סינתזה של משולב זהב Nanoparticle תמונה המגיבים ליפוזומים ומדידה של microbubble Cavitation שלהם על עירור לייזר דופק

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטת הכנה פשוטה עבור ננו-חלקיקים מזהב משולב ליפוזומים צילום מגיבים עם חומרים זמינים מסחרית. הוא גם מראה כיצד למדוד את תהליך cavitation microbubble של ליפוזומים מסונתז על טיפול של לייזר פעמו.

Abstract

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

Introduction

האפשרות להפעיל שחרור התרופה באמצעות גירויים חיצוניים היא דרך אטרקטיבית אפשר לשלוח את התרופות באופנת spatial-, temporal- והמינון שבשליטת עם ייחוד מוגדל ותופעות לוואי מינימליות. בין מגוון רחב של מערכות גירויים תגובה אקסוגניים (אור, השדה המגנטי, אולטרסאונד, קרינת מיקרוגל), פלטפורמות אור מופעלות הם אטרקטיביים, בשל אי-הפולשנות, פשטות והתאמה שלהם במרפאות. ¹ מחקר מקיף בעשור האחרון ספק מגוון של טכנולוגיות פלטפורמה, כגון זהב אחראי קרוב אינפרא אדום-אור (Au) nanocages מצופה פולימרים חכמים, ² חלקיקי צילום יציב, פולימריים (NPS) מצומדות עם סמים, ^{3 ו} nanovesicles porphysome העצמית התאסף. ⁴ עם זאת , טכנולוגיות אלה הן עדיין בשלבים פרה-הקליני של פיתוח, ודורשות הבנה ואופטימיזציה ברורה של הפרמטרים המעורבים בתהליך של ייזום המשךלגלגל את שחרור התרופה.

אחת השיטות הפשוטות ביותר ונגיש להכנת מערכת כזו היא לשלב Au צירופים עם ליפוזומים תרמית רגיש ^5,6, אשר שניהם זמינים באופן נרחב בשוק נחקרו בהרחבה בניסויים בבעלי חיים ואפילו קליניים. למרות המגבלה של הפעלת רקמות עמוק של Au צירופים באורך גל plasmonic שלהם, בהשוואה ננו האינפרה-אדום הקרוב המופעל Au (למשל, nanocages), מערכת זו עדיין טומן בחובו הבטחה גדולה כאשר נעשה שימוש בבעלי חיים קטנים או למסירה אקטואלי בבני אדם. ⁷ יש כמה מאמצים מוקדם שילוב Au צירופים עם ליפוזומים לשחרור אור מופעל. ^8-11 בעוד רובם מתמקדים החידוש של חומרים, בעיות נגישות ויכולת רחבת צורך לטפל. יתר על כן, דיווחים על מנגנוני שחרור באמצעות nanocarriers אלה עדיין מוגבלים.

בזאת, ייצור של צילום-תגובהליפוזומים, נטען בו זמנית עם תרופות הידרופיליות Au צירופים תוארה. Calcein משמש כמתחם מודל כדי להעריך את יעילות אנקפסולציה ופרופיל שחרורו של המערכת. בנוסף, במערכת זו, האור נספג על ידי Au צירופים מתפוגג אל microenvironment שמסביב בצורה חומה, וכתוצאה מכך לעלייה בטמפרטורה המקומית. Microbubbles האוויר נוצר במהלך חימום הליזר ולגרום הפרעה מכאנית של ליפוזומים (איור 1). המנגנון של cavitation microbubble אושר על ידי מדידות hydrophone.

Protocol

1. הכנה

1. 100 מ"ל נקי עגול צלוחיות התחתונה באמצעות Regia אקווה (1 חלק חומצה חנקתית מרוכזת (HNO ₃₎ ו -3 חלקים של חומצה הידרוכלורית מרוכזת (HCl)) ולשטוף את צלוחיות עם מים די. חיטוי הצלוחיות ולייבש אותם בתנור אוויר חם ב 100 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לעטוף ולאחסן את צלוחיות סטרילי עד השימוש.
2. לעקר את סט מיני מכבש יד שנערך באמצעות אתנול 70%.
3. הפעל את מאייד רוטרי להגדיר את הטמפרטורה של המים באמבטיה החמים מגדל קירור על 37 מעלות צלזיוס ו 4 ° C בהתאמה.
4. הכן 60 מ"מ calcein פתרון המניות על ידי המסת 374 מ"ג של calcein ב 10 מ"ל של 0.1 מ"מ בופר פוספט (PBS) (pH 7.4). התאם את ה- pH ל -7.4 באמצעות 1 M נתרן הידרוקסידי פתרון (NaOH).

