD
Subvolume Averaging Software	i3		Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org