2. סינתזה של ליפוזומים

1. הסר את הליפידים (1,2-Dipalmitoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1-Palmitoyl-2-הידרוקסי SN -glycero-3-phosphochoקו (MPPC) ו 1, 2-distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanol-amine- N - [carboxy (פוליאתילן גליקול) -2000] (אמוניום מלח) (DSPE-PEG2000)) מהמקפיא (-20 ° C) להפשיר אותם RT.
2. לשקול 15.9 מ"ג DPPC, 1.3 מ"ג MPPC, ו -2.8 מ"ג DSPE-PEG2000. ממיסים יחד אותם 2 מ"ל כלורופורם.
3. מעבירים את הפתרון כלורופורם אל הבקבוק תחתית עגולה סטרילית להתאדות ממס באמצעות המאייד רוטרי תחת לחץ מופחת, כדי ליצור שכבת השומנים דק ויבש.
4. מימה שכבת השומנים על 45 מעלות צלזיוס עם בתמיסה מימית 2 מ"ל במשך 30 דקות המכיל 1.95 מ"ל 60 מ"מ calcein מוכן בשלב 1.4 ו 50 μl Au צירופים (3.36 × 10 ¹⁶ חלקיקים / מ"ל).
5. טרום לחמם את בלוק חימום עד 45 מעלות צלזיוס. מקום מסנן הממברנה פוליקרבונט 200 ננומטר בין מוטות תמיכה המסננת ולהרכיב הסט המיני-המכבש. בדקו את הזליגה הפוטנציאלית עם מים די.
6. מלאו את אחד של מזרקים עם 1 מ"ל של תמיסת ליפוזום משלב 2.4 ו extruדה המדגם על ידי העברת הפתרון המזרק בקצה השני של מיני-מכבש להרכיב. חזור 11 פעמים.
7. הפעל את ליפוזומים המסונתז דרך טור desalting PD-10 כדי להסיר את צירופי Au חינם, שומני calcein באמצעות PBS כמו eluent על פי פרוטוקול של היצרן.
8. אחסן את דגימות צינורות סטרילית ב 4 ° C ולהשתמש ב 2 ימים.

3. שחרור Calcein מ ליפוזומים עם חימום

1. חשב את השומנים molarity של פתרון המניות על ידי הוספת את molarities של DPPC, MPPC, ו DSPE-PEG2000 בשלב 2.2. לדלל את הפתרון המניות ליפוזום ריכוז השומנים 5 מ"מ באמצעות חיץ 0.1 מ"מ PBS (pH 7.4). העברת דגימות צינור צנטריפוגות (2 מ"ל).
2. מניחים את הצינור בתוך אמבט מים חמים, ומעלים את הטמפרטורה באופן הדרגתי מ -25 עד 70 מעלות צלזיוס. העלו את הטמפרטורה בשיעור של 1 ° C / min כאן.
3. אסוף aliquots (10 μl) בנקודות טמפרטורה שונות (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 ו -70 מעלות צלזיוס).
4. הוסף 10 μl של 2% טריטון X-100 2 מ"ל aliquot של פתרון liposomal לעכל את ליפוזומים במשך 10 דקות ב RT, וכדי להשיג את השחרור המלא של calcein.
5. העבר 200 μl של פתרון liposomal לכל היטב microplate 96-היטב למדוד את עוצמת הקרינה של דגימות שנאספו באמצעות קורא microplate פלואורסצנטי. אורכי גל העירור והפליטה של ​​calcein הם 480 ו 515 ננומטר, בהתאמה.
6. אם ניקח את עוצמת הקרינה של דגימות מטופלים X-100 Triton 100 שחרור%, בחישוב אחוז של calcein שוחרר בכל נקודת זמן, באמצעות הנוסחה:
   
   Ft הוא עוצמת הקרינה של הפתרון בנקודת זמן נתונה. _אני F _ו- x F היא עוצמות קרינה התחלתי וסופי המנורמלת של הפתרון בהתאמה.

4. Calcein Reלחכור מן ליפוזומים עם ליזר פעם

1. העבר פתרון liposome 100 μl קובט קוורץ ולמקם אותו בפמוט קובט. השתמש פעם Nd: YAG ליזר עם משך פעימה של 6 NSEC באורך גל 532 ננומטר כמקור אור. השתמש בפרמטרי הליזר הבא - שיעור ההחזרה: 1 רץ; צפיפות האנרגיה לייזר: 1 mJ ^/ 2 ס"מ; Beam קוטר: 0.5 מ"מ.
2. מדריך את קרן הלייזר collimated דרך קובט כך האור עובר דרך הפתרון liposome ולאסוף aliquots לאחר פולסים שונים.
3. הוסף 10 μl של 2% טריטון X-100 2 מ"ל aliquot של פתרון liposomal לעכל את ליפוזומים במשך 10 דקות ב RT, וכדי להשיג את השחרור המלא של calcein.
4. בהתחשב calcein הוא רגיש לאור ויכול להיות מולבן במהלך ניסוי הליזר, מראש למדוד את האפקט הלבן של ליזר פעם על פתרון calcein לנרמל את הנתונים מהשקת liposome.
   1. באופן ספציפי, לחשוף פתרון calcein (60 מ"מ) כדי wi לייזר פעמותדירות ה 1 הרץ עבור מספרים שונים דופקים (0, 25, 50 ו -100). למדוד את עוצמת הקרינה של calcein עם אורכי גל עירור ופליטה של ​​ננומטר 480 ו 515 בהתאמה, לפני ואחרי החשיפה לייזר.
   2. לחשב את הסכום של הלבנה (עוצמת הקרינה של calcein לפני עוצמת ליזר חשיפה / קרינה של calcein לאחר מספר הדופק הספציפי). השתמש גורם זה לנרמל את הערכים שהתקבלו דגימות liposome על ידי הכפלת עוצמת הקרינה של ליפוזומים עם הגורם.
5. למדוד את עוצמת הקרינה של המדגם נאספו באמצעות קורא microplate הקרינה באורכי גל עירור ופליטה ב ננומטר 480 ו 515 בהתאמה.
6. אם ניקח את עוצמת הקרינה של דגימות מטופלים X-100 Triton 100 שחרור%, בחישוב אחוז של calcein שוחרר בכל מספר הדופק, באמצעות הנוסחה:
   
   Ft הוא עוצמת הקרינה של פתרון לעבר מספר דופק ניתן לאחר נורמליזציה. _אני F _ו- x F היא עוצמות קרינה התחלתי וסופי המנורמלת של הפתרון בהתאמה.

מדידת 5. דחפים לחצו

1. מקום 100 μl של מדגם בשקופית מיקרוסקופית להגדיר את מיקוד של ליזר על מדגם.
2. טובלים hydrophone מחט (בקוטר 1 מ"מ ו -450 רגישות NV / Pa) לתוך התמיסה.
   זהירות: hydrophone אסור להיות מואר על ידי אור לייזר כדי למנוע את הנזק.
3. מקרין את המדגם עם הליזר פעם עם מספרי דופק משתנה (0-100) ואנרגיה דופקת (20-160 μJ / דופק).
4. רשום את אותות הלחץ באמצעות אוסצילוסקופ דיגיטלי.

תוצאות

ליפוזומים אלה נערכו על בסיס טכניקה הידרציה סרט דק קונבנציונלי עם DPPC, MPPC ו DSPE-PEG2000 ב טוחנת יחס של 86: 10: 4 או 7.95: 0.65:. 1.39 מ"ג / מ"ל ¹² הגודל של Au צירופים היא קריטית כדי לקבוע את האור מרה יעילה לחום במהלך ניסוי עירור הליזר הבא. הקטן בגודל של Au NPS, הגבוה?...

Discussion

הידרציה סרט דקה היא השיטה מקובלת להכנה ליפוזומים. ממסים אורגניים (כלורופורם במקרה זה) שמשו ראשון לפרק את השומנים ולאחר מכן מוסר מאייד רוטרי ב 37 ° C כדי ליצור סרט דק שומנים על הבקבוק. הסרט השומנים זו hydrated עם בתמיסה מימית המכילה 60 מ"מ calcein ו -5 ננומטר Au צירופים. במהלך תהל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	850355P	Powder, Store at -20 °C
1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	855675P	Powder, Store at -20 °C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	880120P	Powder, Store at -20 °C
Gold Nanoparticles	Sigma Aldrich	752568-100mL	5 nm particles, stabilized at 0.1 mM PBS
Calcein	Sigma Aldrich	C0875-10g	60 mM, pH 7.4 (adjusted using NaOH)
phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493	0.1 mM, pH 7.4
Double distilled water	Millipore Milli-DI water purification system
Triton X100	Sigma, Life Sciences	X-100	To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation
Rotavapor	Buchi (Switzerland)	R 210	Used for Lipososme preparation
Heating bath	Buchi (Switzerland)	B 491	Used for Lipososme preparation
Vacuum Controller	Buchi (Switzerland)	V-850	Used for Lipososme preparation
Vacuum Pump	Buchi (Switzerland)	V-700	Used for Lipososme preparation
Recirculation bath with temperature controller	Polyscience		Used for Lipososme preparation
Mini-extruder assembly with heating block	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610000	Used for extrusion of liposomes
Syringes, 1,000 μl	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610017	Used for extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 200 nm	Whatmann	800281	Used for extrusion of liposomes
Filter Support	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610014	Used for extrusion of liposomes
PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 medium	GE Healthcare, Life sciences	17-0851-01	Used to purify the liposomes
Centrifuge	Sigma Laboratory Centrifuges	3K30	Used to concentrate the liposomal solution
Rotor	Sigma	19777-H	Used to concentrate the liposomal solution
Zetasizer	Nano ZS Malvern		Used for the determination of liposome size and zetapotential
UV-Visible Spectrophotometer	Shimadzu	UV-2450	Used to measure the absorbance of the samples
Fluorescent Spectrofluorometer	Molecular Devices	SpectraMax M5	Used to measure the fluorescence emission of the samples
Nd:YAG Laser	NewWave Research		532 nm; Maximum power: 17 mJ; Width: 406 nsec; Used for sample irradiation
HNR Hydrophone	ONDA	HNR-1000	1 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals
Digital Osciloscope	LECORY - Wave Runner 64Xi-A		Frequency: 600 MHz; Max sample rate: 10 Gs/sec (at two channel); Used to record the measured acoustic signals